KR0169080B1 - 탁산형 디테르펜의 제조방법 - Google Patents

탁산형 디테르펜의 제조방법 Download PDF

Info

Publication number
KR0169080B1
KR0169080B1 KR1019980704609A KR19980704609A KR0169080B1 KR 0169080 B1 KR0169080 B1 KR 0169080B1 KR 1019980704609 A KR1019980704609 A KR 1019980704609A KR 19980704609 A KR19980704609 A KR 19980704609A KR 0169080 B1 KR0169080 B1 KR 0169080B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
culture
cells
medium
added
taxane
Prior art date
Application number
KR1019980704609A
Other languages
English (en)
Inventor
유끼히토 유끼무네
야수히로 하라
요수께 히가시
나오토 오오니시
호마레 타바타
주조 수가
꼬우이찌 마쓰바라
Original Assignee
고다 시게노리
미쓰이 세끼유 가가꾸고오교오 가부시끼가이샤
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 고다 시게노리, 미쓰이 세끼유 가가꾸고오교오 가부시끼가이샤 filed Critical 고다 시게노리
Priority claimed from PCT/JP1994/001880 external-priority patent/WO1995014103A1/ja
Application granted granted Critical
Publication of KR0169080B1 publication Critical patent/KR0169080B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms

Landscapes

  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 탁산형 디테르펜을 생성하는 식물의 조직 또는 세포를 배양조를 사용하여 배양함에 있어서, 조내에 도입하는 산소함유 가스로서 0.03∼10%의 탄산가스를 함유한 가스를 사용하여 배양하는 것을 특징으로 하는 탁산형 디테르펜의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 의하면 암치료제로서 유용한 탁솔 등의 탁산형 디테르펜의 공업적 생산이 가능해진다.

Description

[발명의 명칭]
탁산형 디테르펜의 제조방법
[발명의 상세한 설명]
[기술분야]
본 발명은 난소암, 유암, 폐암 등의 치료약으로서 유용한 탁솔(taxol)을 함유한 탁산(taxane)형 디테르펜의 제조방법에 관한 것이다.
[배경기술]
난소암, 유암, 폐암등의 치료약으로서 유용한 탁솔(Taxol)은 주목과 주목속 식물인 태평양주목(Taxus brevifolia NUTT)로부터 단리동정된 탁산형 디테르펜이며, 활성과 관련한 복잡한 에스테르 그룹을 가지고 있다. 탁솔은 태평양 주목 식물중의 어느 부위에도 존재하며, 그 함량은 수피에서 가장 높다는 것이 보고 되어 있다. 현재 탁솔은 천연 또는 재배된 식물체로부터 채취되고 있으나, 주목속 식물은 지상 20㎝의 높이로 성장하는데 10년 이상이 걸리는 생육이 더딘 식물이며, 또 수피를 벗기면 나무가 말라버리므로 용이하게 대량의 탁솔을 얻기가 곤란하다. 만일 탁솔 또는 탁솔의 전구물질인 바카틴 Ⅲ(baccatin Ⅲ)등의 탁산형 디테르펜을 조직 배양을 이용하여 생산할 수가 있으면 수목을 벌채함이 없이 대량의 탁솔을 용이하게 얻을 수가 있으므로 유리하다.
지금까지 식물의 배양 세포를 이용한 탁솔 생산법에 대해서는 태평양 주목(Taxus brevifolia NUTT)배양세포에 의한 생산법이 미국에서 특허(미국특허 제5019504호)로 되어 있으나, 그 탁솔 생산량은 1∼3㎎/ℓ로 기재되어 있어서, 공업적 생산으로는 불충분하다. 또 세포배양에 의한 탁솔의 생산성은 불안정하며, 선발해서 1차적으로 생산성이 높은 세포가 얻어져도 계대배양하여 그 함량을 유지하기는 어렵다(E.R.M.Wickremesine et al., World Congress on Cell and Tissue Culture(1992)].
한편, 탁솔 생산법의 선행기술로서는 탁솔 생합성 전구체인 바카틴 Ⅲ로 부터의 반합성법이 Holton등의 미국특허 제5015744호 명세서에 개시되어 있다. 식물의 조직배양법을 사용하면 바카틴 Ⅲ등의 반합성원료의 생산도 가능하고, 상기 반합성법에 의한 탁솔 생산에도 이용할 수 있다.
[발명의 개시]
본 발명의 제1의 목적은 식물조직배양에 의한 탁산형 디테르펜의 간편한 제조방법을 제조하는 것에 있다.
본 발명의 제2의 목적은 탁산형 디테르펜 고생성 배약세포의 취득방법을 제공하는 것에 있다.
본원 제1의 발명은 탁산형 디테르펜을 생성하는 식물의 조직 또는 세포를 자스몬산류, 중금속을 함유한 화합물류, 중금속을 함유한 착이온류, 중금속이온, 아민류 및 항에틸렌제로 된 군에서 선택한 적어도 하나의 존재하에 배양하고, 얻어지는 배양물로부터 탁산형 디테르펜을 회수하는 것을 특징으로 하는 탁산형 디테르펜의 제조방법이다.
본원 제2의 발명은 탁산형 디테르펜을 생성하는 식물의 조직 또는 세포를 배양함에 있어서, 배양기내의 기상중의 산소농도를 대기중의 산소농도 미만의 조건하에 배양초기부터 제어하여 배양하거나 또는 조직 또는 세포와 접하는 유동성의 배지중의 용존산소 농도를 그 온도에서의 포화용존 산소농도 미만인 조건하에 배양초기부터 제어하여 배양하여 얻어지는 배양물로부터 탁산형 디테르펜을 회수하는 것을 특징으로 하는 탁산형 디테르펜의 제조방법이다.
본원 제3의 발명은 탁산형 디테르펜을 생성하는 식물의 세포를 비중의 차이에 의해 복수의 층으로 나누어 적어도 하나의 층에 포함된 세포를 배양하고, 이들 중으로부터 탁산형 디테르펜 고생성 배양 세포를 선택하는 것을 특징으로 하는 탁산형 디테르펜 고생성 배양세포의 취득방법이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 대상이 되는 탁산형 디테르펜으로서는 탁산 골격을 갖는 디테르펜이면 특히 제한이 없으며, 예를들어 탁솔(taxol), 7-에피탁솔, 바카틴Ⅲ(baccatin Ⅲ), 7-에피바카틴 Ⅲ, 세팔로마닌(cephalomannine), 7-에피세팔로마닌, 10-데아세틸바카틴, 10-데아세틸세팔로마닌, 10-데아세틸탁솔, 탁사기핀(taxagifine) 및 그 유연체, 탁산 1a 및 그 유연체, 크실로실 세팔로마닌, 크실로실 탁솔 등을 들 수 있다.
본 발명에 사용되는 탁산형 디테르펜을 생성하는 식물로서는, 예를들어 서양주목(Taxus baccata LINN), 주목(T. cuspidata SIEB. et ZUCC), 비자나무(T.Cuspidata SIEB. et ZUCC var. nana REHDER), 태평양주목(T. brevifolia NUTT), 캐나다주목(T. canadiensis MARSH), 중국주목(T. Chinensis), T. media등의 주목속 식물을 들 수 있다.
본원 제1의 발명에서 상기 식물의 배양은 식물의 조직 또는 세포를 자스몬산류, 중금속을 함유한 화합물류, 중금속을 함유한 착이온류, 중금속이온, 아민류 및 항에틸렌제로 된 군으로부터 선택한 적어도 하나의 존재하에 배양하는 이외에는 종래부터 알려져 있는 방법에 의해 행할 수가 있다.
본원 제1의 발명의 대상이 되는 자스몬산류로서는 일반식(Ⅰ):
[식중에서 R1a, R1b, R1c, R1d, R1e및 R1f는 각각 수소원자, 수산기, 탄소수 1∼6의 알킬기 또는 탄소수 1∼6의 알콕시기를 표시하고; R2, R3, R4, R5및 R6a는 각각 수소원자 또는 탄소수 1∼6의 알킬기를 표시하고; C1-C2-C3-C4-C5-C6로 된 측쇄는 1개 또는 2개 이상의 2중 결합을 포함하여도 좋으며; R6b는 수산기 또는 -O- 탄수화물 잔기를 표시하고; R7은 수산기, OM(여기에서 M은 알칼리금속원자, 알칼리 토류금속원자 또는 NH4를 표시한다). NHR8(여기에서 R8는 수소원자, 탄소수 1∼6의 아실기, 탄소수 1∼6의 알킬기 또는 아미노산잔기를 표시한다). OR9(여기에서 R9는 탄소수 1∼6의 알킬기 또는 탄수화물 잔기를 표시한다) 또는 탄소수 1∼6의 알킬기를 표시하고; n은 1∼7의 정수를 표시하고; 상기 5원환은 인접하는 환의 탄소원자간에 2중결합을 형성하여도 좋다]로 나타내는 화합물, 일반식[Ⅱ]
[식중에서 R1a, R1b, R1c, R1d, R1e및 R1f는 각각 수소원자, 수산기, 탄소수 1∼6의 알킬기 또는 탄소수 1∼6의 알콕시기를 표시하고; R2, R3, R4, R5및 R6는 각각 수소원자 또는 탄소수 1∼6의 알킬기를 표시하고; C1-C2-C3-C4-C5-C6로 된 측쇄는 1개 또는 2개 이상의 2중 결합을 포함하여도 좋으며; R7은 수산기 OM(여기에서 M은 알칼리금속원자, 알칼리토류금속원자 또는 NH4를 표시한다). NHR8(여기에서 R8는 수소원자, 탄소수 1∼6의 아실기, 탄소수 1∼6의 알킬기 또는 아미노산잔기를 표시한다). OR9(여기에서 R9는 탄소수 1∼6의 알킬기 또는 탄수화물 잔기를 표시한다) 또는 탄소수 1∼6의 알킬기를 표시하고; n은 1∼7의 정수를 표시하고; 상기 5원환은 인접하는 환의 탄소원자간에 2중결합을 형성하여도 좋다]로 나타내는 화합물, 일반식[Ⅲ]:
[식중에서 R1a, R1b, R1c, R1d, R1e및 R1f는 각각 수소원자, 수산기, 탄소수 1∼6의 알킬기 또는 탄소수 1∼6의 알콕시기를 표시하고; R2, R3, R4, R5및 R6는 각각 수소원자 또는 탄소수 1∼6의 알킬기를 표시하고; C1-C2-C3-C4-C5-C6로 된 측쇄는 1개 또는 2개 이상의 2중 결합을 포함하여도 좋으며; R7은 수산기, OM(여기에서 M은 알칼리금속원자, 알칼리토류금속원자 또는 NH4를 표시한다). NHR8(여기에서 R8는 수소원자, 탄소수 1∼6의 아실기, 탄소수 1∼6의 알킬기 또는 아미노산잔기를 표시한다). OR9(여기에서 R9는 탄소수 1∼6의 알킬기 또는 탄수화물 잔기를 표시한다) 또는 탄소수 1∼6의 알킬기를 표시하고; n은 1∼7의 정수를 표시하고; 상기 5원환은 인접하는 환의 탄소원자간에 2중결합을 형성하여도 좋다]로 나타내는 화합물을 들 수 있다.
상기 일반식(Ⅰ)로 나타낸 자스몬산류로서는 바람직하기로는 일반식(Ⅰ'):
[식중에서 R1'는 수소원자 또는 수산기를 표시하고; C1-C2-C3-C4-C5-C6로 된 측쇄는 C1과 C2, C2와 C3또는 C3와 C4간에서 2중 결합을 포함하여도 좋고; R6b는 수산기 또는 -O- 탄수화물잔기를 표시하고; R7'는 수산기, OM(여기에서 M은 알칼리금속원자, 알칼리토류금속원자 또는 NH4를 표시한다). NHR8'(여기에서 R8'는 수소원자, 탄소수 1∼4의 아실기, 탄소수 1∼4의 알킬기 또는 아미노산잔기를 표시한다) 또는 OR9'(여기에서 R9'는 탄소수 1∼4의 알킬기 또는 탄수화물 잔기를 표시한다)를 표시하고; n은 1∼7의 정수를 표시하고; 상기 5원환은 인접하는 환의 탄소원자간에 2중결합을 형성하여도 좋다]로 나타내는 화합물을 들 수 있으며, 상기 일반식(Ⅱ)로 나타낸 자스몬산류로서는 바람직하기로는 일반식(Ⅱ'):
[식중에서 R1'는 수소원자 또는 수산기를 표시하고; C1-C2-C3-C4-C5-C6로 된 측쇄는 C1과 C2, C2와 C3또는 C3와 C4간에서 2중 결합을 포함하여도 좋고; R7'는 수산기, OM(여기에서 M은 알칼리금속원자, 알칼리토류금속원자 또는 NH4를 표시한다). NHR8'(여기에서 R8'는 수소원자, 탄소수 1∼4의 아실기, 탄소수 1∼4의 알킬기 또는 아미노산잔기를 표시한다) 또는 OR9'(여기에서 R9'는 탄소수 1∼4의 알킬기 또는 탄수화물 잔기를 표시한다)를 표시하고; n은 1∼7의 정수를 표시하고; 상기 5원환은 인접하는 환의 탄소원자간에서 2중결합을 형성하여도 좋다]로 나타내는 화합물을 들 수 있으며, 상기 일반식(III)으로 나타낸 자스몬산류로서는 바람직하기로는 일반식(III'):
[식중에서 R1'는 수소원자 또는 수산기를 표시하고; C1-C2-C3-C4-C5-C6로 된 측쇄는 C1과 C2, C2와 C3또는 C3와 C4간에서 2중 결합을 포함하여도 좋고; R7'는 수산기, OM(여기에서 M은 알칼리금속원자, 알칼리토류금속원자 또는 NH4를 표시한다). NHR8'(여기에서 R8'는 수소원자, 탄소수 1∼4의 아실기, 탄소수 1∼4의 알킬기 또는 아미노산잔기를 표시한다) 또는 OR9'(여기에서 R9'는 탄소수 1∼4의 알킬기 또는 탄수화물 잔기를 표시한다)를 표시하고; n은 1∼7의 정수를 표시하고; 상기 5원환은 인접하는 환의 탄소원자간에 2중결합을 형성하여도 좋다]로 나타내는 화합물을 들 수 있다.
상기 일반식(Ⅰ),(Ⅱ) 및 (Ⅲ)에서 R1a, R1b, R1c, R1d, R1e,R1F,R2,R3,R4,R5,R6,R6A,R7,R8또는 R9으로 표시되는 탄소수 1~6의 알킬기로서는 예를들어 메틸기, 에틸기, n-프로필기, 이소프로필기, n-부틸기, 이소부틸기, sec-부틸기, t-부틸기, n-펜틸기, n-헥실기를 들 수 있다.
상기 일반식(I),(II) 및 (III)에서 R1a,R1b,R1c,R1d,R1e또는 R1f로 표시되는 탄소수 1∼6의 알콕시기로서는 예를들어 메톡시기, 에톡시기, n-프로폭시기, 이소프로폭시기, n-부톡시기, 이소부톡시기, sec-부톡시기, t-부톡시기, n-펜틸옥시기, n-헥실옥시기를 들 수 있다.
R7이 OM인 경우에는 M으로 표시되는 알칼리 금속원자 또는 알칼리토류금속원자로서는, 예를들어 나트륨, 칼륨, 칼슘을 들 수 있다.
R7이 NHR8인 경우에는 R8로 표시되는 탄소수 1∼6의 아실기는 직쇄, 분기쇄의 어느 것이라도 좋으며, 예를들어 포르밀기, 아세틸기, 프로피오닐, 부티릴기, 발레릴기, 헥사노일기, 아크릴로일기를 들 수 있다.
R7이 NHR8인 경우에 R8로 표시되는 아미노산기로서는 이소로이실기, 티로실기, 트리푸토필기를 들 수 있다.
R7이 OR9인 경우에는 R9으로 표시되는 탄수화물잔기, 및 상기 일반식(Ⅰ)에서 R6b가 -O-탄수화물 잔기인 경우에서의 탄수화물 잔기로서는 글루코피라노실기를 들 수 있다.
또 상기 일반식(Ⅰ),(Ⅱ) 및 (Ⅲ)로 나타낸 화합물에서는 5원환은 인접하는 환의탄소원자간에서 2중 결합을 형성하여도 좋다.
상기 일반식(Ⅰ)로 나타낸 화합물의 구체예로서는 이하에 나타내는 화합물을 들 수 있다.
상기 일반식(Ⅱ)로 나타낸 화합물의 구체예로서는 이하에 나타내는 화합물을 들 수 있다.
상기 일반식(Ⅲ)으로 나타낸 화합물의 구체예로서는 이하에 나타내는 화합물을 들 수 있다.
(화합물 I)
R1a,R1b,R1c,R1d,R1e,R1f,R1,R2,R3,R4,R5,R6: H
C3와 C4간에 2중결합형성
R7: -OH 또는 -OCH3
n : 1∼3
(화합물 J)
R1a,R1b,R1c,R1d,R1e,R1f,R2,R3,R4,R5,R6: H
R7: -OH
n : 1
상기 일반식(Ⅲ)으로 나타낸 화합물에서 R1a,R1b,R1c,R1d,R1e또는 R1f가 수산기인 화합물, 또는 5원환에서 인접하는 환원탄소원자간에 2중결합이 형성된 화합물의 구체예로서는 예를들어 이하에 나타내는 화합물을 들 수 있다.
상기 일반식(Ⅰ),(Ⅱ) 또는 (Ⅲ)으로 나타낸 화합물의 바람직한 것으로서는 R1a, R1b, R1c, R1d, R1e, R1f, R2, R3, R4, R5및 R6가 수소원자이며, R7이 수산기 또는 메톡시기이며, C1-C2-C3-C4-C5-C6로 된 측쇄는 2중결합을 포함하지 않거나, 또는 C1과C2, C2와 C3또는 C3와 C4간에 2중결합을 포함하는 화합물을 들 수 있다.
본 발명에 사용되는 상기 일반식(Ⅰ),(Ⅱ) 또는 (Ⅲ)으로 나타낸 자스몬산류에는 여러가지 입체이성체(시스트란스이성체, 광학이성체)가 존재하나 각각의 이성체를 단독으로 사용하여도 또는 혼합물의 형태로 사용하여도 좋다.
이상의 자스몬산류는 모두 탁산형 디테르펜의 생산성 향상에 효과를 가지나 그중에서도 상기 일반식(Ⅰ),(Ⅱ) 및 (Ⅲ)에서 R1a, R1b, R1c, R1d, R1e, R1f, R2, R3, R4, R5및 R6가 수소원자이며, R7이 수산기 또는 메톡시기이며, n이 1이며, C3와 C4간에 2중결합을 포함하고 있는 화합물인 튜베론산, 또는 튜베론산메틸, 쿠쿠르빈산 또는 쿠쿠르빈산메틸, 및 자스몬산 또는 자스몬산 메틸이 생산성 향상에 대한 효과가 큰 점에서 특히 바람직하다.
이들 자스몬산류는 합성에 의해 또는 식물로부터의 추출등에 의해 조제된다{H.Yamane et al. Agric. Biol. Chem., 44, 2857-2864(1980)}
한편, 자스몬산류는 생장촉진이나 조직의 성숙, 병해 저항성의 발현에 관한 여러가지 반응을 유기하는 식물 호르몬성 물질로서 여러가지 식물이 스스로 생산함이 요시하라 데루히꼬(吉原照彦) 저, 식물세포공학 제2권 제4호 523∼531면(1990년)에 기재되어 있다.
따라서 본 발명에 관한 자스몬산류는 배양계밖으로부터 첨가하는 이외에 사용하는 배양세포 또는 배양조직에서 스스로 생산시킬 수도 있다. 이 내재성 자스몬산류의 배양세포 또는 배양조직에 의한 생산을 촉진하는 방법으로서는 미생물의 배양물 또는 그 추출물, 열처리물 또는 식물추출물 등의 배지에 대한 첨가를 예시할 수가 있으며, 구체적으로는 M.J.Mueller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90(16), 7490-7494(1993)에 기재된 곰팡이 세포벽획분을 첨가하는 방법을 예시할 수가 있다. 또 사용하는 배양세포 또는 배양조직에 기계적으로 또는 자외선, 열등에 의해 부분적으로 상해를 주는 것에 의해서도 내재성 자스몬산의 생산량을 높일 수가 있으며, 구체적으로는 R.A.Gleeman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89(11), 4938-4941(1989)에 기재된 기계적으로 일부의 세포를 파괴하는 방법을 예시할 수가 있다.
자스몬산류는 물에 대한 난용성 때문에 통상 에타놀, 메타놀 등의 유기용매, 또는 계면 활성제 등에 용해한 후 배지에 첨가한다. 또 유리형의 자스몬산류는 그대로 사용하여도 좋고, 알칼리로 중화하여 염으로 해서 사용하여도 좋다.
자스몬산류 중에서 상기 식(Ⅰ) 또는 (Ⅲ)으로 나타낸 화합물은 5원환 카르보닐기의 α위치가 산,알칼리 열에 의해 에피머화를 일으키기 때문에 불안정한 시스형보다 안정한 트란스형이 되기 쉽다. 천연 또는 합성 자스몬산을 사용한 평형 실험에서는 트란스형이 90%, 시스형이 10%의 상태로 존재한다. 일반적으로 시스형 쪽이 활성이 강한 것으로 되어 있으나, 본 발명에 사용되는 자스몬산류는 상기 식(Ⅰ) 또는 (Ⅲ)으로 나타낸 모든 입체 이성체 화합물 및 그 혼합물을 포함한다.
자스몬산류는 배지에서의 농도를 0.01∼1000μM로 하는 것이 필요하며, 이중에서도 특히 자스몬산류의 농도를 0.1∼500μM의 범위로 조정하는 것이 본원 제1의 발명의 방법에서는 바람직하다.
식물세포 배양물에 자스몬 산류를 첨가하여 일부의 2차 대사산물이 유도되는 것은 독일에서 특허공고 DE 4122208 C1으로 되어 있으나, 탁산형 디테르펜 생성 식물의 조직배양에서 배지 첨가물로서 자스몬산류를 존재시켜서 조직배양을 행한 예는 보고되어 있지 않으며, 그 특허중에 개시되어 있는 2차 대사산물과는 생합성경로나 생합성 제어기구가 전혀 다른 탁산형 디테르펜의 생산량이 본원 제1의 발명의 방법에 의해 증대한다는 것은 예상밖의 일이었다.
또 본 발명에서 사용되는 상기식(Ⅰ),(Ⅱ) 또는 (Ⅲ)으로 나타낸 자스몬산류와 구조적으로 유사한 자스몬 또는 메틸자스몬이 탁솔의 생산유도에 효과가 있다는 것이 국제공개 WO 93/17121호 공보에 기재되어 있다. 그러나 이들 화합물은 상기 자스몬산류와는 달리 상기식(Ⅰ),(Ⅱ) 또는 (Ⅲ)에서 식:-(CH2)n-CO-R7으로 나타낸 카르복실기등을 가지고 있지 않아서 이들의 탁솔 유도활성은 낮은 것이었다(비교예 24참조).
본원 제1의 발명의 대상이 되는 중금속류로서는 동족(the copper group) 또는 철족(the iron group)에 속하는 중금속류이면 특히 한정되는 것은 아니나 동족에 속하는 금속류로서는 특히 은을 사용하는 것이 바람직하고, 또 철족에 속하는 금속류로서는 코발트를 사용하는 것이 바람직하다. 또한 은 또는 코발을 사용할 때는 이 중금속류를 함유한 화합물, 이 금속류를 함유한 착이온류, 또는 이 금속이온의 형태로 사용하는 것이 바람직하다. 또 이들 화합물 등은 각각 단독으로 사용하여도 좋고 조합하여 사용하여도 좋다.
은을 함유한 화합물로서는 예를들어 질산은 또는 황산은, 또는 불화은, 또는 염소산은 또는 과염소산은 또는 초산은, 또는 아황산은 또는 헥사플루오로인(V)산은 또는 테트라플루오로 붕산은 또는 디아민은(Ⅰ)황산염, 또는 디아미노은(Ⅰ)산칼륨등의 화합물류를 예시할 수 있다.
이들 중에서도 특히 질산은, 황산은 등을 바람직한 화합물로 예시할 수 있다.
은을 함유한 착이온류로서는 예를들어 [Ag(S2O3)2]3-, 또는 [Ag(S2O3)3]5-, 또는 [Ag(NH3)2]+, 또는 [Ag(CN)2]-, 또는 [Ag(CN)3]2-, 또는 [Ag(SCN)2]-, 또는 [Ag(SCN)4]3-등의 착이온류를 예시할 수가 있다. 이들 중에서도 특히 [Ag(S2O3)2]3-, [Ag(S2O3)2]5-등을 가장 적합한 착이온류로서 예시할 수 있다.
코발트를 함유한 화합물로서는 예를들어 염화코발트, 또는 질산코발트, 또는 황산코발트 또는 불화코발트, 또는 과염소산코발트, 또는 취화코발트 또는 옥화코발트 또는 세렌산코발트, 또는 티오시안산코발트 또는 초산코발트, 또는 황산암모늄코발트, 또는 황산코발트(Ⅱ)칼륨, 또는 헥사암민코발트(Ⅲ)염화물, 또는 펜타암민아쿠아코발트(Ⅲ)염화물, 또는 니트로펜타암민코발트(Ⅲ)염화물, 또는 디클로로테트라암민코발트(Ⅲ)염화물 반수화물 또는 디니트로테트라암민코발트(Ⅲ)염화물, 또는 카르보나트테트라암민코발트(Ⅲ)염화물 또는 테트라니트로디암민코발트(Ⅲ)산 암모늄, 또는 헥사니트로코발트(Ⅲ)산 나트륨, 또는 트리스(에틸렌디아민)코발트(Ⅲ) 염화물 3수화물, 또는 디클로로비스(에틸렌디아민)코발트(Ⅲ)염화물, 또는 트리스(옥사라트)코발트(Ⅲ)산칼륨3수화물, 또는 헥사시아노코발트(Ⅲ)산칼륨, 또는 (에틸렌 디아민 테트라아세타트)코발트(Ⅲ)산 칼륨2수화물, 또는 히드리드테트라카르보닐코발트(Ⅰ), 또는 디카르보닐(시클로펜타디에닐)코발트(Ⅰ), 또는 옥타카르보닐2코발트(O), 또는 헥사카르보닐(아세틸렌)2코발트(O), 비스(시클로펜타디에닐)코발트(Ⅰ), 또는 (시클로펜타디에닐)(1,5-시클로옥타디엔)코발트(Ⅰ)등의 화합물류를 예시할 수가 있다. 이들 중에서도 특히 염화코발트, 질산코발트, 황산코발트 등을 가장 적합한 화합물로서 예시할 수 있다.
코발트를 함유한 착이온류로서는 펜타암민아쿠아코발트이온, 또는 니트로펜타암민코발트이온, 또는 디클로로테트라암민코발트이온, 또는 디니트로테트라암민코발트이온 또는 카르보나트테트라암민코발트이온 또는 테트라니트로디암민코발트이온, 또는 헥사니트로코발트이온, 또는 트리스(에틸렌디아민)코발트이온, 또는 디클로로비스(에틸렌디아민)코발트이온, 또는 트리스(옥사라트)코발트이온, 또는 헥사시아노코발트이온, 또는 (에틸렌디아민테트라아세타트)코발트 이온등의 착이온류를 예시할 수가 있다.
상기 중금속류 중에서 은을 함유한 화합물류, 은을 함유한 착이온류, 또는 은이온은 배지에서의 농도가 10-8M∼10-1으로 하는 것이 바람직하며, 특히 10-7M∼10-2M의 범위로 조정하는 것이 더욱 바람직하다. 또 코발트를 함유한 화합물류, 코발트를 함유한 착이온류, 또는 코발트이온은 배지에서의 농도가 10-6∼10-1M으로 하는 것이 바람직하며, 특히 10-5∼10-2M의 범위로 하는 것이 더욱 바람직하다.
종래 탁산형 디테르펜을 생성하는 식물의 조직 배양에서 배지첨가물로서 은을 함유한 화합물류, 은을 함유한 착이온류, 또는 은이온을 존재시켜 조직 배양을 행한 예는 보고되어 있지 않다. 또 코발트를 함유한 화합물, 또는 코발트이온류는 주목속 식물의 조직배양용의 배지로서 일반적으로 사용되는 배지 예를들어 린스마이어스쿡(Linsmaier Skoog)의 배지 또는 무라시게스쿡(Murashige Skoog)의 배지, 또는 갬보르그(Gamborg)의 B-5 배지등에 배지성분의 하나로서 함유되어 있으나, 그 농도는 1×10-7M∼4×10-7M로 [최신 바이오테크놀로지 전서 편집위원회편, 목본식물의 증식과 육종, 농업도서, P265-268] 본 발명의 방법에 비해 극히 낮은 농도로 사용되고 있다. 한편 본원 제1의 발명과 같이 탁산형 디테르펜을 생성하는 식물의 조직배양에서 고농도의 코발트를 함유한 화합물, 또는 코발트 이온류를 존재시켜서 조직배양을 행한 예는 상술한 은화합물과 마찬가지로 보고되어 있지 않다. 더구나 이들 중금속류 존재하에서 배양함으로써 탁산형 디테르펜의 생성량이 증대한다는 것은 예상밖의 일이었다.
본원 제1의 발명에서 아민류라함은 아민 또는 그 염을 의미한다. 본원 제1의 발명의 대상이 되는 아민류로서는 모노아민류 또는 폴리아민류의 어느 것이나 이용가능하지만 특히 폴리아민류를 사용하는 것이 바람직하다.
또한 본원 제1의 발명의 대상이 되는 아민류로서는 알킬기의 일부의 수소가 수산기로 치환되어 있어도 좋은 모노, 디 또는 트리알킬아민, 예를들어 메틸아민, 에틸아민, 디메틸아민, 디에틸아민, 트리에틸아민, 디에타놀아민, 트리에타놀아민, 또는 그들의 염; 또는 폴리 메틸렌부가 이미노기로 중단되어 있어도 좋고, 아미노기의 H가 저급알킬기로 치환되어 있어도 좋은 폴리메틸렌디아민, 예를들어 푸트렉신, 카다베린, 스페르미딘, 스페르민, 에틸렌디아민, N,N-디에틸-1,3-프로판디아민, 트리에틸렌테트라민, 또는 그들의 염; 또는 환상알킬아민, 예를들어 시클로펜틸아민, 시클로헥실아민, 또는 그들의 염, 또는 메세나민, 피페라진 등의 환상아민 또는 그들의 염을 들 수 있다. 이들 아민류중에서 바람직한 것으로는 예를들어 푸트렉신[NH2(CH2)4NH2], 카다베린[NH2(CH2)5NH2], 스페르미딘[NH2(CH2)3NH(CH2)4NH2], 스페르민[NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NH2], 에틸렌 디아민[NH2(CH2)2NH2], N,N-디에틸-1,3-프로판디아민[(C2H5)2N(CH2)3NH2], 디에틸렌트리아민[NH2(CH2)2NH(CH2)2NH2]등의 폴리아민류 또는 그들의 염을 예시할 수가 있다.
상기 아민류는 배지에서의 농도가 10-8M∼10-1M으로 하는 것이 바람직하며, 이 중에서도 특히 10-7M∼10-2M의 범위로 조정하는 것이 더욱 바람직하다.
식물의 조직배양물에 아민류를 첨가하여 2차 대사산물이 유도되는 것을 나타낸 예로서는 매일초의 배양세포에 아민류를 첨가함으로써 인돌알칼로이드의 생성이 유도되는 것을 나타낸 일본국 특개평 4-262788호 공보를 예시할 수가 있다. 그러나 매일초와는 식물의 종이 다른 탁산형 디테르펜생성 식물의 조직배양에서 배지 첨가물로서 아민류를 존재시켜서 조직배양을 행한 예는 보고되어 있지 않으며, 더구나 그것에 의해 인돌 알칼로이드와는 생합성 경로가 전혀 다른 탁산형 디테르펜의 생성량이 증대한다는 것은 예상밖의 일이었다.
본원 제1의 발명의 대상이 되는 항에틸렌제로서는 배양물의 에틸렌 생합성 기구를 저해하든가, 및/또는 이 배양물내에 저류하든가 또는 이 배양물을 함유한 배양기내의 기상중 또는 배지중에 존재하는 에틸렌을 제거하는 물질이면 특히 한정되는 것은 아니다.
에틸렌 생합성기구를 저해하는 방법으로서는 예를 들어 S-아데노실메티오닌으로부터 1-아미노시클로프로판-1-카르복실산으로의 변환을 촉매하는 효소의 활성을 저해하든가, 또는 1-아미노시클로프로판-1-카르복실산으로부터 에틸렌으로의 변환을 촉매하는 효소의 활성을 저해하는 방법이 예시되며, 전자의 기능을 갖는 화합물로서는 예를들어 아미노옥시초산, 아세틸살리실산, 리조비톡신(Rhizobitoxine), 아미노에톡시비닐글리신, 메톡시비닐글리신, α-아미노이소락산, 2,4-디니트로페놀 등을 들 수가 있다. 또 상기에 예시한 화합물의 염, 에스테르, 아미노산 유도체, 탄수화물 유도체이어도 좋다.
염으로서는 예를들어 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘염, 에스테르로서는 예를들어 메틸, 에틸, 프로필, 부틸 에스테르, 아미노산 유도체로서는 예를들어 글리신, 메티오닌, 페닐알라닌유도체, 탄수화물유도체로서는 예를들어 글루코스, 말토스유도체 등을 들 수 있으나, 본 발명에 관한 물질의 염, 에스테르, 아미노산유도체, 탄수화물 유도체는 이들 화합물에 한정되는 것은 아니다.
또 후자의 기능을 갖는 화합물로서는 예를들어 몰식자산 및 그 화합물의 염, 에스테르, 아미노산유도체 및 탄수화물 유도체를 들 수가 있다[효도히로시(兵藤宏), 소화62년도 원예학회추계대회, 심포지엄, 강연요지, P.122, 구라이시스스무(倉石晋), 식물호르몬, 도꾜대학출판 P.Ⅲ].
여기에서 염으로서는 예를들어 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘염, 에스테르로서는 예를들어 메틸, 에틸, 프로필, 부틸에스테르, 아미노산유도체로서는 예를들어 글리신, 메티오닌, 페닐알라닌유도체, 탄수화물 유도체로서는 예를들어 글루코스, 말토스유도체 등을 들 수 있으나, 본 발명에 관한 물질의 염, 에스테르, 아미노산유도체, 탄수화물 유도체는 이들 화합물류에 한정되는 것은 아니다.
또한 배양물내에 저류하든가, 또는 이 배양물을 포함한 배양기내의 기상중 또는 배지중에 존재하는 에틸렌을 제거하는 물질로서 예를들어 1.5-시클로옥타디엔 및 이소티오시안산 및 이들 화합물의 염, 에스테르(예를들어 알릴이소티오시아네이트, 벤질이소티오시아네이트), 아미노산유도체 및 탄수화물유도체를 들 수가 있다[무나가다 메구무(宗像惠), 식물의 화학조절, 29(1), 89-93(1994)].
여기에서 염으로서는 예를들어 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘염, 에스테르로서는 예를들어 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 알릴에스테르, 아미노산유도체로서는 예를들어 글리신, 메티오닌, 페닐알라닌유도체, 탄수화물 유도체로서는 예를들어 글루코스, 말토스유도체 등을 들 수 있으나, 본 발명에 관한 물질의 염, 에스테르, 아미노산유도체, 탄수화물유도체는 이들 화합물류에 한정되는 것은 아니다.
항에틸렌제는 배지에서의 농도가 10-8M∼10-1M로 할 필요가 있으며, 이중에서도 특히 항에틸렌제의 농도를 10-7M∼10-2M의 범위로 조정하는 것이 바람직하다.
에틸렌은 식물 호르몬의 하나이며, 개체의 생장이나 형태형성 또는 노화등, 식물내에 발생되는 여러가지 생리형상에 관여함이 알려져 있다. 또 식물의 2차 대사 산물 생성능의 향상에 에틸렌을 이용한 예로서는 예를들어 Kim, Dong I1 et. al., Biotechnol. Bioeng., 38(4), 331-339(1991)에 기재된 보고를 예시할 수가 있다. 그러나 에틸렌의 제어를 2차 대사산물의 생산성 향상에 이용한 사례는 상기 기재의 보고에 대표되는 바와 같이, 그 어느것도 식물의 조직 배양물에 대한 에틸렌 공급에 의한 제어이며, 본 발명에 관한 방법과 같이 에틸렌 생성의 억제적인 제어를 2차 대사산물의 생산향상에 이용한 사례는 현재에 이르기까지 보고되어 있지 않다.
또한 항에틸렌제는 선도 보존제로서 화훼 또는 청과물 등에 일반적으로 사용되고 있으나, 이 항에틸렌제를 2차 대사산물의 생산향상의 목적으로 사용한 예는 보고되어 있지 않다.
이와같은 상황하에서 본 발명자들은 탁산형 디테르펜을 생성하는 식물의 조직 및 세포에서는 에틸렌이 탁산형 디테르펜의 생성능을 현저히 저해한다는 것을 알아내었다. 따라서 상기 발견을 발판으로 이 조직배양물을 항에틸렌제의 존재하에 배양한 결과, 항에틸렌제가 그 저해를 억제할 뿐 아니라 그 배양물에 유래하는 탁산형 디테르펜의 생산량을 비약적으로 향상시키는 효과를 갖는다는 것을 알아내었다. 탁산형 디테르펜을 생성하는 식물의 조직 배양물을 항에틸렌제의 존재하에 배양함으로써 탁산형 디테르펜의 생산을 유도한 예는 보고되어 있지 않으며, 더구나 본원 제1의 발명의 방법에 의해 그 2차대사산물의 생산성이 증대한다는 것은 에상밖의 일이었다.
본원 제1의 발명에 사용되는 배지로서는 종래로부터 알려져 있는 식물의 조직배양에 사용되는 배지, 예를들어 무라시게 스쿡(1962년)[Murashige Skoog]의 배지, 린스마이어 스쿡(1965년)[Linsmaier Skoog]의 배지, 우디플랜트 미디엄(1981년)[Woody Plant Medium], 갬보르그[Gamborg]의 B-5배지, 미쓰이(三井)의 M-9 배지등을 들 수 있다.
이들 배지에 식물 호르몬을 첨가하고, 다시 필요에 따라 탄소원, 무기성분, 비타민류, 아미노산 등을 첨가할 수도 있다.
탄소원으로서는 슈크로스, 말토스, 락토스 등의 2당류, 글루코스, 프락토스, 갈락토스 등의 단당류, 전분 또는 이들 당원의 2종류 이상을 적당한 비율로 혼합한 것을 사용한다.
무기성분으로서는 예를들어 인, 질소, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 황, 철, 망간, 아연, 붕소, 동, 몰리브덴, 염소, 나트륨, 옥소, 코발트 등을 들 수 있으며, 이들 성분은 예를들어 질산칼륨, 질산나트륨, 질산칼슘, 염화칼륨, 인산1수소칼륨, 인산2수소칼륨, 염화칼슘, 황산마그네슘, 황산나트륨, 황산제1철, 황산제2철, 황산망간, 황산아연, 붕산, 황산동, 몰리브덴산 나트륨, 3산화몰리브덴, 옥화 칼륨, 염화코발트 등의 화합물로서 첨가할 수 있다.
식물호르몬으로서는 예를들어 인돌초산(IAA), 나프탈렌초산(NAA), 2,4-디클로로페녹시초산(2,4-D)등의 오옥신(auxing)류, 카이네틴, 제아틴, 디히드로제아틴등의 사이토카이닌류가 사용된다.
비타민류로서는 예를들어 비오틴, 티아민(비타민 B1), 피리독신(비타민 B6), 판토텐산, 이노시톨, 니코틴산 등이 사용된다.
아미노산류로서는 예를들어 글리신, 페닐알라닌, 로이신, 글루타민, 시스테인 등을 첨가할 수 있다.
일반적으로 상기의 각 성분은 탄소원이 약 1∼약 30g/ℓ, 무기성분이 약 0.1μM∼약100mM, 식물호르몬류가 약 0.01∼약 10μM, 비타민류 및 아미노산류가 각각 약 0.1∼약 100mg/ℓ의 농도로 사용된다.
또한 본 발명에는 액체배지 및 한천이나 게란검등을 통상 0.1∼1% 함유하는 고형 배지의 어느것이나 사용할 수 있지만 통상은 액체 배지가 바람직하다.
본 발명의 조직배양에서는 상기 식물의 뿌리, 생장점, 잎, 줄기, 종자, 꽃가루, 꽃밥, 꽃받침등의 조직편 또는 세포, 또는 이들을 상기 배지 또는 다른 종래의 배지에 의해 조직 배양하여 얻어지는 배양세포를 사용할 수가 있다.
또 본 발명은 Agrobacterium tumefaciens 또는 Agrobacterium rhizogenes를 식물조직에 감염함으로써 얻어지는 종양세포 및/또는 모상근에도 적용할 수 있다.
이들 조직 또는 세포를 자스몬산류, 중금속을 함유한 화합물류, 중금속을 함유한 착이온류, 중금속이온, 아민류 및 항에틸렌제로 된 군으로부터 선택한 적어도 하나의 존재하에 배양하면 통상의 배양조건하에 조직 배양한 경우에 비해 탁산형 디테르펜 생산성이 높은 배양조직 또는 배양세포가 얻어진다.
중금속을 함유한 화합물류, 중금속을 함유한 착이온류, 중금속이온, 아민류 및 항에틸렌제로 된 군으로부터 선택한 적어도 하나와 상기 일반식(Ⅰ),(Ⅱ) 또는 (Ⅲ)으로 나타낸 자스몬산류를 병용하면 본원 제1의 발명의 효과를 높일 수가 있다.
이상과 같이 하여 얻어진 배양조직, 배양세포, 배지등의 배양물로부터 메타놀 등의 유기용매에 의한 추출에 의해 탁산형 디테르펜을 분리할 수가 있다. 또 배지중에 적당한 흡착제나 유기용매를 공존시켜서 배양중에 연속적으로 탁산형 디테르펜을 회수할 수도 있다.
본 발명의 조직 배양의 바람직한 일례로서는 다음과 같은 방법을 들 수 있다.
우선 주목속에 속하는 식물의 식물체, 예를들어 뿌리, 생장점, 잎, 줄기, 종자 등으로부터 채취한 식물편을 살균처리후, 게란검으로 굳힌 우디플랜트 미디엄상에 치상(置床)하고, 10∼35℃에서 14∼60일 정도 경과시켜서 조직편의 일부를 칼루스(callus)화시킨다. 이와같이 하여 얻어진 칼루스를 계대 배양하면 생육속도가 점차 높아져서 안정화된 칼루스가 얻어진다. 여기에서 안정화된 칼루스라 함은 배양중에 칼루스의 일부가 슈트나 뿌리로 분화하지 않고 칼루스의 상태를 유지하는 성질을 가지며 세포의 생육속도가 균질한 것을 말한다.
이 안정화된 칼루스를 증식에 적합한 액체배지, 예를들어 액체우디 플랜드 미디엄에 옮겨서 증식시킨다. 액체배지에서 더욱 생육속도가 높아진다. 본 발명에서는 이 안정화된 칼루스 또는 이 칼루스를 구성하는 세포는 자스몬산류, 중금속을 함유한 화합물류, 중금속을 함유한 착이온류, 중금속이온, 아민류 및 항에틸렌제로 된 군으로부터 선택한 적어도 하나의 존재하에 고체배지 또는 액체배지에서 배양한다. 또 이 안정된 칼루스 또는 이 칼루스를 구성하는 세포는 비중의 차이에 의해 복수의 층으로 나누고, 적어도 하나의 층에 포함되는 세포를 자스몬산류, 중금속을 함유한 화합물류, 중금속을 함유한 착이온류, 중금속이온, 아민류 및 항에틸렌제로 된 군으로부터 선택한 적어도 하나를 함유한 배지에서 배양하여도 좋다.
세포를 비중에 의해 분리하는 방법으로서는 일반적으로 원심분리용 매체를 사용하여 밀도구배를 작성하여 세포를 중층한 후, 원심분리하는 방법이 알려져 있다.
원심분리용매체로서는 Ficoll, Percoll(다같이 Pharmacia LKB Biotechnology사제), 자당(蔗糖), 염화세슘 등이 사용된다. 실시예 5등에서는 Ficoll을 사용하여 밀도구배를 작성하였으나, 세포에 상해를 주지 않은 것이면 특히 제한은 없다.
밀도구배를 형성하는 층의 수에 특히 제한은 없다. 각 층의 비중차는 특히 한정되는 것은 아니고, 또 각 비중차는 같아도 좋고, 달라도 좋다.
따라서 이 밀도구배의 정의에는 구배가 연속적으로 변화할 경우(밀도구배를 형성하는 층의 수가 무한대, 각층의 비중차가 0에 가까운 상태)를 포함한다.
이와같이 하여 밀도구배를 형성하여 세포를 중층, 원심분리함으로써 세포를 비중의 차이에 의해 복수의 층으로 나눌 수가 있다.
작성하는 층의 비중은 통상 1.00∼1.20g/㎖, 바람직하기로는 1.03∼1.11g/㎖의 범위이다. 배양의 대상이 되는 층으로서는 적어도 하나의 층을 선택하며, 또 모든 층을 선택하여 배양하여도 좋다.
복수의 층을 선택하여 배양할 경우에 이들 복수의 층은 각각 개별로 배양할 수도 있으나, 선택한 복수의 층 중의 2층 이상의 층을 혼합하여 배양할 수도 있다.
탁산형 디테르펜생성능이 높은 배양 세포는 통상 비중이 1.07이하의 층에 포함된 세포를 배양하여 얻어지나, 배양하는 세포나 배양의 조건에 따라 변동하는 경우가 있어서, 반드시 이 범위에 한정되는 것은 아니다. 또 단순히 비중의 차이에 의해 분획한 것만으로는 비중이 높은 층의 세포쪽이 탁산형 디테르펜 함량이 높아지는 경향을 관찰할 수 있다. 따라서 보다 확실하게 탁산형 디테르펜 고생성 배양세포를 취득하기 위해서는 분획된 모든 층의 세포를 일정기간 배양한 후, 각층의 세포에 함유된 탁산형 디테르펜 농도를 측정하고, 그들중에서부터 탁산형 디테르펜 고생성 세포를 포함한 층을 선택하는 것이 요망된다.
또 예를들어 1.07g/㎖와 같이 어떤 하나의 특정 비중의 원심분리매체를 작성하고, 상술한 방법으로 원심분리하여도 배양세포를 비중의 차이에 의해 복수의 층으로 나눌 수가 있다.
또한 본원 제1의 발명은 본원 제2의 발명인 배양기내의 기상중의 산소농도를 배양초기부터 대기중의 산소농도 미만의 조건하에 제어하여 배양하든가, 또는 조직 또는 세포와 접하는 유동성의 배지중의 용존산소 농도를 배양초기부터 그 온도에서의 포화용존 산소농도 미만인 조건하에 제어하여 배양하는 방법도 병용할 수가 있다.
여기에서 배양초기라 함은 배양개시시∼배양개시 7일째를 말하며, 배양기내의 기상중의 산소농도, 또는 조직 또는 세포와 접하는 유동성의 배지중의 용존산소농도의 제어는 배양개시시부터 행하는 것이 바람직하다. 또 제어의 기간으로서는 배양 전기간을 통하여 이 조건으로 제어하여도 좋고, 배양 전기간중의 일부기간만을 제어하여도 좋으며, 특히 한정하는 것은 아니지만 전배양기간중의 적어도 3일간 제어하는 것이 바람직하다.
배양기내의 기상중의 산소농도는 4∼15%로 제어하는 것이 필요하며, 특히 6∼12%로 제어하는 것이 바람직하다. 또 유동성의 배지중의 용존 산소농도는 그 온도에서의 포화용존 산소농도치의 1∼75%로 제어하는 것이 필요하며, 특히 10∼75%로 제어하는 것이 바람직하다.
본원 제1의 발명과 본원 제2의 발명 및 본원 제3의 발명과의 3가지 방법을 모두 조합하는 것도 가능하다.
본원 제1의 발명에서 자스몬산류는 배양세포의 대수증식기(exponential growth phase)∼ 정상기에 첨가하는 것이 효과적이며, 이중에서도 특히 대수증식기로부터 정상기로 이행하는 시기에 자스몬산류를 첨가하는 것이 바람직하다. 또 내재성 자스몬산류의 생산량을 높이기 위한 처리의 시기에 대해서도 이것과 마찬가지이다. 예를들어 21일마다 세포를 이식하고 있는 경우에는 7∼16일째가 자스몬산류의 첨가 또는 내재성 자스몬산류의 생산량을 높이기 위한 처리의 적기에 해당되고, 대수증식기, 예를들어 7∼14일째의 세포를 이식할 때는 이식직후가 적기에 해당된다. 또 자스몬산류의 첨가 및 내재성 자스몬산류의 생산량을 높이는 처리는 한꺼번에 행하여도 복수회로 나누어서 행하여도 좋고, 또 연속적으로 행하여도 좋다.
중금속을 함유한 화합물류, 중금속을 함유한 착이온류, 또는 중금속이온은 배양 개시시∼배양세포가 대수증식기로부터 정상기로 이행하는 시기까지에 첨가하는 것이 효과적이며, 특히 배양개시시에 첨가하는 것이 바람직하다. 또 이 화합물 또는 이온의 첨가는 한꺼번에 행하여도 좋고, 수회에 나누어서 행하여도 좋다.
아민류는 세포가 대수증식기에서 정상기로 이행하는 시기까지에 첨가함이 효과적이며, 특히 배양개시시에 첨가함이 바람직하다. 또 이 화합물은 한꺼번에 첨가하여도 좋고, 수회에 나누어 첨가해도 좋다.
항에틸렌제는 세포가 대수증식기로부터 정상기로 이행하는 시기까지에 첨가하는 것이 효과적이며, 특히 정상기로 이행한 직후에 첨가하는 것이 바람직하다. 또 이 화합물은 한꺼번에 첨가하여도 좋고, 수회에 나누어서 첨가하여도 좋다.
본원 제1의 발명에서의 조직 배양의 배양온도로서는 통상은 약 10∼약35℃, 특히 약 23∼28℃가 증식속도가 크므로 가장 적합하다. 또 배양기간으로서는 14∼42일간이 가장 적합하다.
본원 제1의 발명에서의 배양에서 액체배지를 사용한 경우에는 배양종료후에 배양세포를 데칸테이션 또는 여과등의 방법에 의해 배지로부터 분리하고, 배양세포 및/또는 배지로부터 목적으로 하는 탁산형 디테르펜을 유기용매에 의해 추출등의 방법으로 분리할 수가 있다.
이하, 본원 제2의 발명에 대해 설명한다.
본원 제2의 발명에서 식물의 배양은 식물의 조직 또는 세포를 배양하는데 있어서, 배양기내의 기상중의 산소농도를 대기중의 산소농도 미만의 조건하에 배양초기로부터 제어하여 배양하든가, 또는 조직 또는 세포와 접하는 유동성의 배지중의 용존 산소 농도를 그 온도에서의 포화용존 산소농도 미만의 조건하에 배양초기로부터 제어하여 배양하는 이외에는 종래로부터 알려져 있는 방법에 의해 행할 수가 있다.
종래, 탁산형 디테르펜생성 식물의 배양에서 조직 또는 세포를 배양하는 배양기에 공급하는 기상중의 산소농도, 또는 조직 또는 세포와 접하는 배지의 용존 산소농도를 대기중의 산소농도 미만의 조건하에 제어하여 배양하든가, 또는 포화용존 산소농도 미만의 조건하에 제어하여 배양한 예는 보고되어 있지 않으며, 더구나 그것에 의해 탁산형 디테르펜에 생성량이 증가한다는 것은 예상밖의 일이었다.
본원 제2의 발명에서 조직 또는 세포를 배양하는 배양기내의 기상중의 산소농도는 4∼15%로 제어하는 것이 필요하며, 특히 6∼12%로 제어하는 것이 바람직하다. 또 조직 또는 세포와 접하는 유동성의 배지 중의 용존 산소농도는 그 온도에서의 포화용존 산소농도치의 1∼75%로 제어하는 것이 필요하며, 특히 10∼75%로 제어하는 것이 바람직하다.
본원 제2의 발명에 사용되는 배지로서는 종래로부터 알려져 있는 식물의 조직 배양에 사용되는 배지, 예를들어 무라시게 스쿡(1962년)[Murashige Skoog]의 배지, 린스마이어 스쿡(1965년)[Linsmaier Skoog]의 배지, 우디 플랜트 미디엄(1981년)[Woody Plant Medium], 갬보르그[Gamborg]의 B-5배지, 미쓰이의 M-9배지등을 들 수 있다.
이들 배지에 식물 호르몬을 첨가하고, 다시 필요에 따라 탄소원, 무기성분, 비타민류, 아미노산 등을 첨가할 수도 있다.
탄소원으로서는 슈크로스, 말토스, 락토스 등의 2당류, 글루코스, 프락토스, 갈락토스 등의 단당류, 전분 또는 이들 당원의 2종 이상을 적당한 비율로 혼합한 것을 사용할 수 있다.
무기성분으로서는 예를들어 인, 질소, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 황, 철, 망간, 아연, 붕소, 동, 몰리브덴, 염소, 나트륨, 옥소, 코발트 등을 들 수 있으며, 이들 성분은 예를들어 질산칼륨, 질산나트륨, 질산칼슘, 염화칼륨, 인산수소2칼륨, 인산2수소칼륨, 염화칼슘, 황산마그네슘, 황산나트륨, 황산제1철, 황산제2철, 황산망간, 황산아연, 붕산, 황산동, 몰리브덴산 나트륨, 3산화몰리브덴, 옥화칼륨, 염화코발트등의 화합물로서 첨가할 수 있다.
식물호르몬으로서는 예를들어 인돌초산(IAA), 나프탈렌초산(NAA), 2,4-디클로페녹시초산(2,4-D)등의 옥신류, 카이네틴, 제아틴, 디히드로 제아틴 등의 사이토 카이닌류가 사용된다.
비타민류로서는 예를들어 비오틴, 티아민(비타민 B1), 피리독신(비타민 B6), 판토텐산, 이노시톨, 니코틴산 등이 사용된다.
아미노산류로서는 에를들어 글리신, 페닐알라닌, 로이신, 글루타민, 시스테인 등을 첨가할 수 있다.
일반적으로 상기의 각 성분은 탄소원이 약 1∼약 30g/ℓ, 무기성분이 약 0.1㎛∼약100mM, 식물호르몬류가 약 0.01∼약10μM, 비타민류 및 아미노산류가 각각 0.1∼약100㎎/ℓ의 농도로 사용된다.
또한 본원 제2의 발명에는 액체배지 및 한천이나 게란검 등을 통상 0.1∼1% 함유하는 고형배지의 어느 것이나 사용할 수 있다.
본원 제2의 발명의 조직 배양에서는 상기 식물의 뿌리, 생장점, 잎, 줄기, 종자, 꽃가루, 꽃밥, 꽃받침 등의 조직편 또는 세포, 또는 이들을 상기 배지 또는 다른 종래의 배지에 의해 조직 배양하여 얻어지는 배양세포를 사용할 수가 있다.
또 본원 제2의 발명은 Agrobacterium tumefaciens 또는 Agrobacterium rhizogenes에 의한 감염에 의해 얻어지는 종양 세포 및/또는 모상근에 적용할 수도 있다.
이들의 조직 또는 세포를 배양함에 있어서, 배양기내의 기상중의 산소농도를 대기중의 산소농도 미만의 조건하에서 배양초기로부터 제어하여 배양하거나 또는 조직 또는 세포와 접하는 유동성의 배지중의 용존산소 농도를 그 온도에서의 포화용존 산소농도 미만인 조건하에 배양초기로부터 제어하여 배양하면 통상의 배양조건하에서 조직 배양한 경우에 비해 탁산형 디테르펜 생산성이 높은 배양조직 또는 배양세포가 얻어진다.
본원 제2의 발명에서 배양초기라 함은 배양개시시∼배양개시 7일째를 말하며, 배양기내의 기상중의 산소농도, 또는 조직 또는 세포와 접하는 유동성의 배지중의 용존 산소농도의 제어는 배양개시시부터 행하는 것이 바람직하다.
또 제어의 기간으로서는 배양 전기간을 통하여 이 조건으로 제어하여도 좋고, 배양 전기간중의 일부기간만을 제어하여도 좋으며, 특히 한정하는 것은 아니지만 전배양기간중의 적어도 3일간 제어하는 것이 바람직하다.
본원 제2의 발명의 제조방법의 각종 탁산형 디테르펜의 생산촉진 물질의 존재하에 배양하는 방법과 병용함으로써 탁산형 디테르펜의 생산성을 더욱 높일 수가 있다.
탁산형 디테르펜의 생산촉진물질로서는 예를들어 본원 제1의 발명에 사용하는 상기 일반식(Ⅰ),(Ⅱ) 또는 (Ⅲ)으로 나타낸 자스몬산류, 중금속을 함유한 화합물류, 중금속을 함유한 착이온류, 중금속이온, 아민류, 항에틸렌제를 들 수 있다.
또 본원 제2의 발명은 후에 상술하는 본원 제3의 발명인 세포를 비중의 차이에 따라 복수의 층으로 나누어 적어도 하나의 층에 포함된 세포를 배양하는 방법과 병용할 수도 있다.
또 본원 제2의 발명의 제조방법은 상술한 자스몬산류 등의 존재하에 배양하는 본원 제1의 발명의 방법과 세포를 배중의 차이에 의해 복수의 층으로 나누어 적어도 하나의 층에 포함된 세포를 배양하는 본원 제3의 발명의 방법의 양자를 병용할 수도 있다.
이상과 같이 하여 얻어진 배양조직, 배양세포, 배지등의 배양물로부터 메타놀등의 유기용매에 의한 추출에 의해 탁산형 디테르펜을 분리할 수가 있다.
본원 제2의 발명의 조직배양의 바람직한 일례로서는 다음과 같은 방법을 들 수 있다.
우선 주목속에 속하는 식물의 식물체, 예를들어 뿌리, 생장점, 잎, 줄기, 종자 등으로부터 채취한 식물편을 살균처리후, 게란검으로 굳힌 우디플랜트 미디엄상에 치상(置床)하고, 10∼35℃에서 14∼60일 정도 경과시켜서 조직편의 일부를 칼루스(callus)화시킨다. 이와같이 하여 얻어진 칼루스를 계대 배양하면 생육속도가 점차 높아져서 안정화된 칼루스가 얻어진다. 여기에서 안정화된 칼루스라 함은 배양중에 칼루스의 일부가 슈트나 뿌리로 분화하지 않고 칼루스의 상태를 유지하는 성질을 가지며 세포의 생육속도가 균질한 것을 말한다.
이 안정화된 칼루스를 증식에 적합한 액체배지, 예를들어 액체우디 플랜드 미디엄에 옮겨서 증식시킨다. 액체배지에서 더욱 생육속도가 높아진다. 본 발명에서는 이 안정화된 칼루스 또는 이 칼루스를 구성하는 세포는 배양기내의 기상중의 산소농도가 대기중의 산소농도 미만으로 배양초기부터 제어되어 있든가, 또는 조직 및/또는 세포와 접하는 유동성의 배지중의 용존 산소농도가 그 온도에서의 포화용존 산소농도 미만으로 배양초기부터 제어된 배양조건하에서 배양한다.
조직 또는 세포는 산소를 소비(호흡)함으로써 스스로의 개체유지 또는 증식에 필요한 에너지를 획득한다.
일반적으로 조직 또는 세포를 배양하면 배양열수의 경과에 따라 세포량이 증가하고, 이와 동시에 산소의 소비량도 증가함이 알려져 있다.
따라서 계외로부터 강제적으로 통기 가스를 공급하지 않는 한, 조직 또는 세포를 포함한 플라스크 등의 배양기내의 기상중의 산소농도, 또는 조직 또는 세포와 접하는 배지중의 용존산소농도도 배양일수의 경과에 따라 자연히 대기중의 산소농도 미만, 또는 그 온도에서의 포화용존산소농도 미만의 값으로 저하하게 된다.
본 발명은 조직 또는 세포를 포함한 배양기내의 기상중의 산소농도 또는 배지중의 용존 산소농도를 대기중의 산소농도 미만이거나 또는 그 온도에서의 포화용존 산소농도 미만의 조건하에 적극적으로 제어한 조건하에 배양하는 점에서 상술한 사항과는 내용을 달리 한다.
특히 본발명의 효과를 높이는 방법으로서 배양기내의 기상중의 산소농도 또는 유동성의 배지중의 용존산소농도를 조직 또는 세포를 이 배양기내로 이식하기 전에 미리 대기중의 산소농도 미만이거나 또 그 온도에서의 포화용존 산소농도 미만으로 제어하는 방법이 예시된다.
또 제어의 기간으로서는 상술한 바와 같이 특히 제한은 없으나 전배양기간중의 적어도 3일간 제어하는 것이 바람직하다.
또한 제어의 방법으로서는 조직 또는 세포를 포함한 배양기내의 기상중의 산소농도 또는 조직 또는 세포와 접하는 유동성의 배지중의 용존산소농도를 대기중의 산소농도 미만이거나 또는 그 온도에서의 포화용존 산소농도 미만으로 제어가능한 배양조건하이면 특히 제한은 없으며, 예를들어 공기에 질소등을 혼합하여 산소농도를 저하시킴으로써 산소농도를 조절한 기체를 배양기내의 기상중 및/또는 배지중에 직접 통기하든가, 또는 통기조 등의 배양기 밖에서 배지중으로 직접 통기한 후, 이 배지를 배양기내에 관류(灌流)하든가, 또는 이 배양기내에 공급하는 공기등의 기체를 공급속도를 제한하여 기상중 및/또는 배지중으로 직접 통기하든가, 또는 통기조등의 배양기 밖에서 이 기체를 공급속도를 제한하여 배지중으로 직접 통기한 후, 이 배지를 배양기내에 관류하든가, 또는 배양기를 저산소 분위기에 놓고 배양하든가, 또는 산소흡착제 존재하에 배양하는 방법 등을 들 수 있다.
본 발명의 조직배양의 배양온도로서는 통상은 약 10∼약35℃, 특히 약 23∼약28℃가 증식속도가 크므로 가장 접합하다. 또 배양기간으로서는 14∼42일간이 가장 적합하다.
본 발명의 배양에서 액체배양을 사용할 경우에는 배양 종료후에 배양세포를 데칸테이션 또는 여과 등의 방법에 의해 배지로부터 분리하여 배양세포 및/또는 배지로 부터 목적으로 하는 탁산형 디테르펜을 유기용매에 의한 추출등의 방법에 의해 분리할 수가 있다. 또 흡착제나 적당한 유기용매를 배양기내에 공존시켜 배양중에 연속적으로 목적 화합물을 회수할 수도 있다.
이하 본원 제3의 발명에 대해 설명한다.
본원 제3의 발명에서 배양후, 탁산형 디테르펜생성능이 높아지는 배양세포를 포함한 층으로서는 예를들면 비중 1.07이하의 층을 들 수 있다.
세포를 비중에 의해 분리하는 방법으로서는 일반적으로 원심분리용 매체를 사용하여 밀도구배를 작성하여 세포를 중층한 후, 원심분리하는 방법이 알려져 있다.
원심분리용 매체로서는 Ficoll, Percoll(다같이 Pharmacia LKB Biotechnology사제), 자당(蔗糖), 염화세슘 등이 사용된다. 실시예등에서는 Ficoll을 사용하여 밀도구배를 작성하였으나, 세포에 상해를 주지 않은 것이면 특히 제한은 없다. Ficoll은 세포과립등의 분리(Hess, R. et al., Nature 208(1965) 856-858)나 동물세포의 분리(Walder, I.A. et al., Proc. Soc. exptl. Biol. Med., 112 (1963), 494-496)등에 사용되고 있다.
밀도구배를 형성하는 층의 수에 특히 제한은 없다.
실시예에서는 비중 1.03, 1.05, 1.07, 1.09, 1.11(g/㎖)와 같이 각 층의 비중차가 0.02의 밀도구배를 작성하고 있으나, 비중차는 이 값에 한정되는 것은 아니고, 또 각 비중차는 같아도 좋고, 달라도 좋다.
따라서 이 밀도구배의 정의에는 구배가 연속적으로 변화할 경우(밀도구배를 형성하는 층의 수가 무한대, 각층의 비중차가 0에 가까운 상태)를 포함한다.
이와같이 하여 밀도구배를 형성하여 세포를 중층, 원심분리함으로써 세포를 비중의 차이에 의해 복수의 층으로 나눌 수가 있다.
작성하는 층의 비중은 통상 1.00∼1.20(g/㎖), 바람직하기로는 1.03∼1.11(g/㎖)의 범위이다. 배양의 대상이 되는 층으로서는 적어도 하나의 층을 선택하며, 또 모든 층을 선택하여 배양하여도 좋다.
복수의 층을 선택하여 배양할 경우에 이들 복수의 층은 각각 개별로 배양할 수도 있으나, 선택한 복수의 층 중의 2층 이상의 층을 혼합하여 배양할 수도 있다.
탁산형 디테르펜생성능이 높은 배양 세포는 통상비중이 1.07이하의 층에 포함된 세포를 배양하여 얻어지나, 배양하는 세포나 배양의 조건에 따라 변동하는 경우가 있어서, 반드시 이 범위에 한정되는 것은 아니다. 또 단순히 비중의 차이에 의해 분획한 것만으로는 비중이 높은 층의 세포쪽이 탁산형 디테르펜 함량이 높아지는 경향을 관찰할 수 있다. 따라서 보다 확실하게 탁산형 디테르펜 고생성 배양세포를 취득하기 위해서는 분획된 모든 층의 세포를 일정기간 배양한 후, 각층의 세포에 함유된 탁산형 디테르펜 농도를 측정하고, 그들중으로부터 탁산형 디테르펜 고생성 세포를 포함한 층을 선택하는 것이 요망된다.
종래, 탁산형 디테르펜생성 식물의 배양세포를 세포의 비중에 의해서 분획후, 배양한 예는 보고되어 있지 않으며, 비중의 차이에 의해 탁산형 디테르펜생성능이 각각 다른 세포의 층으로 나눌수가 있고, 더구나 분획한 시점에서 탁산형 디테르펜 함량이 그다지 높지 않은 비중 1.07이하에 포함되는 세포를 배양함으로써 탁산형 디테르펜고생성 세포가 취득된다는 것은 예상밖의 일이였다.
또 본 발명에서는 예를들어 1.07g/㎖와 같이 어떤 하나의 특정 비중의 원심분리용 매체를 작성하여 상술한 방법으로 원심분리하여도 배양세포를 비중차이에 의해 복수의 층으로 나눌수가 있다.
본 발명에서 사용되는 배지는 보통의 배지성분을 함유한다. 이와같은 성분으로서 일반적으로 무기성분 및 탄소원이 사용되고 이것에 식물 호르몬류, 비타민류를 첨가하고, 또한 필요에 따라 아미노산류를 첨가할 수가 있다. 탄소원으로서는 슈크로스, 말로스, 락토스 등의 2당류, 글루코스, 프락토스, 갈락토스 등의 단당류, 전분 또는 이들 당원의 2종 이상을 적당한 비율로 혼합한 것을 사용할 수 있다.
무기성분으로서는 예를들어 인, 질소, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 황, 철, 망간, 아연, 붕소, 동, 몰리브덴, 염소, 나트륨, 옥소, 코발트 등을 들 수 있으며, 이들 성분은 예를들어 질산칼륨, 잘산나트륨, 잘산칼슘, 염화칼륨, 인산1수소칼륨, 인산2수소칼륨, 염화칼슘, 황산마그네슘, 황산나트륨, 황산제1철, 황산제2철, 황산망간, 황산아연, 붕산, 황산농, 몰리브덴산 나트륨, 3산화몰리브덴, 옥화칼륨, 염화코발트 등의 화합물로서 첨가할 수 있다.
식물호르몬으로서는 예를들어 인돌초산(IAA), 나프탈렌초산(NAA), 2,4-디클로로페녹시초산(2,4-D)등의 옥신(auxing)류, 카이네틴, 제아틴, 디히드로제아틴등의 사이토카이닌류가 사용된다.
비타민류로서는 예를들어 비오틴, 티아민(비타민 B1), 피리독신(비타민 B6), 판토텐산, 이노시톨, 니코틴산 등이 사용된다.
아미노산류로서는 예를들어 글리신, 페닐알라닌, 로이신, 글루타민, 시스테인 등을 첨가할 수 있다.
일반적으로 상기의 각 성분은 무기성분이 약 0.1μM∼약 100mM, 탄소원이 약 1∼약 30g/ℓ, 식물호르몬류가 약 0.01∼약 10μM, 비타민류 및 아미노산류가 각각 약 0.1∼약 100㎎/ℓ의 농도로 사용된다.
본 발명의 조직배양에 사용되는 배지로서는 종래로부터 알려지고 있는 식물의 조직 배양에 사용되는 배지, 예를들어 무라시게 스쿡(1962년)[Murashige Skoog]의 배지, 린스마이어 스쿡(1965년)[Linsmaier Skoog]의 배지, 우디 플랜트 미디엄(1981년)[Woody Plant Medium], 갬보르그[Gamborg]의 B-5배지, 미쓰이의 M-9배지등에 상기의 식물호르몬을 첨가하고, 다시 필요에 따라 상기한 탄소원, 비타민류, 아미노산 등을 첨가하여 조제되는 배지를 예시할 수 있다.
본 발명에는 액체배지 및 한천이나 게란검 등을 통상 0.1∼1% 함유하는 고형배지의 어느 것이나 사용할 수 있으나, 통상은 액체배지가 바람직하다.
본 발명의 조직배양에서는 상기 식물의 뿌리, 생장점, 잎, 줄기, 종자, 꽃가루, 꽃밥, 꽃받침 등의 조직편 또는 세포, 또는 이들을 상기 배지 또는 다른 종래의 배지에 의해 조직 배양하여 얻어지는 배양세포를 사용할 수가 있다.
이들 세포를 본 발명에 의해 특정한 비중범위로 분획한 후에 배양하면 분획을 하지 않았던 대조구에 비해 탁산형 디테르펜 고생성 배양세포가 얻어진다. 이 배양세포로부터 메타놀등의 유기용매에 의한 추출에 의해 탁산형 디테르펜을 분리할 수가 있다.
본 발명의 조직배양의 바람직한 일례로서는 다음과 같은 방법을 들 수 있다.
우선 주목속에 속하는 식물의 식물체, 예를들어 뿌리, 생장점, 잎, 줄기, 종자 등으로부터 채취되는 식물편을 살균처리후, 게란검으로 굳힌 우디플랜트 미디엄상에 치상(置床)하고, 10∼35℃에서 14∼60일 정도 경과시켜서 조직편의 일부를 칼루스(callus)화시킨다. 이와같이 하여 얻어진 칼루스를 계대 배양하면 생육속도가 점차 높아져서 안정화된 칼루스가 얻어진다. 여기에서 안정화된 칼루스라 함은 배양중에 칼루스의 일부가 슈트나 뿌리로 분화하지 않고 칼루스의 상태를 유지하는 성질을 가지며 세포의 생육속도가 균질한 것을 말한다.
이 안정화된 칼루스를 증식에 적합한 액체배지, 예를들어 액체우디 플랜드 미디엄에 옮겨서 증식시킨다. 액체배지에서 더욱 생육속도가 높아진다.
본 발명의 조직배양의 배양온도로서는 통상은 약 10∼약 35℃, 특히 약 23∼28℃가 증식속도가 크므로 가장 적합하다. 또 배양기간으로서는 14∼42일간이 가장 적합하다.
본 발명의 배양에서 액체배지를 사용한 경우에는 배양종료후에 배양세포를 데칸테이션 또는 여과 등의 방법에 의해 배지로부터 분리하고, 이것으로부터 목적으로 하는 탁산형 디테르펜을 유기용매에 의한 추출등의 방법에 의해 분리할 수가 있다.
본원 제1의 발명 및 본원 제2의 발명에 의하면 탁산형 디테르펜을 대량으로, 그리고 간편하게 얻을 수가 있다.
본원 제3의 발명에 의하면 탁산형 디테르펜 고생성 배양세포를 간이한 조작에 의해 취득할 수가 있다.
본원 제1∼제3의 발명을 공업적으로 실시함에 있어서는 이하에 나타내는 본원 제4∼제7의 발명을 단독 또는 그 조합의 형태로 채용함으로써 더욱 효과를 높일 수 있다.
즉 탁산형 디테르펜을 생성하는 식물의 조직 또는 세포를 배양하는데 있어 배양액에 산소함유 가스를 공급할 필요가 있다. 통상은 이 목적으로 공기를 사용하나, 본 발명자들은 예의 검토한 결과, 탁산형 디테르펜을 생성하는 식물의 조직 또는 세포를 배양조를 사용하여 배양할 때 조내에 도입하는 산소함유가스로서 0.03∼10%, 바람직하기로는 0.1∼5%의 탄산가스를 함유한 가스를 사용하면 탁산형 디테르펜의 생성이 효율적으로 이루어진다는 것을 알아내어, 본원 제4의 발명의 발명을 완성하였다.
또 탁산형 디테르펜을 생성하는 식물의 조직 또는 세포를 배양하는데 있어, 다음 공정의 탁산형 디테르펜의 생산에 대해 활성화된 조직 또는 세포를 얻기 위하여 산화제 또는 수용성의 함산소유기화합물을 첨가한 배지를 사용하여 행하는 1단째 배양과, 탁산형 디테르펜의 생산을 촉진하는 조건하에 행하는 2단째 배양의 2개의 공정으로 되는 2단 배양을 행함으로써 배양물중의 탁산형 디테르펜 생산성이 현저하게 향상함과 동시에 계대 배양에 수반되는 탁산형 디테르펜 생산성의 변동이 억제되는 것을 알아내어, 본원 제5의 발명의 발명을 완성하였다. 여기에서 산화제로서는 퍼옥소 2황산 칼륨 등의 퍼옥소 2 황산염, 과산화수소 등을 또 수용성의 함산소유기화합물로서는 디메틸 포름아미드, 디메틸 설폭시드, 에틸렌 글리콜 등을 예시할 수 있다. 상기 첨가물의 배지에서의 총 농도는 첨가직후에 10-6M∼10-1M으로 하는 것이 바람직하며, 특히 10-5M∼10-2M의 범위로 조정하는 것이 더욱 바람직하다.
또 탁산형 디테르펜을 생성하는 식물의 조직 또는 세포를 배양하는데 있어, 당 농도가 2∼50g/ℓ, 바람직하기로는 10∼30g/ℓ 및/또는 질산이온농도가 2∼50mmol/ℓ, 바람직하기로는 10∼30mmol/ℓ인 배지에 조직 또는 세포를 이식한 후, 이 배지의 초기 용량에 대해 1일당 0.2∼5g/ℓ, 바람직하기로는 0.5∼3g/ℓ의 당 및/또는 0.2∼5mmol/ℓ, 바람직하기로는 0.5∼3mmol/ℓ의 질산이온을 함유한 영양원 용액을 연속적 또는 간헐적으로 첨가하여 배양하면 이 조직 또는 세포의 고밀도 배양이 가능해지고, 이에 따라 배양기 당의 탁산형 디테르펜 생산량이 비약적으로 향상하는 것을 알아내어, 본원 제6의 발명을 완성하였다. 여기에서 밀도라 함은 배양조중의 배양액용적당의 세포량을 표시하며, 배양액 1리터당의 건조세포중량(g)으로 나타낸다. 본원 제6의 발명에서는 영양원 용액을 첨가할 때, 같은 용량의 배지를 조직 또는 세포로부터 분리하여 배출함으로써 배지를 갱신하면서 배양하고, 얻어지는 배양물, 배양도중에 배출하여 회수되는 배지 및 배양종료시에 얻어지는 배지로부터 선택되는 적어도 1종이상으로부터 탁산형 디테르펜을 회수하는 것이 바람직하다. 또 본원 제6의 발명은 배양개시시의 이 식물의 조직 또는 세포의 밀도가 배지 용량에 대해 50g 신선중/ℓ이상의 고밀도 배양에서 탁산형 디테르펜의 생산성 향상에 대한 효과가 특히 크다.
또한 통상적으로는 고밀도의 세포가 얻어진 단계에서 배양을 종료하나, 본 발명자들은 예의 검토를 거듭한 결과, 세포를 배출하면서 배양을 계속함으로써 연속 배양을 실현하고, 더욱 검토를 거듭하여 본원 제7의 발명인 연속배양법을 완성하였다. 즉 배양조중의 배양액의 총용량을 V, 신선배지의 공급속도를 VI, 조직 또는 세포의 비증식도를 μ라 할때 무차원수 F=VI/V/μ로 정의하는 배지의 비갱신율을 0.1∼10의 범위가 되도록 연속적 또는 간헐적으로 신선배지를 첨가하고, 연속적 또는 간헐적으로 조외로 배출되는 조직 또는 세포를 포함한 배양액 및/또는 연속적 또는 간헐적으로 조외로 배출되는 조직 또는 세포를 포함하지 않는 배양액으로부터 탁산형 디테르펜을 회수함으로써 종래의 방법으로는 도저히 불가능으로 예측되는 높은 효율로 탁산형 디테르펜을 제조할 수 있게 되어 본원 제7의 발명을 완성하였다. 배지의 비갱신율 F는 0.5∼5로 하는 것이 더욱 바람직하다. 배양액의 당농도는 5∼40g/ℓ, 배양액의 질산이온농도는 10∼40mmol/ℓ인 것이 바람직하다. 세포밀도는 1리터당 생세포중량으로 50∼500g에서 본 발명의 효과가 달성되나, 극단적으로 강한 교반을 필요로 하지 않는 범위에서 높은 편이 좋은 효율로 탁산형 디테르펜을 생산할 수 있어, 1리터당 200g 이상이 바람직하다.
그리고 상기 본원 제4∼제7의 발명을 상기 본원 제3의 발명과 조합시키기 위해서는 본원 제3의 발명에 의해 취득한 세포를 본원 제4∼제7의 발명에 따라 배양해서 목적으로 하는 탁산형 디테르펜을 제조하면 좋다.
[도면의 간단한 설명]
제1도는 자스몬산 메틸 100μM을 첨가후의 배지중의 탁솔 수량(收量)의 변화를 나타낸 도면이다.
제2도는 자스몬산 메틸 100μM을 첨가후의 배지중의 바카틴Ⅲ수량의 변화를 나타낸 도면이다.
제3도는 본원 제2의 발명에 의해 조직 배양을 할 때 사용되는 배양장치의 예를 나타낸 도면이다.
제4도는 분획 배양후의 생육을 나타낸 도면이다.
제5도는 분획 배양후의 탁산함량을 나타낸 도면이다.
제6도는 분획시의 세포의 존재비를 나타낸 도면이다.
제7도는 분획시의 탁산함량(세포중)을 나타낸 도면이다.
제8도는 본원 제6 또는 제7의 발명에 의해 조직배양을 할 때 사용되는 배양장치의 예를 나타낸 도면이다.
* 도면의 주요부분에 대한 부호의 설명
1 : 공기공급관 2 : 질소공급관
3 : 배양조 4 : 산소함유 가스공급구
5 : 용존산소농도계 6 : 용존산소농도 제어장치
7 : 가스배기관 8 : 밸브
9 : 산소유량제어밸브 10 : 에어필터
11 : 교반날개
12 : 배지공급관 13 : 배지공급구
14 : 배양액만(조직 또는 세포를 포함하지 않는 배양액)을 배출시키는 필터를 부착한 배출구
15 : 배양액 배출관 16 : 산소함유가스통기관
17 : 교반날개
18 : 배양혼합물(조직 또는 세포를 포함한 배양액)배출관
19 : 가압유체송입구 a,b,c,d,e : 밸브
[발명을 실시하기 위한 최량의 형태]
이하 실시예 및 비교예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하나, 본 발명의 범위는 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1]
나프탈렌 초산을 10-5M의 농도가 되도록 첨가한 고체 우디 플란트 미디엄(게란검 0.25중량%)에 미리 2% 안티포르민용액 또는 70% 에타놀 용액등으로 멸균처리한 서양주목(Taxus baccata LINN)의 줄기의 일부를 치상하고, 25℃로 암소에서 정치 배양하여 서양주목 칼루스를 얻었다. 다음에 이 칼루스 1g(신선중)을 상기 성분을 같은 농도로 첨가한 액체 우디 플랜트 미디엄 20㎖들이의 3각 플라스크에 옮기고, 로터리 쉐이커(rotarty shaker)상에서 선회배양(진폭 25㎜, 120rpm)해서 21일마다 이식하여, 이 칼루스의 생육속도를 빠르게 하였다.
이와같이 하여 얻어진 배양세포 1g(신성중)을 상기 성분을 같은 농도로 첨가한 우디 플랜드 미디엄의 액체 배지 20㎖들이의 3각 플라스크에 옮겨서 25℃에서 14일간 진탕 배양하였다. 배양 14일째에 일반식(Ⅰ)로 나타낸 화합물로서 투베론산의 메틸 에스테르(상기식(Ⅰ)에서 R1a, R1b, R1c, R1d, R1e, R1f, R2, R3, R4, R5및 R6a가 수소원자이며, R6b는 수산기이며, R7이 메톡시기이며, n이 1이며, C3와 C4사이에 2중 결합을 포함하고 있는 화합물)를 그 최종 농도가 0.01∼1000㎛가 되도록 첨가하여 다시 7일간 배양하였다.
배양종료후, 서양주목 배양세포를 여과에 의해 채취하여 동결 건조한 후에 그 건조중량을 측정하여 액체 배지 1L당 배양세포의 생육 중량을 구하였다. 얻어진 건조 칼루스로부터 메타놀 등을 사용하여 탁산형 디테르펜을 추출하고, 고속액체 크로마토그래피를 사용하여 표준품 탁솔, 세파로마닌, 바카틴 Ⅲ와 비교정량함으로써 탁산형 디테르펜 수량을 측정하였다. 그 결과를 표 1에 나타낸다.
[비교예 1]
실시예 1에서 투베론산의 메틸에스테르를 첨가하지 않은 이외에는 실시예 1과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 1에 나타낸다.
[실시예 2]
실시예 1에서 투베론산의 메틸에스테르를 배양 7일째부터 하루 건너로 계 4회 축차 첨가(1회당의 최종 농도는 25㎛, 합계 100μM)한 이외에는 실시예 1과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 1에 나타낸다.
[실시예 3]
실시예 1에서 투베론산의 메틸에스테르 100μM를 배양 1일째에 첨가하고, 다시 20일간 배양한 이외에는 실시예 1과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 1에 나타낸다.
[실시예 4]
실시예 1에서 투베론산의 메틸에스테르 100μM를 배양 7일째에 첨가하고, 다시 14일간 배양한 이외에는 실시예 1과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 1에 나타낸다.
[실시예 5]
실시예 1의 방법으로 얻어지는 생육속도를 빠르게 한 세포를 우선 스테인리스 메쉬에 의해 250∼840㎛ 사이즈의 세포 집괴로 분별하였다. 다음에 Ficoll을 사용하여 비중 1.07(g/㎖)인 밀도의 매체를 작성하여 상기 세포를 중층하고, 700회전으로 6분간 원심을 행하였다. 세포는 비중의 차이에 의해 2층으로 분리하였다. 1.07g/㎖ 이하의 층에 포함되는 세포를 분획하고, 2% 자당액으로 최저 3회 이상 세정하여 Ficoll를 씻어내었다. 세정후 세포 1g(신선중)을 액체 우디 플랜트 미디엄 20㎖들이의 3각 플라스크에 옮겨서 25℃에서 14일간 진탕 배양하였다. 배양 14일째에 투베론산의 메틸에스테르를 그 최종농도가 250μM가 되도록 첨가하고, 다시 7일간 배양하였다. 배양 종료후는 실시예 1과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 2에 나타낸다. 특정 비중의 세포의 선별과 투베론산 메틸 에스테르의 첨가를 조합함으로써 탁산형 디테르펜의 생산성을 대폭적으로 향상시킬 수가 있었다.
[비교예 2]
실시예 5에서 투베론산의 메틸에스테르를 첨가하지 않은 이외에는 실시예 5와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 2에 나타낸다.
[실시예 6]
실시예 1과 마찬가지 방법에 의해 얻어지는 태평양 주목의 배양세포(배양 14일째)에 투베론산의 메틸에스테르 250μM를 첨가하여 7일간 배양하였다. 배양 종료후에는 실시예 1과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 3에 나타낸다.
[비교예 3]
실시예 6에서 투베론산의 메틸에스테르를 첨가하지 않은 이외에는 실시예 6과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 3에 나타낸다.
[실시예 7]
실시예 6에서 T.media의 배양세포를 사용한 이외에는 실시예 6과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 3에 나타낸다.
[비교예 4]
실시예 7에서 투베론산의 메틸에스테르를 첨가하지 않은 이외에는 실시예 7과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 3에 나타낸다.
[실시예 8]
나프탈렌 초산을 10 M의 농도가 되도록 첨가한 우디 플란트 미디엄의 고체배지(게란검 0.25중량%)에 미리 2% 안티포르민용액 또는 70% 에타놀 용액등으로 멸균 처리한 서양주목(Taxus baccata LINN)의 줄기의 일부를 치상하고, 25℃로 암소에서 정치 배양하여 서양주목칼루스를 얻었다. 다음에 이 칼루스 1g(신선중)을 상기 성분을 같은 농도로 첨가한 액체 우디 플랜트 미디엄 20㎖들이의 3각 플라스크에 옮기고, 로터리 쉐이커(rotary shaker)상에서 선회배양(진폭 25mm, 120rpm)해서 21일마다 이식하여, 이 칼루스의 생육속도를 빠르게 하였다.
이와같이 하여 얻어진 배양세포 1g(신성중)을 상기 성분을 같은 농도로 첨가한 액체 우디 플랜드 미디엄 20㎖들이의 3각 플라스크에 옮겨서 25℃에서 14일간 진탕 배양하였다. 배양 14일째에 자스몬산류로서 쿠쿠르빈산의 메틸 에스테르(상기식(Ⅱ)에서 R , R , R , R , R , R , R , R , R , R 및 R 가 수소원자이며, R 이 메톡시기이며, n이 1이며, C 와 C 사이에 2중 결합을 포함하고 있는 화합물)를 그 최종 농도가 0.01∼1000㎛가 되도록 첨가하여 다시 7일간 배양하였다.
배양종료후, 서양주목 배양세포를 여과에 의해 채취하여 동결 건조한 후에 그 건조중량을 측정하여 액체 배지 1L당 배양세포의 생육 중량을 구하였다. 얻어진 건조 칼루스로부터 메타놀 등을 사용하여 탁산형 디테르펜을 추출하고, 고속액체 크로마토그래피를 사용하여 표준품 탁솔, 세파로마닌, 바카틴 Ⅲ와 비교정량함으로써 탁산형 디테르펜 수량을 측정하였다. 그 결과를 표 1에 나타낸다.
[비교예 5]
실시예 8에서 쿠쿠르빈산의 메틸에스테르를 첨가하지 않은 이외에는 실시예 8과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 4에 나타낸다.
[실시예 9]
실시예 8에서 쿠쿠르빈산의 메틸에스테르를 배양 7일째부터 하루 건너로 계 4회 축차 첨가(1회당의 최종 농도는 25㎛, 합계 100μM)한 이외에는 실시예 8과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 4에 나타낸다.
[실시예 10]
실시예 8에서 쿠쿠르빈산의 메틸에스테르 100μM를 배양 1일째부터 첨가하고, 다시 20일간 배양한 이외에는 실시예 8과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 4에 나타낸다.
[실시예 11]
실시예 8에서 쿠쿠르빈산의 메틸에스테르를 100μM를 배양 7일째에 첨가하고, 다시 14일간 배양한 이외에는 실시예 8과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 4에 나타낸다.
[실시예 12]
실시예 8의 방법으로 얻어지는 생육속도를 빠르게 한 세포를 우선 스테인리스 메쉬에 의해 250∼840㎛ 사이즈의 세포 집괴로 분별하였다. 다음에 Ficoll을 사용하여 비중 1.07(g/ml)이 밀도의 매체를 작성하여 상기 세포를 중층하고, 700회전으로 6분간 원심을 행하였다. 세포는 비중의 차이에 의해 2층으로 분리하였다. 1.07g/㎖ 이하의 층에 포함되는 세포를 분획하고, 2% 자당액으로 최저 3회 이상 세정하여 Ficoll를 씻어내었다. 세정후 세포 1g(신선중)을 액체 우디 플랜트 미디엄 20㎖들이의 3각 플라스크에 옮겨서 25℃에서 14일간 진탕 배양하였다. 배양 14일째에 쿠쿠르빈산의 메틸에스테르를 그 최종농도가 250μM가 되도록 첨가하고, 다시 7일간 배양하였다. 배양 종료후는 실시예 8과 마차가지로 조작하였다. 그 결과를 표 5에 나타낸다. 특정 비중의 세포의 선별과 쿠쿠르빈산 메틸 에스테르의 첨가를 조합함으로써 탁산형 디테르펜의 생산성을 대폭적으로 향상시킬 수가 있었다.
[비교예 6]
실시예 12에서 쿠쿠르빈산의 메틸에스테르를 첨가하지 않은 이외에는 실시예 12와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 5에 나타낸다.
[실시예 13]
실시예 8과 마찬가지 방법에 의해 얻어지는 태평양 주목의 배양세포(배양 14일째)에 쿠쿠르빈산의 메틸에스테르 250μM를 첨가하여 7일간 배양하였다. 배양 종료후에는 실시예 8과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 6에 나타낸다.
[비교예 7]
실시예 13에서 쿠쿠르빈산의 메틸에스테르를 첨가하지 않은 이외에는 실시예 13과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 6에 나타낸다.
[실시예 14]
실시예 13에서 T.media의 배양세포를 사용한 이외에는 실시예 13과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 6에 나타낸다.
[비교예 8]
실시예 14에서 쿠쿠르빈산의 메틸에스테르를 첨가하지 않은 이외에는 실시예 14와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 6에 나타낸다.
[실시예 15]
나프탈렌 초산을 10 M의 농도가 되도록 첨가한 우디 플란트 미디엄 고체배지(게란검 0.25중량%)에 미리 2% 안티포르민용액 또는 70% 에타놀 용액등으로 멸균 처리한 서양주목(Taxus baccata LINN)의 줄기의 일부를 치상하고, 25℃로 암소에서 정치 배양하여 서양주목칼루스를 얻었다. 다음에 이 칼루스 1g(신선중)을 상기 성분을 같은 농도로 첨가한 액체 우디 플랜트 미디엄 20㎖들이의 3각 플라스크에 옮기고, 로터리 쉐이커상에서 선회배양(진폭 25mm, 120rpm)해서 21일마다 이식하여, 이 칼루스의 생육속도를 빠르게 하였다.
이와같이 하여 얻어진 배양세포 1g(신성중)을 상기 성분을 같은 농도로 첨가한 액체 우디 플랜드 미디엄 20㎖들이의 3각 플라스크에 옮겨서 25℃에서 14일간 진탕 배양하였다. 배양 14일째에 자스몬산류로서 자스몬산의 메틸 에스테르(상기식(Ⅱ)에서 R , R , R , R , R , R , R , R , R , R 및 R 가 수소원자이며, R 이 메톡시기이며, n이 1이며, C 와 C 사이에 2중 결합을 포함하고 있는 화합물, 트랜스형 90%, 시스형 10%)를 그 최종 농도가 0.01∼1000㎛가 되도록 첨가하여 다시 7일간 배양하였다.
배양종료후, 서양주목 배양세포를 여과에 의해 채취하여 동결 건조한 후에 그 건조중량을 측정하여 액체 배지 1L당 배양세포의 생육 중량을 구하였다. 얻어진 건조 칼루스로부터 메타놀 등을 사용하여 탁산형 디테르펜을 추출하고, 고속액체 크로마토그래피를 사용하여 표준품 탁솔, 세파로마닌, 바카틴 Ⅲ와 비교정량함으로써 탁산형 디테르펜 수량을 측정하였다. 그 결과를 표 7에 나타낸다.
[비교예 9]
실시예 15에서 자스몬산의 메틸에스테르를 첨가하지 않은 이외에는 실시예 15과 마찬가지로 조작하였다. 그결과를 표 7에 나타낸다.
[실시예 16]
실시예 15에서 자스몬산의 메틸에스테르를 배양 7일째부터 하루 건너로 계 4회 축차 첨가(1회당의 최종 농도는 25㎛, 합계 100μM)한 이외에는 실시예 15과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 7에 나타낸다.
[실시예 17]
실시예 15에서 자스몬산의 메틸에스테르 100μM를 배양 1일째에 첨가하고, 다시 20일간 배양한 이외에는 실시예 15와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 7에 나타낸다.
[실시예 18]
실시예 15에서 자스몬산의 메틸에스테르를 100μM를 배양 7일째에 첨가하고, 다시 14일간 배양한 이외에는 실시예 15와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 7에 나타낸다.
[실시예 19]
실시예 15에서 자스몬산류로서는 자스몬산(상기식(Ⅲ)에서 R , R , R , R , R , R , R , R , R , R 및 R 가 수소원자이며, R 이 수산기이며, n이 1이며, C 와 C 사이에 2중 결합을 포함하고 있는 화합물, 트랜스형 90%, 시스형 10%)를 그 최종 농도가 0.01∼1000M가 되도록 첨가한 이외에는 실시예 15와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 8에 나타낸다.
[비교예 10]
실시예 19에서 자스몬산을 첨가하지 않은 이외에는 실시예 19와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 8에 나타낸다.
[실시예 20]
실시예 15에서 자스몬산 메틸에스테르 100μM를 첨가하기전, 첨가후 3일째, 및 7일째의 배지중에 존재하는 탁산형 디테르펜을 분석한 결과를 제1도 및 제2도에 나타낸다. 배양 7일째에는 탁솔의 약 5할, 바카틴Ⅲ의 약 7할이 배지에 누출하고 있었다.
[비교예 11]
실시예 20에서 자스몬산 메틸에스테르를 첨가하지 않은 이외에는 실시예 20과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 제1도 및 제2도에 나타낸다.
[실시예 21]
실시예 15의 방법으로 얻어지는 생육속도를 빠르게 한 세포를 우선 스테인리스 메쉬에 의해 250∼840㎛ 사이즈의 세포 집괴로 분별하였다. 다음에 Ficoll을 사용하여 비중 1.07(g/ml)이 밀도의 매체를 작성하여 상기 세포를 중층하고, 700회전으로 6분간 원심분리를 행하였다. 세포는 비중의 차이에 의해 2층으로 분리하였다. 1.07g/㎖ 이하의 층에 포함되는 세포를 분획하고, 2% 자당액으로 최저 3회 이상 세정하여 Ficoll를 씻어내었다. 세정후 세포 1g(신선중)을 액체 우디 플랜트 미디엄 20㎖들이의 3각 플라스크에 옮겨서 25℃에서 14일간 진탕 배양하였다. 배양 14일째에 자스몬산의 메틸에스테르를 그 최종농도가 250μM가 되도록 첨가하고, 다시 7일간 배양하였다. 배양 종료후는 실시예 15와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 9에 나타낸다. 특정 비중의 세포의 선별과 자스몬산 메틸 에스테르의 첨가를 조합함으로써 탁산형 디테르펜의 생산성을 대폭적으로 향상시킬 수가 있었다.
[비교예 12]
실시예 21에서 자스몬산 메틸에스테르를 첨가하지 않은 이외에는 실시예 21와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 9에 나타낸다.
[실시예 22]
실시예 15와 마찬가지 방법에 의해 얻어지는 태평양 주목의 배양세포(배양 14일째)에 자스몬산 메틸에스테르 250μM를 첨가하여 7일간 배양하였다. 배양 종료후에는 실시예 15와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 10에 나타낸다.
[비교예 13]
실시예 22에서 자스몬산 메틸에스테르를 첨가하지 않은 이외에는 실시예 22와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 10에 나타낸다.
[실시예 23]
실시예 22에서 T.media의 배양세포를 사용한 이외에는 실시예 22과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 10에 나타낸다.
[비교예 14]
실시예 23에서 자스몬산의 메틸에스테르를 첨가하지 않은 이외에는 실시예 23과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 10에 나타낸다.
[실시예 24]
나프탈렌 초산을 10 M의 농도가 되도록 첨가한 고체 우디 플란트 미디엄(게란검 0.25중량%)에 미리 2% 안티포르민용액 또는 70% 에타놀 용액등으로 멸균 처리한 서양주목(Taxus baccata LINN)의 줄기의 일부를 치상하고, 25℃로 암소에서 정치 배양하여 서양주목 칼루스를 얻었다. 다음에 이 칼루스 1g(신선중)을 상기 성분을 같은 농도로 첨가한 액체 우디 플랜트 미디엄 20㎖들이의 3각 플라스크에 옮기고, 로터리 쉐이커상에서 선회배양(진폭 25mm, 100rpm)해서 21일마다 이식하여, 이 칼루스의 생육속도를 빠르게 하였다.
이와같이 하여 얻어진 배양세포 1g(신성중)을 상기 성분을 같은 농도로 첨가한 액체 우디 플랜드 미디엄 20㎖들이의 3각 플라스크에 옮긴후, 중금속을 함유한 화합물로서 [Ag(SO)] 를 그 최종농도가 10 M∼1M이 되도록 첨가하였다. 그리고 25℃에서 21일간 선회배양하였다.
배양종료후, 서양주목 배양세포를 여과에 의해 채취하여 동결 건조한 후에 그 건조중량을 측정하여 생육배율을 구하였다. 얻어진 건조 칼루스로부터 메타놀등을 사용하여 탁산형 디테르펜을 추출하고, 고속액체 크로마토그래피를 사용하여 표준품 탁솔, 세파로마닌, 바카틴 Ⅲ와 비교정량함으로써 탁산형 디테르펜 수량을 측정하였다. 그 결과를 표 11에 나타낸다.
[실시예 25]
실시예 24에서 [Ag(SO)] 를 그 최종농도가 10 M이 되도록 배양개시 7일째에 첨가하고, 다시 7일간 배양하였다. 배양종료후는 실시예 24와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 11에 표시한다.
[실시예 26]
실시예 24에서 [Ag(SO)] 를 그 최종농도가 10 M이 되도록 배양개시 14일째에 첨가하고, 다시 7일간 배양하였다. 배양종료후는 실시예 24와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 11에 나타낸다.
[실시예 27]
실시예 24에서 [Ag(SO)] 를 그 최종농도가 10 M이 되도록 배양개시 18일째에 첨가하고, 다시 3일간 배양하였다. 배양종료후는 실시예 24와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 11에 나타낸다.
[실시예 28]
실시예 24에서 [Ag(SO)] 를 배양개시(0일째)로부터 4일간격으로 계5회 축차 첨가(1회당의 최종 농도는 2×10 M, 합계 10 M)하는 것 이외에는 실시예 24와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 11에 나타낸다.
[실시예 29]
실시예 24에서 배양 14일째에 자스몬산류로서는 자스몬산의 메틸에스테르(상기식(Ⅲ)에서 R , R , R , R , R , R , R , R , R , R 및 R 가 수소원자이며, R 이 메톡시기이며, n이 1이며, C 와 C 사이에 2중 결합을 포함하고 있는 화합물)를 그 최종 농도가 10 M이 되도록 첨가하는 것 이외에는 실시예 24와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 11에 나타낸다.
[실시예 30]
실시예 24에서 그 플라스크를 기체 공급구와 배출구를 갖는 용기(내용량 3000ml)내에 넣어 밀폐한 후, 공기와 질소를 사용하여 그 배양세포에 공급하는 산소농도가 10%가 되도록 혼합비를 조절하고, 다시 매분 25ml의 비율로 이 기체를 공급구로부터 공급한 것 이외에는 실시예 24와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 11에 나타낸다.
[실시예 31]
실시예 30에서 배양14일째에 자스몬산의 메틸에스테르를 그 최종농도가 10 M이 되도록 첨가하는 것 이외에는 실시예 30과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 11에 나타낸다.
[실시예 32]
실시예 24에서 [Ag(SO)] 대신에 질산은(AgNO)10 M을 배양개시시(0일째)에 첨가한 것 이외에는 실시예 24와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 11에 나타낸다.
[실시예 33]
실시예 32에서 질산은 10 M을 배양개시 14일째에 첨가한 것 이외에는 실시예 32와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 11에 나타낸다.
[비교예 15]
실시예 24에서 [Ag(SO)] 를 첨가하지 않은 이외에는 실시예 24와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 11에 나타낸다.
[실시예 34]
실시예 24에서 중금속을 함유한 화합물로서 [Ag(SO)] 대신에 염화코발트(CoCl)를 그 최종농도가 10 M∼1M이 되도록 첨가한 것 이외에는 실시예 24와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 12에 나타낸다.
[실시예 35]
실시예 34에서 [Ag(SO)] 대신에 염화코발트를 그 최종농도가 10 M이 되도록 배양개시 7일째에 첨가하고, 다시 14일간 배양하였다. 배양종료후는 실시예 34와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 12에 나타낸다.
[실시예 36]
실시예 34에서 염화코발트를 그 최종농도가 10 M이 되도록 배양개시 14일째에 첨가하고, 다시 7일간 배양하였다. 배양종료후는 실시예 34와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 12에 나타낸다.
[실시예 37]
실시예 34에서 염화코발트를 그 최종농도가 10 M이 되도록 배양개시 18일째에 첨가하고, 다시 3일간 배양하였다. 배양종료후는 실시예 34와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 12에 나타낸다.
[실시예 38]
실시예 34에서 염화코발트를 배양개시시(0일째)로부터 4일간격으로 계5회 축차 첨가(1회당의 최종 농도는 2×10 M, 합계 10 M)한 것 이외에는 실시예 34와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 12에 나타낸다.
[실시예 39]
실시예 34에서 배양 14일째에 자스몬산류로서는 자스몬산의 메틸에스테르(상기식(Ⅲ)에서 R , R , R , R , R , R , R , R , R , R 및 R 가 수소원자이며, R 이 메톡시기이며, n이 1이며, C 와 C 사이에 2중 결합을 포함하고 있는 화합물)를 그 최종 농도가 10 M이 되도록 첨가하는 것 이외에는 실시예 34와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 12에 나타낸다.
[실시예 40]
실시예 34에서 그 플라스크를 기체 공급구와 배출구를 갖는 용기(내용량 3000ml)내에 넣어 밀폐한 후, 공기와 질소를 사용하여 그 배양세포에 공급하는 산소농도가 10%가 되도록 혼합비를 조절하고, 다시 매분 25ml의 비율로 이 기체를 공급구로부터 공급한 것 이외에는 실시예 34와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 12에 나타낸다.
[실시예 41]
실시예 40에서 배양14일째에 자스몬산의 메틸에스테르를 그 최종농도가 10 M이 되도록 첨가하는 것 이외에는 실시예 40과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 12에 나타낸다.
[실시예 42]
나프탈렌 초산을 10 M의 농도가 되도록 첨가한 고체 우디 플란트 미디엄(게란검 0.25중량%)에 미리 2% 안티포르민용액 또는 70% 에타놀 용액등으로 멸균 처리한 서양주목(Taxus baccata LINN)의 줄기의 일부를 치상하고, 25℃로 암소에서 정치 배양하여 서양주목 칼루스를 얻었다. 다음에 이 칼루스 1g(신선중)을 상기 성분을 같은 농도로 첨가한 액체 우디 플랜트 미디엄 20㎖들이의 3각 플라스크에 옮기고, 로터리 쉐이커상에서 선회배양(진폭 25mm, 100rpm)해서 21일마다 이식하여, 이 칼루스의 생육속도를 빠르게 하였다.
이와같이 하여 얻어진 배양세포 1g(신성중)을 상기 성분을 같은 농도로 첨가한 액체 우디 플랜드 미디엄 20㎖들이의 3각 플라스크에 옮긴후 아민류로서 스페르미딘을 그 최종농도가 10 M∼1M이 되도록 첨가하였다. 그리고 25℃에서 21일간 선회배양하였다.
배양종료후, 서양주목 배양세포를 여과에 의해 채취하여 동결 건조한 후에 그 건조중량을 측정하여 생육배율을 구하였다. 얻어진 건조 칼루스로부터 메타놀등을 사용하여 탁산형 디테르펜을 추출하고, 고속액체 크로마토그래피를 사용하여 표준품 탁솔, 세파로마닌, 바카틴 Ⅲ와 비교정량함으로써 탁산형 디테르펜 수량을 측정하였다. 그 결과를 표 13에 나타낸다.
[실시예 43]
실시예 42에서 스페르미딘을 그 최종농도가 10 M이 되도록 배양개시 7일째에 첨가하고, 다시 14일간 배양하였다. 배양종료후는 실시예 42와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 13에 나타낸다.
[실시예 44]
실시예 42에서 스페르미딘을 그 최종농도가 10 M이 되도록 배양개시 14일째에 첨가하고, 다시 7일간 배양하였다. 배양종료후는 실시예 42와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 13에 나타낸다.
[실시예 45]
실시예 42에서 스페르미딘을 그 최종농도가 10 M이 되도록 배양개시 18일째에 첨가하고, 다시 3일간 배양하였다. 배양종료후는 실시예 42와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 13에 나타낸다.
[실시예 46]
실시예 42에서 스페르미딘을 배양개시시(0일째)로부터 4일간격으로 계5회 축차 첨가(1회당의 최종 농도는 2×10 M, 합계 10 M)하는 것 이외에는 실시예 42와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 13에 나타낸다.
[실시예 47]
실시예 42에서 배양 14일째에 자스몬산류로서는 자스몬산의 메틸에스테르(상기식(Ⅲ)에서 R , R , R , R , R , R , R , R , R , R 및 R 가 수소원자이며, R 이 메톡시기이며, n이 1이며, C 와 C 사이에 2중 결합을 포함하고 있는 화합물)를 그 최종 농도가 10 M이 되도록 첨가하는 것 이외에는 실시예 42와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 13에 나타낸다.
[실시예 48]
실시예 42에서 그 플라스크를 기체 공급구와 배출구를 갖는 용기(내용량 3000ml)내에 넣어 밀폐한 후, 공기와 질소를 사용하여 그 배양세포에 공급하는 산소농도가 10%가 되도록 혼합비를 조절하고, 다시 매분 25ml의 비율로 이 기체를 공급구로부터 공급한 것 이외에는 실시예 42와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 13에 나타낸다.
[실시예 49]
실시예 48에서 배양14일째에 자스몬산의 메틸에스테르를 그 최종농도가 10 M이 되도록 첨가하는 것 이외에는 실시예 48과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 13에 나타낸다.
[비교예 16]
실시예 42에서 스페르미딘을 첨가하지 않은 것 이외는 실시예 42와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 13-15에 나타낸다.
[실시예 50]
실시예 42에서 스페르미딘 대신에 스페르민을 그 최종농도가 10 M∼1M이 되도록 첨가한 것 이외에는 실시예 42와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 14에 나타낸다.
[실시예 51]
실시예 42에서 스페르미딘 대신에 프토레신을 그 최종 농도가 10 M∼1M이 되도록 첨가한 것 이외에는 실시예 42와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 15에 나타낸다.
[실시예 52]
나프탈렌 초산을 10 M의 농도가 되도록 첨가한 고체 우디 플란트 미디엄(게란검 0.25중량%)에 미리 2% 안티포르민용액 또는 70% 에타놀 용액등으로 멸균 처리한 서양주목(Taxus baccata LINN)의 줄기의 일부를 치상하고, 25℃로 암소에서 정치 배양하여 서양주목 칼루스를 얻었다. 다음에 이 칼루스 1g(신선중)을 상기 성분을 같은 농도로 첨가한 액체 우디 플랜트 미디엄 20㎖들이의 3각 플라스크에 옮기고, 로터리 쉐이커상에서 선회배양(진폭 25mm, 100rpm)해서 21일마다 이식하여, 이 칼루스의 생육속도를 빠르게 하였다.
이와같이 하여 얻어진 배양세포 1g(신성중)을 상기 성분을 같은 농도로 첨가한 액체 우디 플랜드 미디엄 20㎖들이의 3각 플라스크에 옮기고, 25℃에서 14일간 선회 배양하였다. 그리고 배양개시 14일째에 항에틸렌제로서 아세틸 살리실산(HOOCCHOCOCH)을 그 최종농도가 10 M∼1M이 되도록 첨가한 후, 다시 7일간 배양하였다.
배양종료후, 서양주목 배양세포를 여과에 의해 채취하여 동결 건조한 후에 그 건조중량을 측정하여 생육배율을 구하였다. 얻어진 건조 칼루스로부터 메타놀등을 사용하여 탁산형 디테르펜을 추출하고, 고속액체 크로마토그래피를 사용하여 표준품 탁솔, 세파로마닌, 바카틴 Ⅲ와 비교정량함으로써 탁산형 디테르펜 수량을 측정하였다. 그 결과를 표 16에 나타낸다.
[실시예 53]
실시예 52에서 아세틸살리실산을 그 최종농도가 10 M이 되도록 배양개시시(0일째)에 첨가하고, 21일간 배양하였다. 배양종료후는 실시예 52와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 16에 표시한다.
[실시예 54]
실시예 52에서 아세틸 살리신산을 그 최종농도가 10 M이 되도록 배양개시 7일째에 첨가하고, 다시 14일간 배양하였다. 배양종료후는 실시예 52와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 16에 나타낸다.
[실시예 55]
실시예 52에서 아세틸 살리실산을 그 최종농도가 10 M이 되도록 배양개시 18일째에 첨가하고, 다시 3일간 배양하였다. 배양종료후는 실시예 52와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 16에 나타낸다.
[실시예 56]
실시예 52에서 아세틸살리실산을 배양개시 7일째부터 2일 간격으로 계5회 축차 첨가(1회당의 최종 농도는 2×10 M, 합계 10 M)하는 것 이외에는 실시예 52와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 16에 나타낸다.
[실시예 57]
실시예 52에서 배양 14일째에 자스몬산류로서는 자스몬산의 메틸에스테르(상기식(Ⅲ)에서 R , R , R , R , R , R , R , R , R , R 및 R 가 수소원자이며, R 이 메톡시기이며, n이 1이며, C 와 C 사이에 2중 결합을 포함하고 있는 화합물)를 그 최종 농도가 10 M이 되도록 첨가하는 것 이외에는 실시예 52와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 16에 나타낸다.
[실시예 58]
실시예 52에서 그 플라스크를 기체 공급구와 배출구를 갖는 용기(내용량 3000ml)내에 넣어 밀폐한 후, 공기와 질소를 사용하여 그 배양세포에 공급하는 산소농도가 10%가 되도록 혼합비를 조절하고, 다시 매분 25ml의 비율로 이 기체를 공급구로부터 공급한 것 이외에는 실시예 52와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 16에 나타낸다.
[실시예 59]
실시예 58에서 배양14일째에 자스몬산의 메틸에스테르를 그 최종농도가 10 M이 되도록 첨가하는 것 이외에는 실시예 58과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 16에 나타낸다.
[비교예 17]
실시예 52에서 아세틸 살리실산을 첨가하지 않은 이외에는 실시예 52와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 16에 나타낸다.
[참고예 1]
실시예 52에서 아세틸살리실산 대신에 에틸렌 발생제로서 에트렐(Ethrel)(CHOClP)10 M을 배양개시시(0일째)에 첨가한 것 이외에는 실시예 52와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 16에 나타낸다.
[참고예 2]
실시예 52에서 아세틸 살리실산 대신에 에트렐 10 M을 배양개시 14일째에 첨가한 것 이외에는 실시예 52와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 17에 나타낸다.
[실시예 60]
실시예 52에서 항에틸렌제로서 아미노옥시초산·염산염[(HNOCHCOOH)·HCl]을, 그 최종농도가 10 M∼1M이 되도록 첨가한 것 이외에는 실시예 52와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 17에 나타낸다.
[실시예 61]
실시예 52에서 항에틸렌제로서 몰식자산 프로필[(HO)(CHCOOCHCHCH]을 그 최종농도가 10 M∼1M이 되도록 첨가한 것 이외에는 실시예 52와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 18에 나타낸다.
[실시예 62]
나프탈렌 초산을 10 M의 농도가 되도록 첨가한 고체 우디 플란트 미디엄(게란검 0.25중량%)에 미리 2% 안티포르민용액 또는 70% 에타놀 용액등으로 멸균 처리한 서양주목(Taxus baccata LINN)의 줄기의 일부를 치상하고, 25℃로 암소에서 정치 배양하여 서양주목 칼루스를 얻었다. 다음에 이 칼루스 1g(신선중)을 상기 성분을 같은 농도로 첨가한 액체 우디 플랜트 미디엄 20㎖들이의 3각 플라스크에 옮기고, 로터리 쉐이커상에서 선회배양(진폭 25mm, 100rpm)해서 21일마다 이식하여, 이 칼루스의 생육속도를 빠르게 하였다.
이와같이 하여 얻어진 배양세포 1g(신성중)을 상기 성분을 같은 농도로 첨가한 액체 우디 플랜드 미디엄 20㎖들이의 3각 플라스크에 이식한 후, 이 플라스크를 기체 공급구와 배출구를 갖는 용기(내용량 3000ml)내에 넣어 밀폐하였다. 그리고 공기와 질소를 사용하여 그 배양포에 공급하는 산소농도가 4∼15%가 되도록 혼합비를 조절한 후, 매분 25ml의 비율로 이 기체를 공급구로부터 공급하면서 25℃에서 21일간 선회 배양하였다.
배양종료후, 서양주목 배양세포를 여과에 의해 채취하여 동결 건조한 후에 그 건조중량을 측정하여 생육배율을 구하였다. 얻어진 건조 칼루스로부터 메타놀등을 사용하여 탁산형 디테르펜을 추출하고, 고속액체 크로마토그래피를 사용하여 표준품 탁솔, 세파로마닌, 바카틴 Ⅲ와 비교정량함으로써 탁산형 디테르펜 수량을 측정하였다. 그 결과를 표 19에 나타낸다.
[비교예 18]
실시예 62에서 세포에 공급하는 산소농도가 20%가 되도록 조절한 혼합기체를 공급한 것 이외에는 실시예 62와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 19에 나타낸다.
[참고예 3]
실시예 62에서 배양세포를 이식한 플라스크를 대기중에서 배양하는 것 이외에는 실시예 62와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 19에 나타낸다.
[실시예 63]
실시예 62에서 세포에 공급하는 산소농도가 10%가 되도록 조절한 혼합기체를 배양개시시로부터 3일간 공급한 후, 배양종료시까지(18일간) 공기를 공급한 것 이외에는 실시예 62와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 19에 나타낸다.
[실시예 64]
실시예 62에서 세포에 공급하는 산소농도가 10%가 되도록 조절한 혼합기체를 배양개시시로부터 7일간 공급한 후, 배양종료시까지(14일간) 공기를 공급한 것 이외에는 실시예 62와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 19에 나타낸다.
[실시예 65]
실시예 62에서 세포에 공급하는 산소농도가 10%가 되도록 조절한 혼합기체를 배양개시시로부터 14일간 공급한 후, 배양종료시까지(7일간) 공기를 공급한 것 이외에는 실시예 62와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 19에 나타낸다.
[실시예 66]
실시예 62에서 배양14일째에 자스몬산류로서는 자스몬산의 메틸에스테르(상기식(Ⅲ)에서 R , R , R , R , R , R , R , R , R , R 및 R 가 수소원자이며, R 이 메톡시기이며, n이 1이며, C 와 C 사이에 2중 결합을 포함하고 있는 화합물, 트랜스형 90%, 시스형 10%)를 그 최종 농도가 10∼1000μM이 되도록 첨가한 것 이외에는 실시예 62와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 20에 나타낸다. 저농도 산소공급처리와 자스몬산의 메틸에스테르의 첨가를 조합시킴으로써 탁산형 디테르펜의 생산성을 대폭적으로 향상시킬 수가 있었다.
[실시예 67]
실시예 62에서 얻어지는 생육이 빨라진 배양세포 85g(신선중)을 용존 산소농도계 및 용존 산소농도 제어장치를 갖춘 통기교반배양조(내용량 3000ml)에 액체 우디 플랜트 미디엄 1700ml를 넣은 후, 이식하였다. 그리고 공기와 질소를 사용하여 이 배지중의 용존산소 농도가 0.1ppm 이하가 되도록 혼합비를 조절하면서 25℃에서 21일간 통기 교반배양을 행하였다. 배양장치의 개략도를 제3도에 나타냄과 동시에 결과를 표 21에 나타낸다.
[실시예 68]
실시예 67에서 용존 산소농도가 1ppm 이하가 되도록 혼합비를 조절한 것 이외에는 실시예 67과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 21에 나타낸다.
[실시예 69]
실시예 67에서 용존산소농도가 2ppm 이하가 되도록 혼합비를 조절한 것 이외에는 실시예 67과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 21에 나타낸다.
[실시예 70]
실시예 67에서 용존산소농도가 4ppm 이하가 되도록 혼합비를 조절한 것 이외에는 실시예 67과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 21에 나타낸다.
[실시예 71]
실시예 67에서 용존산소농도가 6ppm 이하가 되도록 혼합비를 조절한 것 이외에는 실시예 67과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 21에 나타낸다.
[비교예 19]
실시예 67에서 공기를 통기한 것 이외에는 실시예 67과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 21에 나타낸다.
[실시예 72]
실시예 67에서 배양개시시로부터 3일간 배지의 용존산소 농도가 4ppm 이하가 되도록 혼합비를 조절하면서 배양한 후, 배양종료시 까지의 사이에(18일간) 공기를 공급한 것 이외에는 실시예 67과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 21에 나타낸다.
[실시예 73]
실시예 67에서 배양개시시로부터 7일간 배지의 용존산소 농도가 4ppm 이하가 되도록 혼합비를 조절하면서 배양한 후, 배양종료시까지(14일간) 공기를 공급한 것 이외에는 실시예 67과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 21에 나타낸다.
[실시예 74]
실시예 67에서 배양개시시로부터 14일간 배지의 용존산소 농도가 4ppm 이하가 되도록 혼합비를 조절하면서 배양한 후, 배양종료시까지(7일간) 공기를 공급한 것 이외에는 실시예 67과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 21에 나타낸다.
[실시예 75]
나프탈렌 초산을 10 M의 농도가 되도록 첨가한 고체 우디 플란트 미디엄(게란검 0.25중량%)에 미리 2% 안티포르민용액 또는 70% 에타놀 용액등으로 멸균 처리한 서양주목(Taxus baccata LINN)의 줄기의 일부를 치상하고, 25℃로 암소에서 정치 배양하여 서양주목 칼루스를 얻었다. 다음에 이 칼루스 1g(신선중)을 상기 성분을 같은 농도로 첨가한 액체 우디 플랜트 미디엄 20㎖들이의 3각 플라스크에 옮기고, 로터리 쉐이커상에서 선회배양(진폭 25mm, 100rpm)해서 21일마다 이식하여, 이 칼루스의 생육속도를 빠르게 하였다.
이와같이 하여 얻어진 배양세포 1g(신성중)을 우선 스테인리스 메쉬에 의해 250∼840μm 사이즈의 세포 집괴로 분별하였다. 다음에 Ficoll을 사용하여 비중 1.03, 1.05, 1.07, 1.09, 1.11(g/ml)의 밀도구배를 작성하여 상기 세포를 중층하고, 700회전으로 6분간 원심 분리를 행하였다. 세포는 비중의 차이에 의해 각층으로 분리하였다. 각각의 층에 분리한 세포를 혼합하지 않도록 분획하고, 2%자당액으로 최저 3회 이상 세정하여 Ficoll을 씻어내었다. 세정후 세포 0.1g(신선중)을 액체 우디플랜드 미디엄 0.8ml들이의 내경 18mm웰에 옮겨서 25℃에서 21일간 진탕 배양하였다. 21일간 배양후 세포전량을 상기 액체 배지 3ml들이의 내경 36mm웰에 옮겨서 25℃에서 다시 28일간 진탕배양하였다.
배양종료후, 서양주목 배양세포를 여과에 의해 채취하여 동결 건조한 후에 그 건조중량을 측정하여 액체배지 1L당 배양세포의 생육 중량을 구하였다. 얻어진 건조 칼루스로부터 메타놀 등을 사용하여 탁산형 디테르펜을 추출하고, 고속액체 크로마토그래피를 사용하여 표준품 탁솔, 세파로마닌, 바카틴 Ⅲ와 비교정량함으로써 탁산형 디테르펜 수량을 측정하였다. 그 결과를 표 22, 제4도 및 제5도에 나타낸다.
[비교예 20]
실시예 75에서 스테인리스 메쉬에 의해 세포집괴를 분별후, 밀도구배에 의한 분획을 하지 않은 이외에는 실시예 75와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 22, 제4도 및 제6도에 나타낸다.
[실시예 76]
실시예 75에서 친식물은 같으나 칼루스와 유도시기가 다른 배양세포를 사용한 이외에는 실시예 75와 마찬가지로 조작하였다. 단 비중 1.07이상의 층에 포함된 세포는 하나로 합친 후 배양하였다. 그 결과를 표 22에 나타낸다.
[비교예 21]
실시예 76에서 스테인리스 메쉬에 의해 세포집괴를 분별후 밀도구배에 의한 분획을 하지 않은 이외에는 실시예 76과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 22에 나타낸다.
[참고예 4]
실시예 75에서 비중범위 1.03 이하의 층으로 분획후 배양한 세포(표 22) 약 0.2g(신선중)을 액체 우디 플랜트 미디엄 3ml 들이의 내경 36mm웰에 옮기고 25℃에서 다시 28일간 진탕 배양하였다. 배양종료후 세포를 비중 1.03, 1.05, 1.07, 1.09, 1.11(g/ml)의 밀도구배에 의해 재차 분획하였다. 밀도구배 분획직후에 세포를 회수하여 분획된 세포의 존재비, 탁산형 디테르펜 함량을 정량하였다. 그 결과를 표 23, 제6도 및 제7도에 나타낸다.
[실시예 77]
실시예 1에서 사용한 것과 같은 배양세포 1g(신선중)을 퍼옥소 2황산 칼륨을 10 M∼10 M 함유한 액체 배지 20ml들이의 3각 플라스크에 옮기고 25℃에서 21일간 진탕하여 1단째의 배양을 하였다.
배양종료후, 배양세포를 여과에 의해 채취하여 일부를 2단째 배양의 종세포로써 사용하고, 나머지 세포는 배양세포의 생육 중량 및 세포중의 탁산함량의 측정에 제공하였다. 즉 채취한 배양세포의 1g(신선중)을 나프탈렌초산을 10 M의 농도가 되도록 첨가한 액체우디플랜트 미디엄 20ml들이의 3각 플라스크에 옮기고, 25℃에서 14일간 진탕 배양하였다. 배양 14일째에 자스몬산메틸을 배지중의 농도가 100μM이 되도록 첨가하고, 다시 7일간 배양하였다. 한편, 1단째 배양에서 얻어진 세포중의 남은 배양세포를 동결 건조한 후, 그 건조중량을 측정하여 액체 배지 1L당의 배양세포의 생육중량을 구하였다. 얻어진 건조세포의 탁소함량을 고속액체 크로마토그래피를 사용하여 측정하였다. 2단째 배양에 대해서도 1단째 배양과 마찬가지로 하여 세포수량 및 탁솔수량을 측정하였다.
그 결과를 표 24에 나타낸다.
[비교예 22]
실시예 77에서 퍼옥소 2황산 칼륨을 사용하지 않은 이외에는 실시예 77과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 24에 나타낸다.
[실시예 78]
실시예 1에서 사용한 것과 같은 배양세포 100g(신선중)을 표준의 액체 우디 플랜트 미디엄 1리터(자당농도:20g/ℓ, 질산이온농도:14.7mM, α-나프탈렌 초산:10 M)에 2mM의 [Ag(SO)] 를 첨가한 배지를 주입한 통기 교반 배양조(내용량 2리터; 제8도)에 이식하고, 25℃, 암소하에서 교반 속도 40rpm, 통기속도 매분 0.1리터로 공기를 통기하면서 배양을 개시하여 배양2일째로부터 14일째의 기간동안에 20g/ℓ의 자당 및 20mM의 질산나트륨을 함유한 배지를 1일당의 자당 첨가량이 2g/ℓ 또 1일당의 질산이온 첨가량이 2mmol/ℓ가 되도록 연속적으로 첨가하고, 그 영양원 용액의 첨가와 같은 속도로 영양원 첨가구와는 별도의 100메쉬의 스테인리스 필터를 부착한 배출구로부터 배양액을 연속적으로 배출시키면서(배양기내의 배지 갱신율:10%/일)21일간 통기 교반배양을 행하였다. 배양종료후 배양세포 및 배지를 회수하고, 상기 실시예 1과 마찬가지 방법으로 탁솔 수량을 측정하였다. 그 결과 표 25에 나타낸다.
[비교예 23]
실시예 78에서 영양원의 도중첨가를 실시하지 않은 이외에는 실시예 78과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 25에 나타낸다.
[실시예 79]
실시예 1에서 사용한 것과 같은 배양세포 50g(신선중)과 액체우디 플랜트 미디엄 1리터를 용적 2리터의 배양조에 옮기고, 통기속도 매분 0.1리터, 교반속도 40rpm, 25℃, 암소에서 14일간 배양한 후, 배양개시 14일째에 세포의 침강용적(PCV)을 측정한 결과, PVC는 0.2리터이었다. 14일째부터 초기 배지와 같은 조성의 배지에 3mM의 [Ag(SO)] 를 첨가한 신선배지의 공급과 세포를 포함하지 않은 배양액의 배출을 개시하였다.
신선배지의 공급량은 1일당 그 시점의 PCV의 2/5용적으로 하고, 세포를 포함하지 않은 배양액은 배양액량을 1리터로 유지하도록 배출하였다. 배양개시 35일째에 PCV는 0.6리터에 달하고 있었다. 이후, 매일 1회 세포를 포함한 배양액을 배출하여 평균의 PCV를 0.6리터로 유지하면서 세포를 포함하지 않은 배양액을 배출함으로써 배양액량을 1리터로 유지하여 정상상태를 얻었다. 배양개시후 90일까지 배양을 계속하였다. 60일간의 정상상태에서 공급한 신선배지의 양은 15리터, 배양조로부터 꺼낸 배지량은 14리터, 얻어진 세포의 양은 0.15kg(건조중량)이며, 비증식속도 μ는 0.08(day ), 평균의 배지비 갱신율은 2.88이었다. 정상상태에서 배양조로부터 꺼내어진 세포 및 배지를 분석한 결과, 탁솔 525mg이 생산되었음을 알았다. 이는 8.8mg/리터/일의 생산량에 상당한다.
세포중 및 배지중에 함유된 탁솔의 양은 실시예 1과 마찬가지 방법으로 정량하였다.
[실시예 80]
실시예 1에서 사용한 것과 같은 배양세포 50g(신선중)과 액체 우디 플랜트 미디엄 1리터를 용적 2리터의 배양조에 옮기고, 탄산가스 2%를 가한 공기를 매분 0.1리터로 통기하여, 교반속도 40rpm, 25℃, 암소에서 14일간 배양하였다. 배양종료후에 세포중 및 배지를 회수하여 건조세포 15.2g을 얻었다. 세포 및 배지중에 함유된 탁솔의 양은 실시예 1과 마찬가지 방법으로 정량한 결과, 탁솔 31mg이 생산되었음을 알았다.
[비교예]
실시예 1에서 투베론산 메틸 대신에 자스몬을 그 최종 농도가 0.1∼1000μM이 되도록 첨가한 이외에는 실시예 1과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 26에 나타낸다.
[비교예 24]
비교예 24에서 자스몬을 첨가하지 않은 이외에는 비교예 24와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 26에 나타낸다.
[산업상의 이용분야]
본 발명에 의하면 난소암, 유암, 폐암 등의 치료약으로서 유용한 탁솔을 함유한 탁산형 디테르펜을 공업적으로 생산하는 것이 가능해진다.

Claims (1)

  1. 탁산형 디테르펜을 생성하는 주목(Taxus)속 식물의 조직 또는 세포를 배양조를 사용하여 배양함에 있어서, 조내에 도입하는 산소 함유 가스로서 0.03∼10%의 탄산가스를 함유한 가스를 사용하여 배양하고, 얻어지는 배양물로부터 탁산형 디테르펜을 회수하는 것을 특징으로 하는 탁산형 디테르펜의 제조방법.
KR1019980704609A 1994-11-09 1994-11-09 탁산형 디테르펜의 제조방법 KR0169080B1 (ko)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/JP1994/001880 WO1995014103A1 (fr) 1993-11-15 1994-11-09 Procede de production de diterpene de taxane et procede de recolte de cellules de culture capables de produire du diterpene de taxane a haut rendement

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1019950702779A Division KR0172606B1 (ko) 1993-11-15 1994-11-09 탁산형 디테르펜의 제조방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR0169080B1 true KR0169080B1 (ko) 1999-01-15

Family

ID=14098768

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1019980704609A KR0169080B1 (ko) 1994-11-09 1994-11-09 탁산형 디테르펜의 제조방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR0169080B1 (ko)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR0172606B1 (ko) 탁산형 디테르펜의 제조방법
Fett-Neto et al. Production of paclitaxel and related taxoids in cell cultures of Taxus cuspidata: perspectives for industrial applications
KR0169079B1 (ko) 탁산형 디테르펜의 제조방법
KR0169081B1 (ko) 탁산형 디테르펜 고생성 배양 세포의 취득방법
JP3066873B2 (ja) 半連続培養によるタキソールの大量生産方法
JPH08163991A (ja) タキサン型ジテルペンの製造方法
CA2080000A1 (en) Process for producing taxol by cell culture of taxus species
KR0169080B1 (ko) 탁산형 디테르펜의 제조방법
KR100287465B1 (ko) 탁산형 디테르펜의 제조방법
KR100194392B1 (ko) 탁산형 디테르펜의 제조방법
JP3019736B2 (ja) タキサン型ジテルペンの製造方法
JP3746550B2 (ja) タキサン型ジテルペンの製造方法
JPH08149984A (ja) タキサン型ジテルペンの製造方法
JP3549594B2 (ja) タキサン型ジテルペンの製造方法
JP2967034B2 (ja) タキサン型ジテルペンの製造方法
JPH08154693A (ja) タキサン型ジテルペンの製造方法
JPH08116981A (ja) タキサン型ジテルペンの製造方法
KR970010602B1 (ko) 주목의 세포배양에 의한 택솔의 생산방법
JPH0856681A (ja) タキサン型ジテルペンの製造方法
JPH06292588A (ja) タキサン型ジテルペンの製造方法
Zalat Plant Tissue and Cell Culture of Taxus Species as a Source of Taxanes
KR20000037548A (ko) 주목나무를 이용한 택솔의 제조방법
JPH11332590A (ja) タキサン型ジテルペンの製造方法
Oommen Production of blue pigments from the callus cultures of Lavandula augustifolia and red pigments (betalain) from the hairy root culture of Beta vulgaris: a thesis presented in partial fulfilment of the requirements for the degree of Master of Technology in Biotechnology at Massey University, Palmerston North, New Zealand
JPH0856680A (ja) タキサン型ジテルペンの製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
A107 Divisional application of patent
A201 Request for examination
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20120924

Year of fee payment: 15

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20130924

Year of fee payment: 16

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20140926

Year of fee payment: 17

EXPY Expiration of term