KR100194392B1 - 탁산형 디테르펜의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 탁산형 디테르펜을 생성하는 식물의 세포 및/또는 조직을 코로나틴류, 코로나틴류 생성균, 그러한 균류의 배양액 또는 배양액 추출물, 환상 다당류, 지방산, 및 자스몬산의 이미노 또는 아미노 유도체로 된 군으로부터 선택한 적어도 1종 이상의 존재하에서 배양한 후, 생성된 배양물로부터 탁산형 디테르펜을 회수하는 탁산형 디테르펜의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

탁산형 디테르펜의 제조방법
본 발명은 난소암, 유암, 폐암등의 치료약으로서 유용한 탁솔을 함유한 탁산형 디테르펜의 제조방법에 관한 것이다.
난소암, 유암, 폐암등의 치료약으로서 유용한 탁솔은 주목과 주목속 식물인 태평양 주목(Taxus brevifolia NUTT)로부터 단리 동정된 탁산형 디테르펜이며, 상기 약리활성과 관련한 복잡한 에스테르기를 가지고 있다. 탁솔은 태평양 주목(NUTT) 식물체중의 어느 부위에도 존재하나, 수피가 가장 많은 탁솔의 함량을 가지고 있다는 것이 보고되어 있다. 현재, 탁솔은 천연 또는 재배된 식물체로부터 채취하고 있으나, 주목속 식물은 지상 20㎝의 높이로 성장하는데 10년 이상이 걸리는 생육이 더딘 식물이며, 또한 수피를 벗기면 나무가 말라버리기 때문에 다량의 탁솔을 얻기가 용이하지 않다. 만일 탁솔 및/또는 탁솔의 전구물질인 바카틴 III(baccatin III)등의 탁산형 디테르펜을 조직배양을 이용해서 합성할 수 있으면 수목을 벌채하는 일이 없이 다량의 탁솔을 얻을 수 있으므로 유리하다.
이제까지의 식물의 배양세포를 이용한 탁솔의 생산방법으로서는 미국 특허인 태평양 주목(NUTT)(미국 특허 제5,019,504호) 배양세포에 의한 생산법이 개시되어 있으나, 거기에 기재된 탁솔 생산량은 1∼3㎎/1로 되어 있어, 공업적 생산으로서는 불충분하다. 또한 종래의 조직배양 기술을 이용한 세포배양에 의한 탁솔의 생산성은 불안정하며, 선택에 의해 1차적으로는 생산성이 높은 세포가 얻어지나, 계대배양(subculturing)헤서 그 함량을 유지하기가 어렵다[E.R.M.Wickremesine et al., World Congress on cell and Tissue Culture(1992)].
한편, 탁솔 생산법의 선행기술로서는 탁솔의 생합성 전구체인 바카틴III로부터의 반합성법이 홀톤등의 미국 특허 제5,015,744호 명세서에 개시되어 있다. 식물의 조직배양법을 이용하면 바카틴 III등의 반합성 원료의 생산도 가능하여, 상기 반합성법에 의한 탁솔 생산에도 이용할 수 있다.
본 발명의 목적은 식물조직배양에 의한 탁산형 디테르펜의 간편한 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명자들은 예의 연구한 결과, 탁산형 디테르펜을 생성하는 식물의 배양세포 또는 배양조직을 코로나틴류, 코로나틴류 생성균, 그러한 균류의 배양액 또는 그러한 균류의 배양 추출물, 환상다당류, 지방산 또는 자스민산의 이미노 또는 아미노 유도체를 함유한 배지에서 배양하면 배양물중의 탁산형 디테르펜의 생산성이 향상함을 발견하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
따라서 본 발명은 탁산형 디테르펜을 생성하는 식물의 세포 및/또는 조직을 코로나틴류, 코로나틴류 생성균, 그러한 균류의 배양액 또는 배양 추출물, 환상다당류, 지방산 및 다음의 일반식(X)으로 표시되는 화합물:
[식 중에서 Y는 수소원자, 수산기, 시아노기, NR28aR28b(여기서 R28a및 R28b는 각각 독립적으로 수소원자, 카르바모일기, 탄소수 1∼12의 아실기, 탄소수 1∼12의 알킬기, 아릴기, 치환기를 갖는 아릴기, 아릴알킬기, 치환기를 갖는 아릴알킬기 또는 탄소수 1∼12의 알킬설포닐기를 표시한다), OR29(여기서 R29는 탄소수 1∼12의 아실기, 탄소수 1∼12의 알킬기, 아릴기, 치환기를 갖는 아릴기, 아릴알킬기 또는 치환기를 갖는 아릴알킬기이다), -CO-R30(여기서 R30은 수소원자, 아미노기, 탄소수 1∼12의 알킬아미노기를 표시한다), 탄소수 1∼12의 알킬기, 아릴기, 치환기를 갖는 아릴기, 아릴알킬기, 치환기를 갖는 아릴알킬기, 아미노설포닐기 또는 탄소수 1∼12의 알킬설피닐기이고;
R1a, R1b, R1c, R1d, R1e및 R1f는 각각 독립적으로 수소원자, 수산기, 탄소수 1∼12의 알킬기, 탄소수 1∼12의 알콕시기, 아릴기, 치환기를 갖는 아릴기, 아릴알킬기 또는 치환기를 갖는 아릴알킬기를 표시하고;
R20, R21, R22, R23및 R24는 각각 독립적으로 수소원자, 수산기, 탄소수 1∼12의 알킬기, 아릴기, 치환기를 갖는 아릴기, 아릴알킬기 또는 치환기를 갖는 아릴알킬기를 표시하고;
C1-C2-C3-C4-C5-C6으로 된 측쇄는 1개 또는 2개이상의 2중 결합을 함유하여도 좋으며;
R25는 수산기, OM(여기서 M은 알칼리 금속원자, 알칼리 토류금속원자 또는 NH4이다), NR26aR26b(여기서 R26a및 R26b는 각각 독립적으로 수소원자, 탄소수 1∼12의 아실기, 탄소수 1∼12의 알킬기, 아릴기, 치환기를 갖는 아릴기, 아릴알킬기, 치환기를 갖는 아릴알킬기 또는 아미노산 잔기를 표시한다), OR27(여기서 R27은 탄소수 1∼12의 알킬기, 아릴기, 치환기를 갖는 아릴기, 아릴알킬기, 치환기를 갖는 아릴알킬기 또는 탄수화물 잔기를 표시한다), 탄소수 1∼12의 알킬기, 아릴기, 치환기를 갖는 아릴기, 아릴알킬기 또는 치환기를 갖는 아릴알킬기를 표시하고;
n은 1∼7의 정수이고;
상기 5원환은 인접하는 탄소원자간에 2중결합을 형성하여도 좋다],
또는 다음의 일반식(XI)로 표시되는 화합물:
[식 중에서 R1a, R1b, R1c, R1d, R1e, R1f및 R1g는 각각 독립적으로 수소원자, 수산기, 탄소수 1∼12의 알킬기, 탄소수 1∼12의 알콕시기, 아릴기, 치환기를 갖는 아릴기, 아릴알킬기 또는 치환기를 갖는 아릴알킬기를 표시하고;
R20, R21, R22, R23및 R24는 각각 독립적으로 수소원자, 수산기, 탄소수 1∼12의 알킬기, 아릴기, 치환기를 갖는 아릴기, 아릴알킬기 또는 치환기를 갖는 아릴알킬기를 표시하고;
C1-C2-C3-C4-C5-C6으로 된 측쇄는 1개 또는 2개 이상의 2중결합을 함유하여도 좋으며;
R25는 수산기,OM(여기서 M은 알칼리 금속원자, 알칼리 토류금속원자 또는 NH4이다), NR26aNR26b(R26a및 R26b는 각각 독립적으로 수소원자, 탄소수 1∼12의 아실기, 탄소수 1∼12의 알킬기, 아릴기, 치환기를 갖는 아릴기, 아릴알킬기, 치환기를 갖는 아릴알킬기 또는 아미노산 잔기를 표시한다), OR27(R27은 탄소수 1∼12의 알킬기, 아릴기, 치환기를 갖는 아릴기, 아릴알킬기, 치환기를 갖는 아릴알킬기 또는 탄수화물 잔기를 표시한다), 탄소수 1∼12의 알킬기, 아릴기, 치환기를 갖는 아릴기, 아릴알킬기 또는 치환기를 갖는 아릴알킬기를 표시하고;
n은 1∼7의 정수이고;
R31a및 R31b는 각각 독립적으로 수소원자, 수산기, 탄소수 1∼12의 아실기, 탄소수 1∼12의 알킬기, 탄소수 1∼12의 알콕시기, 아릴기, 치환기를 갖는 아릴기, 아릴알킬기, 치환기를 갖는 아릴알킬기 또는 아미노산 잔기를 표시하고;
상기 5원환은 인접하는 탄소원자간에 2중결합을 형성하여도 좋다],
로 된 군으로부터 선택된 적어도 1종 이상의 존재하에 배양하여 얻어진 배양물로부터 탁산형 디테르펜을 회수하는 탁산형 디테르펜의 제조방법이다.
본 발명의 제조방법의 대상이 되는 탁산형 디테르펜은 탁산 골격을 갖는 디테르펜이면 특히 제한이 없으며, 구체적으로는 탁솔, 10-데아세틸탁솔, 7-에피탁솔, 바카틴III, 10-데아세틸바카틴 III, 7-에피바카틴 III, 세팔로마닌, 10-데아세틸세팔로마닌, 7-에피세팔로마닌, 바카틴 VI, 탁산 1a, 크실로실세팔로마닌, 크실로실탁솔, 탁솔 C, 10-데아세틸탁솔 C, 탁시신 I, 탁시신 II, 탁신 I, 탁신 II, 탁사기핀등을 예시할수 있다.
본 발명에 사용되는 탁산형 디테르펜을 생성하는 식물로서는, 예를 들어 서양주목(Taxus baccata LINN), 주목(Taxus cuspidata SIEB, et ZUCC), 두루잎가라목(Taxus cuspidata SIEB. et ZUCC var. nana REHDER), 태평양주목(Taxus brevifolia NUTT), 캐나다주목(Taxus canadensis MARSH), 중국주목(Taxus chinesis), 메디아주목(Taxus media)등의 주목속 식물을 들 수 있다. 이들 중에서도 서양주목 및 메디아주목이 특히 바람직하다.
상기 식물의 조직배양은 본 발명에 의해 코로나틴류, 코로나틴류 생성균, 그러한 균류의 배양액 또는 그러한 균류의 배양 추출물, 환상다당류, 지방산 및 상기 일반식(X)또는 (XI)로 표시된 화합물의 첨가 이외에는 종래로부터 알려져 있는 방법에 의해 실시한다.
본 발명에 사용되는 코로나틴류는 슈도모나스균(Pseudomonas bacterium)이 생산하는 클로로시스(chlorosis) 유도물질로서 발견되어, 식물에 대한 괴사(necrosis), 에틸렌의 생성축진 또는 노화촉진을 유도하는 활성이 있다. 또한 코로나틴류는 자스몬산과 마찬가지로 감자의 줄기(tuber)를 비대촉진하는 활성도 가지고 있다.
코로나틴류 생성균으로서는 슈도모나스균 및 크산토모나스균(Xanthomonas bacteria)이 알려져 있다. 슈도모나크으로서는 P. syringae(IFO 3310), P. glycinea, P. tabaci(IFO 3508, IFO 14081), P. aptata(IFO 12655), P. coronafaciens, P. phaseolicola(IFO 12656, IFO 14078), P. mori(IFO 14053, IFO 14054, IFO 14055), P. helianthi(IFO 14077)등을 예시할수 있다. 크산토모나스균으로서는 X. campestris(IFO 13303, IFO 13551), X. citri, X. cucurbitae(IFO 13552), X. phaseoli(IFO 13553, IFO 13554), X. pruni(IFO 3780, IFO 13557)등을 예시할 수 있다.
코로나틴류로서는 다음의 일반식(I);
또는 일반식(II)
[식 중에서 R1은 수산기, OR2(R2는 탄소수 1∼6의 알킬기 또는 탄수화물 잔기를 표시한다), OM1(M1은 알칼리 금속원자, 알칼리 토류금속원자 또는 NH4를 표시한다), 또는 NR3aR3b(R3a및 R3b는 각각 독립적으로 수소원자, 탄소수 1∼6의 아실기, 탄소수 1∼6의 알킬기, 아미노산 잔기, 또는 다음의 일반식(III);
(R4는 수소원자, 수산기, 탄소수 1∼6의 알킬기, 탄소수 1∼6의 알콕시기 또는 다음식:
-CO-R7
(R7은 수산기, OM2(M2는 알칼리 금속원자, 알칼리토류금속원자 또는 NH4를 표시한다), NR8aR8b(R8a및 R8b는 각각 독립적으로 수소원자, 탄소수 1∼6의 아실기, 탄소수 1∼6의 알킬기 또는 아미노산 잔기), 또는 OR9(R9은 탄소수 1∼6의 알킬기 또는 탄수화물 잔기를 표시한다)를 표시한다);
R5a, R5b, R6a및 R6b는 각각 독립적으로 수소원자, 수산기, 탄소수 1∼6의 알킬기 또는 탄소수 1∼6의 알콕시기를 표시하고);
R10a, R10b, R11a, R11b, R12, R13, R14a, R14b, R15a, R15b, R16a, R16b, R17및 R19는 각각 독립적으로 수소원자, 수산기, 탄소수 1∼6의 알킬기, 또는 탄소수 1∼6의 알콕시기를 표시하고;
R18은 수소원자, 탄소수 1∼6의 알킬기, 또는 탄수화물 잔기를 표시하고;
식중의 5원환 및 6원환은 인접하는 탄소원자간에 2중결합을 형성하여도 좋다]
로 표시되는 화합물을 들 수 있다.
상기 일반식 (I), (II) 및 (III)에서 R2, R3a, R3b, R4, R5a, R5b, R6a, R6b, R8a, R8bR9, R10a, R10b, R11a, R11b, R12, R13, R14a, R14b, R15a, R15b, R16a, R16b, R17, R18또는 R19로 표시되는 탄소수 1∼6의 알킬기의 예로서는 메틸기, 에틸기, n-프로필기, 이소프로필기, n-부틸기, 이소부틸기, sec-부틸기, t-부틸기, n-펜틸기, 네오펜틸기, t-펜틸기, n-헥실기 및 이소헥실기를 들 수 있다.
상기 일반식(I), (II) 및 (III)에서 R4, R5a, R5b, R6a, R6b, R10a, R10b, R11a, R11b, R12, R13, R14a, R14b, R15a, R15b, R16a, R16b, R17또는 R19로 표시되는 탄소수 1∼6의 알콕시기의 예로서는 메톡시기, 에톡시기, n-프로폭시기, 이소프로폭시기, n-부톡시기, 이소부톡시기, sec-부톡시기, t-부톡시기, n-펜틸옥시기, 네오펜틸옥시기, t-펜틸옥시기, n-헥실옥시기 및 이소헥실옥시기를 들 수 있다.
R1또는 R7이 OM1또는 OM2인 경우에는 M1또는 M2로 표시되는 알칼리 금속원자 또는 알칼리 토류금속원자의 예로서는 나트륨, 칼륨 및 칼슘을 들 수 있다.
R1또는 R7이 NR3aR3b또는 NR8aR8b인 경우에는 R3a, R3b, R8a또는 R8b표시되는 탄소수 1∼6의 아실기는 직쇄 또는 분기쇄중의 어느 것이어도 좋으며, 그 예로서는 포르밀기, 아세틸기, 프로피오닐기, 부티릴기, 발레릴기, 헥사노일기 및 아크릴오일기를 들 수 있다.
R1또는 R7이 NR3aR3b또는 NR8aR8b인 경우에는 R3a, R3b, R8a또는 R8b로 표시되는 아미노산 잔기의 예로서는 이소로이실기, 발릴기, 글루타밀기 및 리실기를 들 수 있다.
R1또는 R7이 OR2또는 OR9인 경우에는 R2또는 R9로 표시되는 탄수화물 잔기의 예로서는 글루코피라노실기를 들 수 있다.
상기 일반식(II)에서 R18로 표시되는 탄수화물 잔기의 예로서는 글루코피라노실기를 들 수 있다.
코로나틴류의 바람직한 예로서는 코로나틴(식 IV) 및 코로나파식산(식 V)를 들 수 있다.
코로나파식산과 2-에틸-1-아미노시클로프로판-1-카르복실산이 아미드결합으로 연결된 화합물인 코로나틴은 일반식(I)로 표시되는 화합물중에서도 활성이 가장 강하다.
본 발명에서 사용되는 코로나틴류에는 여러 가지 입체이성체(시스트란스 이성체 및 광학 이성체)가 존재하나, 이성체를 단독으로 사용하여도 좋고 혼합물의 형태로 사용하여도 좋다.
코로나틴류, 코로나틴류 생성균, 그러한 균류의 배양액 또는 배양 추출물을 배지에 첨가할 경우에는 코로나틴류의 배지에서의 농도는 통상 0.001∼1000μM로 할 필요가 있으며, 본 발명에서는 0.01∼100μM의 범위로 코로나틴류의 농도를 조정하는 바람직하다.
상기한 식물의 세포 및/또는 조직을 본 발명에 의해 코로나틴류, 코로나틴류 생성균, 그러한 균류의 배양액 또는 배양 추출물로부터 선택된 적어도 1종 이상을 함유한 배지를 이용하여 배양하면 첨가하지 않을 경우와 비교해서 탁산형 디테르펜의 고생산성 배양세포 및/또는 배양조직이 얻어진다.
식물세포 배양물에 코로나틴류를 첨가하면 어떤 종류의 2차 대사(secondary metabolism)에 관여하는 생합성계가 활성화됨에 보고되어 있으나[W. Weiler et al., FEBS Letters 345:1(1994)], 탁산형 디테르펜 생성 식물의 조직배양에서 배지 첨가물로서 코로나틴류의 존재하에 조직배양을 한 예는 보고되어 있지 않으며, 더구나 그것에 의해 탁산형 디테르펜의 생성량이 증대한다는 것은 예상외의 것이었다.
주목속 식물의 배양세포에 미생물 또는 미생물 배양추출물을 유도인자(elicitor)로서 이용하여 탁산형 디테르펜의 생산성을 높이는 방법은 국제 특허공보 WO 93/17121 및 미국 특허 제5019504호에 명기되어 있다. 그러나 그러한 특허공보에는 유도인자라고 개재되어 있지만, 효과의 정도에 대해서는 명백히 기재된 것이 없다. 또한 이들 특허에는 본 발명에서 사용하는 코로나틴 생성균인 슈도모나스속 또는 크산토모나스속에 관한 개재도 없다. 따라서 코로나티류 생성균, 또는 그러한 균류의 배양액 또는 배양 추출물의 존재하에 주목속 식물의 세포를 배양하여 탁산형 디테르펜의 생성량이 증대하는 것은 예상외의 것이었다.
코로나틴 생성균의 증식은 일반세균 증식용 배지 또는 최소 배지에서 실시한다.
본 발명에서 사용하는 코로나틴 생성균의 배양액의 예로서는 이들 균류를 배양한 후의 배양액을 무균 여과한 것을 들 수 있다.
본 발명에서 사용하는 코로나틴 생성균의 배양 추출물의 구체적인 예로서는 이들 균류를 배양한 후의 배양액을 120℃에서 15분간 오토클레이브한 것, 또는 이들 균류의 배양액을 산성조건에서 초산에틸등의 유기용매에 의해 추출한 것, 나아가서는 코로나틴 또느 코로나파식산을 함유한 획분으로서 Sephandex LH20 칼럼에 의해 부분 정제한 것을 들 수 있다.
코로나틴류, 코로나틴류 생성균, 그러한 균류의 배양액 또는 배양 추출물은 배양세포가 지수증식기 내지 정상기에 첨가하는 것이 효과적이며, 특히 지수증식기로부터 정상기로 이행하는 시기에 첨가하는 것이 본 발명의 방법에서 바람직하다. 예를 들어 세포를 21일마다 이식하고 있는 경우에는 7∼16일째가 코로나틴류, 코로나틴류 생성균, 그러한 균류의 배양액 또는 배양 추출물을 첨가함에 적당한 시기이다. 첨가방법으로서는 한꺼번에 소정의 양을 첨가하여도 좋고, 수회로 나우어서 축차 첨가하여도 좋다.
다음에 본 발명에서 사용하는 환상 다당류의 구체적인 예로서는 사이클로덱스린, 사이클로프락탄 및 그것들의 유도체를 들 수 있다.
환상다당류는 환상구조이기 때문에 내부에는 공동이 있으며, 공동 개구부와 외측은 친수성, 환의 내측은 소수성을 나타내고, 이 공동내에 유성물질등을 도입하는 포접작용(clathrate activity)이 있다. 이 성질을 이용하여 물에 난용성의 물질을 수용성으로 바꾼다거나, 불안정 물질의 안정화, 향료등의 휘발성 물질의 유지, 특이한 냄새의 억제등 많은 용도가 있으며, 상업적으로는 동결 건조 홍차, 햄소세지등의 식품의 특이한 냄새를 억제하는 데 사용되고 있다.
사이클로 덱스트린은 글루코스 6∼8개가 도넛형으로 결합한 물질로서, Bacillus macerans 등의 특수한 미생물이 생성하는 사이클로 덱스트린 합성효소의 작용에 의해 전분으로부터 합성된다. 사이클로 프락탄은 프락토스 6∼8개가 도넛형으로 결합한 물질로서, Bacillus circulans등의 특수한 미생물이 생성하는 사이클로프락탄 합성효소의 작용에 의해 이눌린으로부터 합성된다.
본 발명의 대상이 되는 사이클로덱스트린 및 그 유도체의 예로서는 α-사이클로덱스트린, β-사이클로덱스트린, γ-사이클로덱스트린, 또는 그것들의 분기 덱스트린, 부분메틸화 덱스트린을 들 수 있으며, 그 중의 어느 것이나 이용 가능하다. 분기 사이클로덱스트린의 예로서는 글리코실-α-사이클로덱스트린, 말토실-α-사이클로덱스트린, 말토트리오실-α-사이클로덱스트린, 글리코실-β-사이클로덱스트린, 글리코실-γ-사이클로덱스트린, 갈락토실-α-사이클로덱스트린등, 환에 당이 분기로서 결합한 것을 들 수 있다. 사이클로프락탄 또는 그 유도체로서는 과당 6∼8개가 β2-1 프럭토시드결합에 의해 결합된 화합물, 그것들의 분기 사이클로프락탄, 부분메틸화 사이클로프락탄이 이용 가능하다.
상기 환상 다당류의 배지에서의 농도는 0.01∼50mM가 바람직하며, 본 발명에서는 환상 다당류의 농도를 특히 0.1∼30mM의 범위로 조정하는 것이 바람직하다.
상기한 식물의 세포 및/또는 조직을 본 발명에 의해 환상 다당류를 첨가한 배지를 이용하여 조직배양하면 첨가하지 않은 경우와 비교해서 탁산형 디테르펜의 고생산성 배양세포 또는 배양조직이 얻어진다.
탁산형 디테르펜 생성 식물의 조직배양에서 배지 첨가물로서 환상 다당류의 존재하에 조직배양을 한 예는 보고되어 있지 않으며, 더구나 그것에 의해 탁산형 디테르펜의 배지로의 누출이 촉진되고, 또한 생성량이 증대한다는 것은 예상외의 것이었다.
특히 환상 다당류 및 기타의 생산성 향상물질(유도인자)를 함께 사용하면 높은 효과를 얻을 수 있다. 그러한 생산성 향상물질의 예로서는 코로나틴류, 코로나틴 생성균, 그러한 균류의 배양액 또는 배양 추출물, 지방산류 또는 본 발명의 일반식(X) 또는 일반식(XI)으로 표시되는 화합물뿐 아니라 하기의 자스몬산, 그 알킬 에스테르, 중금속, 일본국 특원평6-252528호에 기재된 아민 및 안티에틸렌제를 들 수 있다. 또한 일본국 특원평 6-146826호에 기재된 바와 같이 낮은 산소 농도의 환경하에서 환상 다당류를 병용하여 배양하면 특히 효과가 크다.
다음에 본 발명에 사용하는 지방산류의 예로서는 주쇄의 탄소수가 10∼22의 합성 또는 천연 지방산을 들 수 있으며, 그들 중에서도 주쇄의 탄소수가 우수인 지방산이 바람직하다. 이들 지방산은 포화된 것이어도 좋고, 또 탄소쇄중에 1개 또는 2개이상의 2중 결합을 포함한 불포화 지방산이어도 좋다. 또 탄소쇄에 결합되어 있는 수소원자 중에서 1개 또는 2개 이상이 탄소수 1∼6의 탄화수소기, 수산기 또는 아미노기로 치환되어 있어도 좋다. 상기 불포화 지방산에 포함된 2중 결합은 시스형, 트란스형, 또는 양자의 혼합형이어도 상관없으나, 시스형 2중결합을 포함한 지방산이 바람직하다.
상기 지방산의 구체적인 예로서는 카프린산, 데센산, 라우린산, 도데센산, 미리스틴산, 미리스토올레인산 팔미틴산, 팔미토올레인산, 스테아린산, 올레인산, 박센산, 리놀산, α-리놀렌산, γ-리놀렌산, 테트라옥타데센산, 아라킨산, 아라키돈산, 에이코사테트라엔산, 에이코사펜타엔산, 베헨산, 도코사헥사엔산등의 직쇄 지방산, 리시놀산등의 히드록시 지방산, 14-메틸팔미틴산등의 분기 지방산을 들 수 있다. 이들 중에서도 올레인산, 리놀산, 리놀렌산 및 아라키돈산이 바람직하며, 특히 α-리놀렌산이 바라직하다.
치환기중에서 탄소수 1∼6의 탄화수소기의 예로서는 메틸기, 에틸기, 프로필기, 시클로프로필기, 부틸기, 이소부틸기, 펜틸기 및 헥실기를 들 수 있다.
치환기중에서 아미노기의 예로서는 아미노기, 모노메틸아미노기 및 디메틸아미노기를 들 수 있다.
배지에 첨가하는 지방산류는 다음의 일반식(XII);
R32-COR33(XII)
[식 중에서, R32-CO는 상기의 지방산으로부터 유래하는 원자단을 표시하고;
R33는 OR34(R34는 탄소수 1∼6의 알킬기 또는 탄수화물 잔기를 표시한다), OM(M은 알칼리 금속원자, 알칼리 토류금속원자 또는 NH4를 표시한다), 또는 NR35aR35b(R35a및 R35b는 각각 독립적으로 수소원자, 탄소수 1∼6의 알킬기 또는 아미노산 잔기를 표시한다)를 표시한다]
로 표시되는 지방산 유도체이어도 좋다.
상기 일반식(XII)에서, R34, R35a및 R35b로 표시된 탄소수 1∼6의 알킬기의 예로서는 메틸기, 에틸기, n-프로필기, 이소프로필기, n-부틸기, 이소부틸기, sec-부틸기, t-부틸기, n-펜틸기, 이소펜틸, 네오펜틸기, t-펜틸기, n-헥실기 및 이소헥실기를 들 수 있다.
R33이 OM인 경우에, M으로 표시되는 알칼리 금속원자 또는 알칼리 토류금속원자의 예로서는 나트륨, 칼륨 및 칼슘을 들 수 있다.
R33이 NR35aR35b인 경우에, R35a또는 R35b로 표시되는 아미노산 잔기의 예로서는 글리실기, 로이실기, 글루타밀기, 리실기, 페닐알라닐기, 이소로이실기, 티로실기 및 트립토필기를 들 수 있다.
R33이 OR34인 경우에, R34로 표시되는 탄수화물 잔기의 예로서는 글루코피라노실기를 들 수 있다.
본 발명에 사용하는 지방산 및/또는 그 유도체는 0.01∼1000μM의 농도로 배지에 첨가하는 것이 바람직하며, 또 0.1∼500μM의 농도 범위로 첨가하는 것이 탁산형 디테르펜의 생산성 향상의 효과면에서 특히 바람직하다(2종 이상의 지방산 및/또는 유도체를 혼합해서 사용할 경우에는 상기에 나타낸 농도 범위는 합계의 첨가 농도를 표시한다).
본 발명에서는 지방산을 함유한 천연유 또는 그 효소 가수분해물을 사용할 수도 있다. 천연유의 예로서는 평지종유(rapeseed oil), 두유(soybean oil), 아마인유(linseed oil) 및 홍화유(safflower oil)등의 식물유를 들 수 있으며, 효소 가수분해물의 예로서는 리파제로 분해한 상기 식물유를 들 수 있다. 상기 천연유 또는 효소 가수분해물의 배지에서의 농도는 1∼1000㎎/1의 범위가 바람직하다.
지방산류를 계외(系外)로부터 첨가하는 외에 배지에 지질분해효소를 첨가함으로써 상기 조직 및/또는 세포를 구성하는 글리세로지질등의 지질을 일부 가수분해하여 지방산을 배지에서 유리시킬 수도 있다. 지질분해효소의 예로서는 리파제, 포스포리파제 A1, 포스포리파제 A2 및 포스포리파제 B를 들 수 있으며, 산성영역에서 최적 pH를 갖는 포스포리파제 A1, 포스포리파제 A2 및 포스포리파제 B가 특히 바람직하다. 본 발명에서는 상기 효소의 배지에의 첨가 농도는 배지 용량당 0.1∼100㎎/1가 바람직하다.
본 발명에서는 상기 조건을 충족시키는 지방산, 그 유도체, 천연유 및 지질분해효소를 단독으로 사용하여도 좋고, 각각을 임의로 조합하여 사용하여도 좋다.
지방산 또는 그 유도체, 천연유 또는 지질분해효소는 배양 초기부터 배지에 첨가하여도 좋고, 배양 도중에 첨가하여도 좋다. 또 배양중 임의의 시기에 일괄해서 첨가하여도 좋고, 복수회로 나누어서 첨가하여도 좋다.
상기의 지방산류 및 천연유의 배지에의 첨가방법이 구체적인 예로서는 에타놀등의 유기용매에 용해시켜 첨가하는 방법, 옥틸-β-D-글루코시드등의 계면 활성제와 함께 첨가하는 방법, 또는 배지에 직접 첨가한 후에 초음파 처리등에 의해 미셀 형성(micelle formation)하는 방법을 들 수 있다. 또 배지에 직접 첨가하여 유수분리한 상태에서 배양을 실시할 수도 있다.
다음에 본 발명에서 사용하는 자스몬산류의 이미노 또는 아미노 유도체는 각각 일반식(X) 또는 (XI)의 화합물이다.
상기 일반식(X) 또는 (XI)에서, R1a, R1b, R1c, R1d, R1e, R1f, R1g, R20, R21, R22, R23, R24, R25, R28a, R28b, R29, R26a, R26b, R27, R31a, R31b또는 Y로 표시되는 탄소수 1∼12의 알킬기의 예로서는 메틸기, 에틸기, n-프로필기, 이소프로필기, n-부틸기, 이소부틸기, sec-부틸기, t-부틸기, n-펜틸기, 헥실기, 헵틸기, 옥틸기, 노닐기, 데실기, 운데실기, 및 도데실기를 들 수 있다. 또 탄소수 3이상의 알킬기는 시클로프로필기, 시클로부틸기, 시클로펜틸기, 및 시클로헥실기등의 환상 알킬을 포함한다.
상기 일반식(X) 또는 (XI)에서, R1a, R1b, R1c, R1d, R1e, R1f, R1g, R31a또는 R31b로 표시되는 탄소수 1∼12의 알콕시기의 예로서는 메톡시기, 에톡시기, n-프로폭시기, 이소프로폭시기, n-부톡시기, 이소부톡시기, sec-부톡시기, t-부톡시기, 펜틸옥시기, 헥실옥시기, 헵틸옥시기, 옥틸옥시기, 노닐옥시기, 데실옥시기, 운데실옥시기 및 도데실옥시기를 들수 있다. 또 탄소수 3이상의 알콕시기는 시클로프로필기, 시클로부틸기, 시클로펜틸기, 및 시클로헥실기등의 환상 알킬을 함유한 알콕시기를 포함한다.
상기 일반식(X) 또는 (XI)에서, R28a, R28b, R26a, R26b, R29, R31b로 표시되는 탄소수 1~12의 아실기는 직쇄 또는 분기쇄를 가져도 좋고, 방향족이어도 되며, 그예로서는 포르밀기, 아세틸기, 프로피오닐기, 부티릴기, 발레릴기, 헥사노일기, 아크릴로일기, 카프릴로일기, 펠라르고닐기, 벤조일기, 톨루오일기, 살리실로일기 및 신나모일기를 들 수 있다.
상기 일반식(X) 또는 (XI)에서, R1a, R1b, R1c, R1d, R1e, R1f, R1g, R20, R21, R22, R23, R24, R25, R28a, R28b, R29, R26a, R26b, R27, R31a, R31b또는 Y로 표시되는 아릴기 또는 치환기를 갖는 아릴기의 예로서는 페닐기, p-메톡시페닐기, p-클로로페닐기, p-플루오로페닐기 및 나프틸기를 들 수 있다.
상기 일반식(X) 또는 (XI)에서, R1a, R1b, R1c, R1d, R1e, R1f, R1g, R20, R21, R22, R23, R24, R25, R28a, R28b, R29, R26a, R26b, R27, R31a, R31b또는 Y로 표시되는 아릴알킬기 또는 치환기를 갖는 아릴알킬기의 예로서는 벤질기, p-메톡시벤질기, p-클로로벤질기 및 p-플루오로벤질기를 들 수 있다.
상기 일반식(X)또는 (XI)에서 R25가 OM인 경우에, M으로 표시되는 알칼리 금속원자 또는 알칼리 토류금속원자의 예로서는 나트륨, 칼륨 및 칼슘을 들 수 있다.
상기 일반식(X)에서 R28a또는 R28b로 표시되는 탄소수 1∼12인 알킬설포닐기의 예로서는 메틸설포닐기, 에틸설포닐기, n-프로필설포닐기 및 이소프로필설포닐기를 들 수 있다.
상기 일반식(X)에서 R29가 -CO-R30인 경우에, R30으로 표시되는 탄소수 1∼12인 알킬아미노기의 예로서는 메틸아미노기, 에틸아미노기, n-프로필아미노기 및 이소프로필아미노기를 들 수 있다.
상기 일반식(X)에서 R28a또는 R28b로 표시되는 탄소수 1∼12인 알킬설피닐기의 예로서는 메틸설피닐기, 에틸설피닐기, n-프로필설피닐기 및 이소프로필설피닐기를 들 수 있다.
상기 일반식(X)또는 (XI)에서 R25가 NR26aR26b인 경우에, R26a또는 R26b로 표시되는 아미노산 잔기의 예, 및 상기 일반식(XI)에서 R31a또는 R31b로 표시되는 아미노산 잔기의 예로서는 이소로이실기, 트로실기 및 트립토필기를 들 수 있다.
상기 일반식(X) 또는 (XI)에서 R25가 OR27인 경우에, R27로 표시되는 탄수화물 잔기의 예로서는 글루코피라노실기를 들 수 있다.
일반식(X) 또는 (XI)으로 표시된 화합물에서, 5원환은 인접하는 탄소원자간에 2중결합을 형성하여도 좋다.
일반식(X)로 표시된 화합물의 구체적인 예로서는 다음에 나타내는 화합물등을 들 수 있다;
(화합물 A)
Y : -OH
R1a, R1b, R1c, R1d, R1e, R1f, R20, R21, R22, R23, R24: H
C3및 C4사이에 2중결합 형성.
R25: -OCH3
n : 1
(화합물 B)
Y : -OCH3
R1a, R1b, R1c, R1d, R1e, R1f, R20, R21, R22, R23, R24: H
C3및 C4사이에 2중결합 형성.
R7: -OCH3
n : 1
(화합물 C)
Y : -NH2
R1a, R1b, R1c, R1d, R1e, R1f, R20, R21, R22, R23, R24: H
C3및 C4사이에 2중결합 형성.
R7: -OCH3
n : 1
(화합물 D)
Y : -NHCONH2
R1a, R1b, R1c, R1d, R1e, R1f, R20, R21, R22, R23, R24: H
C3및 C4사이에 2중결합 형성.
R7: -OCH3
n : 1
(화합물 E)
Y : -NHCHO
R1a, R1b, R1c, R1d, R1e, R1f, R20, R21, R22, R23, R24: H
C3및 C4사이에 2중결합 형성.
R7: -OCH3
n : 1
(화합물 F)
Y : -NHSO2CH3
R1a, R1b, R1c, R1d, R1e, R1f, R20, R21, R22, R23, R24: H
C3및 C4사이에 2중결합 형성.
R7: -OCH3
n : 1
(화합물 G)
Y : -CN
R1a, R1b, R1c, R1d, R1e, R1f, R20, R21, R22, R23, R24: H
C3및 C4사이에 2중결합 형성.
R7: -OCH3
n : 1
(화합물 H)
Y : -SO2NH2
R1a, R1b, R1c, R1d, R1e, R1f, R20, R21, R22, R23, R24: H
C3및 C4사이에 2중결합 형성.
R7: -OCH3
n : 1
일반식(XI)로 표시된 화합물의 구체적인 예로서는 다음에 나타내는 화합물을 들 수 있다;
(화합물 I)
R1a, R1b, R1c, R1d, R1e, R1f, R1g, R20, R21, R22, R23, R24, R31a: H
R31b: -OH
C3및 C4사이에 2중결합 형성.
R25: -OCH3
n : 1
본 발명에서 사용하는 일반식(X) 또는 (XI)로 표시된 화합물에는 여러 가지 입체이성체가 존재하며, 각 이성체를 단독으로 사용하여도 좋고, 혼합물의 형태로 사용하여도 좋다. 화합물 A∼H의 측쇄중에서 이소펜테닐기 및 메톡시카르보닐메틸기는 시스구조인 것이 바람직하다.
일반식(X) 또는 (XI)로 표시된 화합물은 자스몬산류에 암모니아 유도체를 부가 반응시키는 방법등에 의해 용이하게 제조된다(예를 들어 일본화학회편 신실험화학강좌 14. 유기화합물의 합성과 반응 [III]참조).
암모니아 유도체의 구체적인 예로서는 히드록실아민, 페닐히드라진, 세미카르바지드, O-메틸히드록실아민, O-에틸히드록실아민, 포름 히드라지드, 메탄설포닐히드라지드등과 그것들의 염을 들 수 있다. 염을 사용할 경우에는 필요에 따라 카르보닐 유도체(자스몬산류)의 존재하에서 초산 나트륨 또는 초산칼륨을 첨가하여 염으로부터 염기성의 시약을 유리시킨다.
부가반응에서는 염기성 질소화합물이 카르보닐기의 탄소를 구핵 공격하는 것이며, 반응액을 적당한 산성으로 조정하는 것이 바람직하다.
이와 같이 하여 얻어진 자스민산류의 이미노 유도체를 다시 수소화 알루미늄리튬, 수소화 시아노붕소나트륨 및 수소화 붕소나트륨등의 복합 수소화합물이나 보란등의 환원제와 반응시킴으로써 자스몬산류의 아미노 유도체를 얻을 수가 있다.
일반식(X) 또는 (XI)로 표시된 화합물의 배지에서의 농도는 0.001∼1000μM가 바람직하며, 특히 농도를 0.1∼500μM의 범위로 조정하는 것이 더욱 바람직하다.
식물세포 배양물에 자스몬산류를 첨가하면 특정한 2차 대사산물의 생성이 촉진됨은 독일특허 DE4122208에 기재되어 있으나, 탁산형 디테르펜의 생성에 관한 보고는 전혀 없다. 본 발명자들은 이미 자스몬산류의 첨가에 의해 배양물중의 탁산형 디테르펜의 생성량이 증대한다는 것을 발견하였으나[일본국 특원평6-104211호, 특원평6-104212호, 특원평7-47580호], 본 발명에 의한 자스몬산류의 이미노 또는 아미노 유도체가 자스몬산류 보다도 높은 생산 촉진 효과가 있다는 것은 예상외의 것이었다.
일반식(X) 또는 (XI)로 표시된 화합물은 배양세포가 지수증식기 또는 정상기에 첨가하는 것이 가장 효과적이며, 특히 지수증식기로부터 정상기로 이행하는 시기에 첨가하는 것이 본 발명의 방법에서 바람직하다. 예를 들어 세포를 21일마다 이식하고 있는 경우에는 7∼14일째가 화합물을 첨가하기에 적당한 시기이다. 첨가방법으로서는 한꺼번에 첨가하여도 좋고, 수회로 나누어서 첨가하여도 좋다.
일반식(X) 또는 (XI)로 표시된 화합물을 사용하여 2단배양을 하는 경우에는 1단째의 배양에서는 화합물을 함유하지 않은 배지에서 세포를 증식후, 2단째의 배양에서 화합물을 첨가해서 배양할 수도 있다. 2단째로 이행하는 세포의 상태는 지수증식기 또는 정상기인 것이 바람직하다.
본 발명에서는 상기한 코로나틴류, 코로나틴 생성균, 그러한 균류의 배양액 또는 배양 추출물, 환상 다당류, 지방산류, 및 일반식(X) 또는 (XI)로 표시된 화합물로 된 군으로부터 선택한 적어도 1종 이상을 함유한 배지에서 세포 또는 조직을 배양하고, 배양조직, 배양세포 및 배지를 포함한 생성된 배양물로부터 탁산형 디테르펜을 회수한다.
본 발명에 사용하는 배지의 예로서는 종래로부터 알려진 식물의 조직배양에 사용되는 배지, 즉 Murashige Skoog의 배지(1962), Linsmajer Skoog의 배지(1965), Woody Plant 배지(1981), Gamborg's B-5배지 및 Mitsui's M-9 배지를 들 수 있다.
이들 배지에 식물호르몬을 첨가하고, 또 필요에 따라 탄소원, 무기성분, 비타민류, 아미노산등을 첨가할 수도 있다.
식물호르몬으로서는, 예를 들어 인돌초산(IAA), 나프탈렌초산(NAA), 및 2,4-디클로로페녹시초산(2,4-D)등의 옥신류, 및 카이네틴, 제아틴 및 디히드로제아틴등의 사이토카이닌류가 사용된다.
탄소원으로서는 슈크로스, 말토스 및 락토스등의 2당류, 글루코스, 프락토스 및 갈락토스등의 단당류, 전분 또는 그러한 당원의 2종류 이상을 적당한 비율로 혼합한 것을 사용할 수 있다.
무기성분의 구체적인 예로서는 인, 질소, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 황, 철, 망간, 아연, 붕소, 동, 몰리브덴, 염소, 나트륨, 옥소 및 코발트를 들 수 있으며, 이들 성분은 예를들어 질산칼륨, 질산나트륨, 질산칼슘, 염화칼륨, 인산수소2칼륨, 인산2수소칼륨, 염화칼슘, 황산마그네슘, 황산나트륨, 황산제1철, 황산제2철, 황산망간, 황산아연, 붕산, 황산동, 몰리브덴산나트륨, 3산화몰리브덴, 옥화칼륨, 염화코발트 등의 화합물의 상태로 첨가할 수 있다.
비타민의 구체적인 예로서는 비오틴, 티아민(비타민 B1), 피리독신(비타민 B6), 판도텐산, 이노시톨 및 니코틴산을 들 수 있다.
아미노산으로서는, 예를 들어 글리신, 페닐알라닌, 로이신, 글루타민, 시스테인등을 첨가할 수 있다.
일반적으로 상기의 성분은 식물호르몬류가 약 0.01∼약 10μM, 탄소원이 약 1∼약 30g/1, 무기성분이 약 0.1μM∼약 100mM, 비타민류 및 아미노산류가 약 0.1∼약 100㎎/1의 농도로 사용된다.
본 발명에서는 액체배지 및 한천이나 겔란 검(gelan gum)등을 통상 0.1∼1% 함유하는 고체배지의 어느 것이나 사용할 수 있으나, 보통 액체배지가 바람직하다.
본 발명의 조직배양에서는 상기 식물의 뿌리, 생장점, 잎, 줄기, 씨앗, 꽃가루, 꽃밥 및 꽃받침등의 조직편 또는 세포, 혹은 이것들을 상기 배지 또는 다른 종래의 배지에 의해 조직배양하여 얻어지는 배양세포를 사용할 수가 있다.
본 발명은 Agrobcterium tumefaciens 또는 Agrovbacterium rhizogenes를 식물조직에 감염함으로써 얻어지는 종양세포 및/또는 모상근에도 적용할 수 있다.
이들 조직 또는 세포를 코로나틴류, 코로나틴 생성균, 그러한 균류의 배양액 또는 배양 추출물, 환상 다당류, 지방산류, 및 일반식(X)또는 (XI)로 표시된 화합물로 된 군으로부터 선택한 적어도 1종 이상의 존재하에서 조직배양하면 화합물을 첨가하지 않거나, 처리하지 않은 경우와 비교해서 탁산형 디테르펜의 고생산성 배양조직 및 배양세포가 얻어진다.
상기와 같은 방법에 의해 얻어진 배양조직, 배양세포 및 배지등의 배양물로부터 메타놀 및 디클로로메탄등의 유기용매에 의한 추출에 의해 탁산형 디테르펜을 분리할 수가 있다. 또한 배지중에 적당한 흡착제나 유기용매를 공존시켜, 연속적으로 탁산형 디테르펜을 회수할 수도 있다.
본 발명에 의한 조직배양의 바람직한 예를 다음에 설명한다.
우선 주목속에 속하는 식물의 식물체, 즉 뿌리, 생장점, 잎, 줄기, 씨앗등을 살균한 후, 겔란 검으로 고화한 Woody Plant Medium의 고체배지상에 놓고, 10∼35℃에서 14∼60일정도 경과시켜 조직편의 일부를 칼루스(callus)화 한다. 이렇게 하여 얻어진 칼루스를 계대배양하면 생육속도가 점차 높아져서 안정화된 칼루스가 얻어진다. 여기서 안정화된 칼루스라 함은 배양중에 칼루스의 일부가 새싹이나 뿌리로 분화하지 않고 칼루스의 상태를 유지하여 세포의 생육속도가 균질한 것을 말한다.
이러한 안정화된 칼루스를 Woody Plant Medium 액체배지등의 증식에 적합한 액체배지에 옮겨서 증식시킨다. 액체배지에서 생육속도가 더욱 증가한다. 본 발명에서는 이 안정화된 칼루스 또는 상기 칼루스를 구성하는 세포는 코로나틴류, 코로나틴 생성균, 그러한 균류의 배양액 또는 배양 추출물, 환상 다당류, 지방산류, 및 일반식(X)또는 (XI)로 표시된 화합물로 된 군으로부터 선택한 적어도 1종 이상을 함유한 고체배지 또는 액체배지에서 배양한다.
본 발명에 의한 조직배양의 배양온도는 통상은 약 10∼약 35℃, 특히 약 23∼약 28℃가 증식속도가 크므로 바람직하다. 배양기간으로서는 14∼42일간이 바람직하다.
본 발명에 의한 배양에서 액체배지를 사용한 경우에는 배양종료후에 배양세포를 데칸테이션 또는 여과등의 방법에 의해 배지로부터 분리하고, 배양세포 및/또는 배지로부터 목적으로 하는 탁산형 디테르펜을 유기용매에 의한 추출등의 방법에 의해 분리할 수가 있다.
본 발명의 효과를 높이는 방법으로서 본 발명의 방법과 일본국 특원평7-47580호, 특원평6-104211호, 특원평6-104212호, 및 특원평6-104213호에 탁산형 화합물의 생산촉진 물질로서 개시되어 있는 자스몬산류의 존재하에 실시하는 배양방법과 병용할 수가 있다.
자스몬산류의 구체적인 예로서는 자스몬산, 그 염, 그알킬 에스테르, 쿠쿠르빈산, 그 염, 그 알킬 에스테르, 투베론산, 그 염 및 그 알킬 에스테르를 들 수 있다.
이들중에서 생산성을 높이는 데 큰 효과가 있는 점에서 특히 바람직한 화합물로서는 자스몬산, 자스몬산 메틸, 투베론산, 투베론산 메틸 및 쿠쿠르빈산 또는 쿠쿠르빈산메틸을 예시할수 있다.
본 발명에서 사용하는 자스민산류는 모든 입체이성체 및 그 혼합물을 포함한다.
자스몬산류의 배지에서의 농도는 0.01∼1000μM이며, 또 자스몬산류의 농도를 0.1∼500μM의 범위로 조정하는 것이 특히 바람직하다.
자스몬산류는 배양세포의 지수증식기 또는 정상기에 첨가하는 것이 효과적이며, 또 지수증식기로부터 정상기로 이행하는 시기에 자스몬산류를 첨가하는 것이 특히 바람직하다. 또한 내인성 자스몬산류의 생산량을 높이기 위한 처리시기에 대해서도 상기와 마찬가지이다. 예를 들어 21일마다 세포를 이식시키고 있는 경우에는 7∼16일째가 자스몬산류의 첨가나 내인성 자스몬산류의 생산량을 높히기 위한 처리의 적기에 해당된다. 자스몬산류의 첨가나 내인성 자스몬산의 생산량을 높이기 위한 처리는 한꺼번에 하여도 좋고, 복수회로 나누어서 하여도 좋다.
또한 본 발명은 일본국 특원평6-146826호에 개시된 방법, 즉 배양기내의 기상중의 산소농도를 배양초기부터 대기중의 산소농도 미만의 조건으로 제어하여 배양하거나, 혹은 조직 또는 세포와 접하는 유동성의 배지중의 용존 산소농도를 그 온도에서의 포화용존 산소농도 미만인 조건으로 제어하여 배양하는 방법과 병용할 수가 있다.
여기서 배양초기라 함은 배양 개시시 또는 배양 개시후 7일째를 말하며, 배양기내의 기상중의 산소농도의 제어나, 혹은 조직 또는 세포와 접하는 유동성 배지중의 용존 산소농도의 제어는 배양 개시시로부터 하는 것이 바람직하다. 제어의 기간은 특히 한정하지 않으며, 상기 조건하에서의 제어는 배양의 전기간을 통해서 하여도 좋고, 전 배양기간중의 일부기간만을 제어하여도 좋으나, 전 배양기간중의 적어도 3일간 제어하는 것이 바람직하다.
배양기내의 기상중의 산소농도는 4∼15%로 제어하는 것이 필요하며, 특히 6∼12%로 제어하는 것이 바람직하다. 또 유동성 배지중의 용존 산소농도는 그 온도에서의 포화 용존 산소농도의 1∼75%로 제어하는 것이 필요하며, 특히 10∼75%로 제어하는 것이 바람직하다.
본 발명은 일본국 특개평7-135967호, 특원평6-104213호에 개시되어 있는 방법, 즉 세포를 비중 차이에 따라 복수의 층으로 나누어, 적어도 1개의 층에 포함된 세포를 배양하는 방법과 병용할 수도 있다.
본 발명은 일본국 특원평6-201150호에 개시되어 있는 방법, 즉 중금속을 함유한 화합물류, 중금속 이온을 함유한 착이온류 및 중금속 이온으로 된 군으로부터 선택한 적어도 1종의 존재하에서 배양하는 방법과 병용할 수도 있다.
중금속으로서는 은으로 대표되는 구리족 또는 철족 금속중의 코발트를 사용하는 것이 바람직하다. 또한 상기 중금속을 함유한 화합물, 상기 중금속을 함유한 착이온류의 형태나 또는 상기 금속 이온의 형태로 사용하는 것이 바람직하다. 특히 티오황산은 이온이 바람직하다. 중금속의 농도는 10-8M∼10-2M이 바람직하다.
본 발명은 일본국 특원평6-201151호에 개시되어 있는 방법, 즉 아민류의 존재하에서 배양하는 방법과 병용할 수도 있다.
여기서 아민류로서는 푸트레신, 스페르미딘, 스페르민, 에틸렌 디아민, N, N-디에틸-1,3-프로판 디아민, 디에틸렌 트리아민 및 그것들의 염으로 된 군으로부터 선택한 적어도 1종 이상을 사용하는 것이 바람직하다. 아민의 농도는 10-8M∼10-1M이 바람직하다.
또한 본 발명의 방법과 상술한 선원 특허에 개시된 2개 또는 그 이상의 방법과 조합하는 것도 가능하다.
본 발명에 의하면 코로나틴류, 코로나틴 생성균, 그러한 균류의 배양액 또는 배양 추출물, 환상 다당류, 지방산류 또는 자스몬산류의 이미노 또는 아미노 유도체로 된 군으로부터 선택한 적어도 1종 이상을 함유한 조직배지를 사용하여 탁산형 디테르펜을 생산하는 식물의 조직배양에 의해 다량의 탁산형 디테르펜을 용이하게 얻을 수가 있다.
[실시예]
다음에는 실시예, 비교예, 참고예 및 합성례에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하거니와, 본 발명의 범위는 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1]
나프탈렌초산을 10-5M의 농도가 되도록 첨가한 Woody Plant Medium의 고체배지(겔란 검 0.25중량% 함유)에 미리 2% 안티포르민용액 또는 70% 에타놀용액등으로 멸균처리한 서양주목(Taxus baccata LINN)의 줄기의 일부를 놓고, 25℃에서 암실에서 정치배양(static culture)하여 서양주목 칼루스를 얻었다. 다음에 이 칼루스 1g(신선 중량)을 상기 성분을 같은 농도로 첨가한 액체 Woody Plant Medium 20㎖들어있는 에르렌마이어 플라스크(Erlenmeyer flask)에 이식하고 로터리 쉐이커(rotary shaker)로 진탕배양(진폭 25㎜, 120rpm)하여, 21일마다 칼루스를 계대배양하여, 그 생육속도를 가속화하였다.
한편 코로나틴류 생성균으로서 Pseudomonas syringae(IFO3310)를 사용해서 우선 세균배양용 802배지(Polypepton: 1.0%, Yeast extract : 0.2%, MgSo4·7H2O:0.1%, pH7.0)3㎖들어 있는 시험관에서 180rpm, 30℃로 24시간 균을 증식한다. 다음에 증식한 균을 함유한 상기 배양액 100μl를 글루코스 최소배지(글루코스 : 8.8g/1, KH2PO4:2.6g/1, Na2HPO4·2H2O:6.9g, NH4Cl:2.5g/1, Na2SO4:1g/1, FeSO4:0.01g/1, MnSO4:0.01g/1, MgCl2:0.05g/1, pH6.8) 50㎖들어 있는 에르렌마이어 플라스크레 식균하고, 다시 30℃로 24시간 배양하였다. 이와 같이 하여 얻어진 코로나틴류 생성균 배양액을 약 1/20으로 농축후에 2N H2SO4로 pH를 3으로 조정하고 초산에틸로 추출하였다. 얻어진 카르복실산 획분을 감압건조후에 에타놀 2㎖에 용해하여, 그 무균 여과액을 코로나틴류 생성균 배양 추출액으로서 사용하였다.
이와같이 하여 얻어진 서양주목 배양세포 1g(신선 중량)을 Woody Plant Medium의 액체배지 20㎖들어있는 에르렌마이어 플라스크에 이식하고, 25℃에서 14일간 진탕배양하였다. 배양 14일째에 코로나틴류 생성균 배양 추출액 50μl를 배지에 첨가하고 다시 7일간 배양하였다.
배양 종료후에 서양주목 배양세포를 여과에 의해 채취하고 동결 건조한 후에 그 건조중량을 측정하여 액체배지 1L당의 배양세포의 수량(yield)을 구하였다. 얻어진 건조 칼루스로부터 메타놀등을 사용하여 탁산형 디테르펜을 추출하고, 고속 액체 크로마토그패피를 사용하여 표준품 탁솔, 세팔로마닌, 및 바카틴 III와 비교 정량함으로써 탁산형 디테르펜의 수량을 측정하였다. 그 결과를 표 1에 나타낸다.
[비교예 1]
코로나틴류 생성균의 배양 추출액을 첨가하지 않은 이외에는 실시예 1과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표1에 나타낸다.
[실시예 2]
코로나틴류 생성균의 배양 추출액 대신에 Pseudomonas syringae를 최소배지에서 배양한 후에 무균 여과한 액 1㎖를 첨가하여 배양하는 이외에는 실시예 1과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표1에 나타낸다.
[실시예 3]
코로나틴류 생성균의 배양 추출액 대신에 Pseudomonas syringae를 최소배지에서 배양한 후에 오토클레이브한액 1㎖를 첨가하여 배양하는 이외에는 실시예 1과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표1에 나타낸다.
[실시예 4]
코로나틴류 생성균으로서 Xanthomonas campestris(IFO 13551)를 사용한 이외에는 실시예 1과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표1에 나타낸다.
[실시예5]
코로나틴류 생성균으로서 Pseudomonas syringae를 배양 14일째의 주목 배양배지에 직접 식균하고 다시 7일간 배양하였다. 배양 종료후는 실시예 1과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표1에 나타낸다.
[실시예6]
코로나틴류 생성균으로서 Xanthomonas campestris을 배양 14일째의 주목 배양배지에 직접 식균하고 다시 7일간 배양하였다. 배양 종료후는 실시예 1과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표1에 나타낸다.
[*) : 수량은 총생산량(세포중+배지중)에 의거해서 산출하였다].
[실시예7]
나프탈렌초산을 10-5M의 농도가 되도록 첨가한 Woody Plant Medium의 고체배지(겔란 검 0.25중량% 함유)에 미리 2% 안티포르민용액 또는 70% 에타놀용액등으로 멸균처리한 서양주목(Taxus baccata LINN)의 줄기의 일부를 놓고, 25℃에서 암실에서 정치배양하여 서양주목 칼루스를 얻었다. 다음에 이 칼루스 1g(신선 중량)을 상기 성분을 같은 농도로 첨가한 액체 Woody Plant Medium 20㎖들어있는 에르렌마이어 플라스크에 이식하고 로터리 쉐이커로 진탕배양(진폭 25㎜, 120rpm)하여, 21일마다 칼루스를 계대배양하여, 그 생육속도를 가속화하였다.
이와 같이 하여 얻어진 배양세포 1g(신선 중량)을 상기 성분을 같은 농도가 되도록 첨가한 액체 Woody Plant Medium 20㎖들어 있는 에르렌마이어 플라스크에 옮기고 25℃에서 14일간 진탕배양하였다. 배양 14일째에 코로나틴류서 코로나틴[식(IV)]을 그 최종농도가 0.001∼1000μM가 되도록 배지에 첨가하고 다시 7일간 배양하였다.
배양 종료후에 서양주목 배양세포를 여과에 의해 채취하고 동결 건조한 후에 그 건조중량을 측정하여 액체배지 1L당 배양세포의 수량을 구하였다. 얻어진 건조 칼루스로부터 메타놀등을 사용하여 탁산형 디테르펜을 추출하고, 고속 액체 크로마토그래피를 사용하여 표준품 탁솔, 세팔로마닌, 및 바카틴 III와 비교 정량함으로써 탁산형 디테르펜의 수량을 측정하였다. 그 결과를 표2에 나타낸다.
[비교예 2]
코로나틴을 첨가하지 않은 이외에는 실시예 7과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를표2에 나타낸다.
[실시예8]
코로나틴류로서 N-코로나파코일발린[식(IX)을 1μM 첨가한 이외에는 실시예7과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 2에 나타낸다.
[실시예 9]
코로나틴류로서 코로나틴의 메틸 에스테르를 1μM 첨가한 이외에는 실시예7과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표2에 나타낸다.
[실시예 10]
코로나틴류로서 코로나파식산[식(V)]을 10μM 첨가한 이외에는 실시예7과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표2에 나타낸다.
[실시예 11]
코로나틴류로서 코로나파식산의 메틸 에스테르를 10μM 첨가한 이외에는 실시예7과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표2에 나타낸다.
[실시예 12]
실시예7과 같이 하여 얻어진 메디아주목(Taxus media)의 배양세포를 사용하여, 코로나틴류로서 코로나틴을 최종농도가 1μM가 되도록 첨가한 이외에는 실시예 7과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표2에 나타낸다.
[비교예 3]
코로나틴을 첨가하지 않은 이외에는 실시예 12와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 2에 나타낸다.
[*) : 수량은 총생산량(세포중+배지중)에 의거해서 산출하였다].
[실시예 13]
나프탈렌초산을 10 M의 농도가 되도록 첨가한 Woody Plant Medium의 고체배지(겔란 검 0.25중량% 함유)에 미리 2% 안티포르민용액 또는 70% 에타놀용액등으로 멸균처리한 서양주목(Taxus baccata LINN)의 줄기의 일부를 놓고, 25℃에서 암실에서 정치배양하여 서양주목 칼루스를 얻었다. 다음에 이 칼루스 1g(신선 중량)을 상기 성분을 같은 농도로 첨가한 액체 Woody Plant Medium 1㎖들어있는 내경 18mm 웰(well)에 이식하고 로터리 쉐이커로 진탕배양(진폭 25㎜, 120rpm)하여, 28일마다 칼루스를 계대배양하여, 그 생육속도를 가속화하였다.
이와 같이 하여 얻어진 배양세포 1g(신선 중량)을 상기 성분을 같은 농도가 되도록 첨가한 액체 Woody Plant Medium 20㎖들어 있는 에르렌마이어 플라스크에 옮기고 25℃에서 14일간 진탕배양하였다. 배양 14일째에 β-사이클로덱스트린의 최종농도가 0.01mM가 되도록 배지에 첨가하고 다시 7일간 배양하였다.
배양 종료후에 서양주목 배양세포를 여과에 의해 채취하고 동결 건조한 후에 그 건조중량을 측정하여 액체배지 1L당 배양세포의 수량을 구하였다. 얻어진 건조 칼루스로부터 메타놀등을 사용하여 탁산형 디테르펜을 추출하고, 고속 액체 크로마토그래피를 사용하여 표준품 탁솔, 세팔로마닌, 및 바카틴 III와 비교 정량함으로써 탁산형 디테르펜의 수량을 측정하였다. 그 결과를 표3에 나타낸다.
[비교예 4]
β-사이클로덱스트린을 첨가하지 않은 이외에는 실시예13과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표3에 나타낸다.
[실시예14]
첨가한 β-사이클로덱스트린의 최종농도가 0.01mM인 것 이외에는 실시예13과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표3에 나타낸다.
[실시예 15]
첨가한 β-사이클로덱스트린의 최종농도가 1mM인 것 이외에는 실시예13과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표3에 나타낸다.
[실시예 16]
첨가한 β-사이클로덱스트린의 최종농도가 10mM인 것 이외에는 실시예13과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표3에 나타낸다.
[실시예 17]
β-사이클로덱스트린 대신에 6-O-α-D-글루코실-β-사이클로덱스트린을 그 최종농도가 50mM가 되도록 첨가한 것 이외에는 실시예13과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표3에 나타낸다.
[실시예 18∼22]
자스몬산 메틸 에스테르를 그 최종농도가 100μM가 되도록 또한 첨가한 것 이외에는 실시예 13∼17과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표4에 나타낸다.
[비교예 5]
자스몬산 메틸 에스테르를 그 최종농도가 100μM가 되도록 또한 첨가한 것 이외에는 비교예 4와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표4에 나타낸다.
[실시예 23]
β-사이클로덱스트린 대신에 α-사이클로덱스트린을 그 최종농도가 10mM가 되도록 첨가한 것 이외에는 실시예21과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표5에 나타낸다.
[실시예 24]
β-사이클로덱스트린 대신에 γ-사이클로덱스트린을 그 최종농도가 10mM가 되도록 첨가한 것 이외에는 실시예21과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표5에 나타낸다
[실시예 25]
β-사이클로덱스트린 대신에 사이클로프락탄(프락토스 7개가 결합한 화합물)을 그 최종농도가 10mM가 되도록 첨가한 것 이외에는 실시예21과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표5에 나타낸다
[*) : 수량은 총생산량(세포중+배지중)에 의거해서 산출하였다].
[**) : 6-O-α-D-글루코실-β-사이클로덱스트린을 사용하였다].
[*) : 수량은 총생산량(세포중+배지중)에 의거해서 산출하였다].
[**) : 6-O-α-D-글루코실-β-사이클로덱스트린을 사용하였다].
[*) : 수량은 총생산량(세포중+배지중)에 의거해서 산출하였다].
[실시예 26]
나프탈렌초산을 10 M의 농도가 되도록 첨가한 Woody Plant Medium의 고체배지(겔란 검 0.25중량% 함유)에 미리 2% 안티포르민용액 또는 70% 에타놀용액등으로 멸균처리한 서양주목(Taxus baccata LINN)의 줄기의 일부를 놓고, 25℃에서 암실에서 정치배양하여 서양주목 칼루스를 얻었다. 다음에 이 칼루스 1g(신선 중량)을 상기 성분을 같은 농도로 첨가한 액체 Woody Plant Medium 20㎖들어있는 에르렌마이어 플라스코에 이식하고 로터리 쉐이커로 진탕배양(진폭 25㎜, 100rpm)하여 21일마다 칼루스를 계대배양하여, 그 생육속도를 가속화하였다.
이와 같이 하여 얻어진 배양세포 2g(신선 중량)을 0.01∼1000μM의 α-리놀렌산(에타놀에 용해)을 첨가한 액체 Woody Plant Medium 20㎖(100ml 에르렌마이더 플라스크 사용)에 이식하고 25℃에서 암실에서 로터리 쉐이커로 진탕배양(진폭 25mm, 100rpm)하였다.
14일간의 배양후에 배양세포를 여과에 의해 채취하고 동결 건조한 후, 그 건조중량을 측정하여 수량을 구하였다. 얻어진 건조 칼루스 및 배지로부터 메타놀등을 사용하여 탁산형 디테르펜을 추출하고, 고속 액체 크로마토그래피를 사용하여 표준품 탁솔과 비교 정량함으로써 탁솔의 수량을 측정하였다. 그 결과를 표6에 나타낸다.
[실시예 27]
α-리놀렌산 대신에 100μM의 올레인산을 첨가한 것 이외에는 실시예26과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표7에 나타낸다.
[실시예 28]
α-놀렌산 대신에 100μM의 리놀산을 첨가한 것 이외에는 실시예26과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표7에 나타낸다.
[실시예 29]
α-리놀렌산대신에 100μM의 아라키돈산을 첨가한 것 이외에는 실시예26과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표7에 나타낸다.
[실시예 30]
α-리놀렌산 대신에 100mg/l의 평지종유를 첨가한 것 이외에는 실시예 26과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 7에 나타낸다.
[실시예 31]
사용한 식물의 종자가 메디아주목(칼루스 유도에 사용한 부위가 종자)인 것 이외에는 실시예26과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표8에 나타낸다.
[비교예 6]
α-리놀렌산을 첨가하지 않은 이외에는 실시예 26과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표6에 나타낸다.
[비교예 7]
α-리놀렌산을 첨가하지 않은 이외에는 실시예 31과 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 8에 나타낸다.
[합성례 1]
자스몬산 메틸 1g(4.5mmol)을 메타놀 50㎖에 용해한 용액을 빙냉하고, 황산 히드록실아민 0.74g(4.5mmol)과 초산 칼륨 0.88g(9.0mmol)을 가하여 반응을 실시하였다. 반응 혼합물을 하루밤 방치후에 메타놀을 유거한 후, 포화탄산 수소 나트륨 수용액을 가하고 생성물을 초산 에틸로 반복해서 추출하였다. 초산 에틸 추출액을 모아서 무수황산 나트륨으로 수분을 제거한 후에 감압 건조에 의해 초산 에틸을 유거하여 화합물 A를 얻었다.
황산히드록실아민 대신에 다음의 시약을 사용한 것이외에는 화합물 A의 경우와 마찬가지 방법으로 화합물 B-I를 합성하였다.
화합물 시약
B O-메틸히드록실아민 염산염
C 히드라진 수화물
D 세미카르바지드 염산염
E 포름 히드라지드
F 메탄설포닐 히드라지드
G 시아나미드
H 설파미드
[합성례 2]
합성례 1에서 합성한 화합물 A 1g을 메타놀 50㎖에 용해한 용액에 수소화붕소 나트륨 0.084g(2.2mmol)을 메타놀 5㎖에 용해한 용액을 적하하였다. 적하가 종료된 후에 반응 혼합물을 다시 30분간 교반하였다. 용액을 약 10㎖까지 농축후, 포화탄산수소 나트륨 수용액을 가하고 생성물을 초산 에틸로 반복해서 추출하였다. 초산 에틸 추출액을 모아서 무수황산 나트륨으로 수분을 제거한 후에 감압 건조에 의해 초산 에틸을 유거하여 화합물 I를 얻었다.
[실시예 32]
나프탈렌초산을 10 M의 농도가 되도록 첨가한 Woody Plant Medium의 고체배지(겔란 검 0.25중량% 함유)에 미리 2% 안티포르민용액 또는 70% 에타놀용액등으로 멸균처리한 메디아주목의 싹의 일부를 놓고, 25℃에서 암실에서 정치배양하여 메디아주목의 칼루스를 얻었다. 다음에 이 칼루스 1g(신선 중량)을 상기 성분을 같은 농도로 첨가한 액체 Woody Plant Medium 20㎖들어있는 에르렌마이어 플라스코에 이식하고, 로터리 쉐이커로 진탕배양(진폭 25㎜, 100rpm)하여 14일마다 칼루스를 계대배양하여, 그 생육속도를 가속화하였다.
이와 같이 하여 얻어진 배양세포 2g(신선 중량)을 액체 Woody Plant Medium 20㎖들어있는 에르렌마이더 플라스크에 이식하고, 자스몬산류의 유도체로서 화합물 A를 그 최종 농도가 0.01∼1000μM가 되도록 첨가하여 다시 14일간 배양하였다.
배양 종료후에 메디아주목 배양세포를 여과에 의해 채취하고 동결 건조한후, 그 건조중량을 측정하여 액체배지 1L당의 배양세포의 수량을 구하였다. 얻어진 건조 칼루스 및 배지로부터 메타놀등을 사용하여 탁산형 디테르펜을 추출하고, 고속 액체 크로마토그래피를 사용하여 표준품 탁솔, 세팔로마닌, 및 바카틴 III와 비교 정량함으로써 탁산형 디테르펜의 수량을 측정하였다. 그 결과를 표9에 나타낸다.
[비교예 8]
자스몬산의 유도체를 첨가하지 않은 것 이외에는 실시예 32와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 9에 나타낸다.
[참고예 1]
자스몬산의 유도체로서 자스몬산 메틸 100μM를 첨가한 이외에는 실시예32와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 9에 나타낸다.
[실시예 33]
자스몬산의 유도체로서 화합물 B 100μM를 첨가한 이외에는 실시예32와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 9에 나타낸다.
[실시예 34]
자스몬산의 유도체로서 화합물 C 100μM를 첨가한 이외에는 실시예32와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 9에 나타낸다.
[실시예 35]
자스몬산의 유도체로서 화합물 D 100μM를 첨가한 이외에는 실시예32와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 9에 나타낸다.
[실시예 36]
자스몬산의 유도체로서 화합물 E 100μM를 첨가한 이외에는 실시예32와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 9에 나타낸다.
[실시예 37]
자스몬산의 유도체로서 화합물 F 100μM를 첨가한 이외에는 실시예32와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 9에 나타낸다.
[실시예 38]
자스몬산의 유도체로서 화합물 G 100μM를 첨가한 이외에는 실시예32와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 9에 나타낸다.
[실시예 39]
자스몬산의 유도체로서 화합물 H 100μM를 첨가한 이외에는 실시예32와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표9에 나타낸다.
[실시예 40]
자스몬산의 유도체로서 화합물 I 100μM를 첨가한 이외에는 실시예32와 마찬가지로 조작하였다. 그 결과를 표 9에 나타낸다.
[*) : 수량은 총생산량(세포중+배지중)에 의거해서 산출하였다].

Claims (10)

  1. 탁산형 디테르펜을 생성하는 주목속 식물의 세포 및/또는 조직을 환상 다당류 존재하에 배양하여 얻어진 배양물로부터 탁산형 디테르펜을 회수하는 탁산형 디테르펜의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 환상 다당류가 α-시클로덱스트린인 탁산형 디테르펜의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 환상 다당류가 β-시클로덱스트린인 탁산형 디테르펜의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서, 환상 다당류가 γ-시클로덱스트린인 탁산형 디테르펜의 제조방법.
  5. 제1항에 있어서, 환상 다당류가 시클로프락탄인 탁산형 디테르펜의 제조방법.
  6. 제1항에 있어서, 환상 다당류의 배지에서의 농도가 0.01∼50mM인 탁산형 디테르펜의 제조방법.
  7. 제1항에 있어서, 배양을 자스몬산, 그 염, 그 알킬에스테르, 쿠쿠르빈산, 그 염, 그 알킬 에스테르, 투베론산, 그 염 및 그알킬 에스테르로 된 군으로부터 선택한 적어도 1종 이상의 화합물의 존재하에서 실시하는 탁산형 디테르펜의 제조방법.
  8. 제1항에 있어서, 탁산형 디테르펜이 탁솔, 10-데아세틸탁솔, 7-에피탁솔, 바카틴 III, 10-데아세틸바카틴 III, 7-에피바카틴 III, 세팔로마닌, 10-데아세틸세팔로마닌, 7-에피세팔로마닌, 바카틴 VI, 탁산 1a, 크실로실세팔로마닌, 크실로실탁솔, 탁솔 C, 10-데아세틸탁솔 C, 탁시신 I, 탁시신 II, 탁신 I, 탁신 II, 및 탁사기핀으로 된 군으로부터 선택한 적어도 1종인 탁산형 디테르펜의 제조방법.
  9. 제1항에 있어서, 탁산형 디테르펜을 생성하는 주목속 식물이 서양주목인 탁산형 디테르펜의 제조방법.
  10. 제1항에 있어서, 탁산형 디테르펜을 생성하는 주목속 식물이 메디아주목인 탁산형 디테르펜의 제조방법.
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