CN105368888B

CN105368888B - 通过红豆杉植物细胞系三线技术大规模培养生产紫杉烷的方法

Info

Publication number: CN105368888B
Application number: CN201510840058.1A
Authority: CN
Inventors: 丁靖志; 王海燕; 张卫
Original assignee: TIANJIN AISAIBO BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Ansapo (Chongqing) Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2015-11-27
Filing date: 2015-11-27
Publication date: 2018-10-30
Anticipated expiration: 2035-11-27
Also published as: CN105368888A

Abstract

本发明公开了一种通过红豆杉植物细胞系三线技术大规模培养生产紫杉烷的方法。主要是通过红豆杉植物细胞系规模培养两线体系G‑P中，插入中间阶段的细胞线M，进行有序、平稳过渡，能兼顾细胞继代生长和次级代谢产物的调控生产两个阶段的不同工艺要求。本发明与现有方案所不同的关键点在于：在植物细胞继代线G之后，不是立刻进行调控诱导生产，而是先进行细胞状态调整，包括培养基组分的部分改变、抗褐变剂的添加，激素比例改变来调整细胞团的大小和致密度，并控制细胞周期，通过这个短期过渡线M，再转入终端的调控生产线P。最终获得了高产和稳产的兼顾。

Description

通过红豆杉植物细胞系三线技术大规模培养生产紫杉烷的方法

技术领域

本发明属于植物细胞大规模培养生产有用小分子次级代谢产物的技术领域，具体涉及采用G-M-P三线技术，通过红豆杉细胞规模培养生产紫杉醇、10DAB和云南紫杉烷Tc的方法。

背景技术

紫杉醇(Paclitaxel，CAS No.: 33069-62-4，早期和商品名为Taxol)是从红豆杉属植物(Taxus.L)的树皮和枝叶中分离出来的对卵巢癌和乳腺癌有特殊疗效的抗肿瘤药物。有限的红豆杉属植物资源使得紫杉醇成为一种比较昂贵的药物，并影响到它在临床上长期、广泛的应用。多年来，人们一直在致力于寻找解决紫杉醇药源的新途径。

紫杉醇化学全合成虽然早已成功，但合成路线长，产率低，成本高，不能商业化生产。半合成是目前临床应用紫杉醇的主要来源，半合成的前体为由红豆杉枝叶中分离得到的Baccatin III（巴卡亭III，本专利中简写为BAT III，CAS NO.: 27548-93-2）或10-Deacetylbaccatin Ⅲ（10－去乙酰基巴卡亭III，本专利中简写为10DAB，CAS NO.: 32981-86-5，极少用92999-93-4）等，但依然远远满足不了临床及实验的需要。红豆杉属植物的组织与细胞培养，生产紫杉醇，以及生产重要中间体10DAB，BAT III等被认为是一种有潜力的方法之一而受到人们的重视。

在努力拓展紫杉醇的药源并提高紫杉醇产量的同时，科学家亦投身到紫杉烷类化合物的研究中，期望找到抗癌活性更好的紫杉烷类化合物或者找到合适的先导化合物。已经有几百种紫杉烷从紫杉原植物或细胞培养液中分离出来。其中云南紫杉烷Tc（Taxuyunnanine C，不是Taxol C）是一种具有类神经生长因子（NGF）活性的化合物，能够强化NGF的作用，有利于老年痴呆症（Alzheimer’s disease）的治疗。Tc与紫杉醇同属于三环二萜类化合物。

红豆杉植物细胞培养生产紫杉醇及其中间体的工艺体系中，见图1，目前普遍使用两线（细胞生长G-次级代谢产物生产P两阶段）培养技术体系，见图2。在此体系下，高产下的稳产非常困难。主要原因在于次级代谢与初级代谢非常不同，次级代谢产物不是植物细胞生长所必须的，所以要经过诱导、刺激，感受环境的压力后，才能产生，而且其产生和产量都受到多级的调控，包括短期的正反馈和长期的负反馈，生产具有极大的不确定性。尤其是植物细胞的长期继代中，由于对环境的不断适应，基因组虽然变化不大，但表观遗传越来越不利于次级代谢的生产。对于工业化，植物细胞的继代生长和次级代谢产物的调控生产有不同的工艺要求，比如，继代生长要求细胞的生物量越大越好，与初级代谢无关的基因最好都是关闭的、沉没的，染色体区域被异染色质化，涉及组蛋白甲基化、去乙酰化、乙酰化，DNA的甲基化修饰，甲基化修饰组蛋白结合蛋白Sir2/3/4，甲基化DNA结合蛋白，非编码RNA等等在内的一系列复杂组分的生理反应过程。基因沉寂导致相应区段内的遗传信息不能被转录。而次级代谢产物的调控生产，却要求在主动刺激植物细胞后，植物细胞的次级代谢基因组能迅速开放，而初级代谢的基因组最好得到抑制，但又不能引起细胞的过度的凋亡和死亡。大部分的次级代谢产物，对于植物宿主细胞来说，是加重了代谢流的负担，而且许多次级代谢产物对于宿主细胞本身也有毒性。比如，紫杉醇，就是通过促进微管蛋白聚合抑制解聚,保持微管蛋白稳定，抑制细胞有丝分裂。这对同属于真核生物的红豆杉植物细胞来说也是具有毒性的，抑制红豆杉植物细胞的分裂，引起细胞凋亡。因此，植物细胞的两个阶段的代谢流控制是非常对立的，转化阶段控制不好，很容易产生两个效果：一是调控诱导无效，植物细胞继续大量扩增，次级代谢产物极低从而没有商业生产价值，收获的是外观极佳的细胞团；二是调控过头，植物细胞大量变红、褐化、死亡，次级代谢刚开始，细胞就死亡了，收获的是没有高产量的红褐色的培养液。因此，两线技术非常难以满足有用次生代谢产物的生产。

发明内容

为克服现有技术存在的缺点与不足，本发明公开了一种采用三线技术通过红豆杉植物细胞培养生产紫杉烷的方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（1）构建南方红豆杉细胞系的继代线，简称为G线，接种的细胞鲜重为100g/L，接种100%新鲜膜过滤的B5培养基，继代生长周期为14天，在500mL摇瓶阶段，新鲜B5的装液量为20%；在反应器中全培养液的装液量为10~20%；一个周期中细胞鲜重的倍增为2~4倍，在摇瓶培养转速为100~120rpm，或在反应器上振荡频率为12~16rpm，避光培养；所述的B5基础培养基指的是：生长素为2,4-D，含量10mg/L，分裂素为6-BA，含量为1mg/L，蔗糖浓度为15g/L；

（2）构建红豆杉细胞系的一条过渡线，简称M线，其方法是，M线第1代种子来源于G线，其后代的种子都是来源于上一代的M线，一直持续到2~7代，接种的新鲜基础培养基为B5，但只加50%的磷酸盐，即使用浓度0.85g/L；另外还添加了谷氨酰胺GLN 2mg/L，调整蔗糖浓度为25g/L，并进行磷酸盐饥饿法进行细胞周期同步化培养，每代M1线的细胞进行固定调控策略，甲基茉莉酸100μM、硫代硫酸银10mM的跟踪，其磷酸盐饥饿法的步骤：在每代次的第7天、第10天和点12天分别加入20%、20%和10%的磷酸盐，在摇瓶培养转速为100~120rpm，或在反应器上振荡频率为12~16rpm，避光培养；所述的植物激素指的是，最终使用浓度的生长素为NAA 40mg/L，分裂素6-BA 2mg/L；

（3）构建红豆杉细胞系的一条生产线，简称P线，其方法是，M线的红豆杉植物细胞团作为P线的种子，每个M代次的反应器都对应一个P线上的一个反应器，P线上的反应器都是使用MS基础培养基，调整植物激素配比和含量，最终使用浓度，生长素为NAA 10~30mg/L，分裂素为6-BA 1~10mg/L；调整蔗糖浓度为25~60 g/L，接种时，MS基础培养基占50%的体积，原M线上培养14天的条件培养基及培养物占50%体积。接种的生物量为160~300g/L，在摇瓶培养转速为100~120rpm，或在反应器上振荡频率为12~16rpm，避光培养；在培养第0~10天加入茉莉酸甲酯50-300μM，在第5~30天加入XAD-7性大孔树脂5-200g/L，在第7、11、15和21天进行补料培养，所补料液由蔗糖500g/L，谷氨酰胺200mM，MS基础培养基的大量元素和茉莉酸甲酯1~100mM组成，从第10天开始补料，一直补料到第30天，补料的速率是每天补加培养起始体积的0.5%。第30天可以收获，进行紫杉烷的分离和纯化。

本发明所用的种子系为高产紫杉醇的南方红豆杉细胞系CGMCC no.10002，高产10DAB 的南方红豆杉细胞系CGMCC no.10001，高产云南紫杉烷Tc的南方红豆杉细胞系TA-2。

本发明进一步公开了采用三线技术通过红豆杉植物细胞培养生产紫杉烷方法在制备提高生产紫杉醇批次稳定性方面的应用。所使用的容器，包括一般性的摇瓶，也包括特指的反应器，尤其特指中国专利的一次性反应器（ZL 201210021722.6）。提高生产紫杉醇批次稳定性指的是：紫杉醇高产在100mg/L以上批次，稳定性上升到74%；10DAB高产超过200mg/L以上批次超过70%；云南紫杉烷1g/L以上的批次超过90%（成功批次/总批次）。

本专利通过红豆杉植物细胞系规模培养两线体系G-P（常称之为两阶段培养）中，插入中间阶段的细胞线M，进行有序、平稳过渡，能兼顾细胞继代生长和次级代谢产物的调控生产两个阶段的不同工艺要求。本发明与现有方案所不同的关键点在于:

在植物细胞继代线G之后，不是立刻进行调控诱导生产，而是先进行细胞状态调整，包括培养基组分的部分改变、抗褐变剂的添加，激素比例改变来调整细胞团的大小和致密度，并控制细胞周期，通过这个短期过渡线M，再转入终端的调控生产线P。最终获得了高产和稳产的兼顾。

所谓培养基组分的改变，包括大量元素的调整，尤其是其中的磷酸盐。逐步减少和控制磷酸盐，来诱导细胞周期进行减速，而且同步化。抗褐变剂，一般是包括：维生素Vc、谷氨酰胺GLN、活性炭AC、半胱氨酸Cys、脱落酸ABA、柠檬酸、硫代硫酸钠、硝酸银、水解酪蛋白LH、聚乙烯吡咯烷酮PVP、植酸PA、桂皮酸、萘甲酸、2-氨基茚-2-膦酸AIP、褪黑素和谷胱甘肽等。0.1%AC、0.6g/L水解乳蛋白LH和0.01%植酸PA具有的显著抗褐化作用。1 mM AIP的抗褐化效果也及其显著。激素比例改变，对植物细胞的生长和调控都具有极大的作用。在细胞继代的G线，我们常常使用长效的植物生长素，比如使用(2,4-二氯苯氧基)乙酸即2,4-D,含量2.0~40 mg/L，搭配的植物分裂素是6-苄氨基腺嘌呤即6-BA，含量为0.5~10 mg/L。在类似这样的激素配比下，植物细胞团一般逐渐变得疏松，细胞团的大小走向一致，一般直径在0.1~10mm，而颜色越来越浅，细胞内和细胞团的含水量越来越增加，达到90~98%，而生长越来越快，一般能达到一个周期3~8倍。所以在M线阶段，另改植物激素配比和含量，最终使用浓度，生长素为短效的NAA 10~40mg/L，分裂素6-BA 提高浓度，达到2~20 mg/L；另外还添加了谷氨酰胺GLN 1~10 mg/L，调整蔗糖浓度为20~40 g/L。在M线阶段，细胞的生长速度变得稍微减速，减到每个细胞周期鲜重增加2.5~3.5倍；细胞团变小些，达到0.1~5 mm，而含水量逐步减少到85~95%。这时候，许多植物细胞的次级代谢的基因逐步打开，为高产的P线阶段做好充分的准备。

在生产的P阶段，都是使用MS基础培养基，这里大量元素的比例和原来的G-M阶段的B5基础培养基的比例有所不同。其中植物激素配比和含量，最终使用浓度是生长素为NAA10~30mg/L，分裂素为6-BA 1~10mg/L；调整蔗糖浓度为25~60 g/L。接种时，MS基础培养基和条件培养基及培养物各占一定体积比例，为了植物细胞能顺利地进行过度。加大接种的生物量为160~300g/L，在摇瓶上转速增加些，使得混合得更加充分。在培养阶段加入调控诱导剂，比如茉莉酸甲酯50~300μM、硝酸银1~20mM、硫代硫酸银1~100mM、冠菌素1~100μM等。并加入XAD系列或者其他类型的大孔树脂5-200g/L，或者环糊精CD各型，进行两相培养。培养的全过程中监控营养消耗，并进行补料，所补料液，有各种各样的组成，比如phyton专利中的F1~F3，或者我们实施例1中所举的例子，由蔗糖500g/L，谷氨酰胺200mM，MS基础培养基的大量元素和茉莉酸甲酯1-100μM组成。一般，在加调控剂的第6~80天都可以收获，进行紫杉烷、10DAB 和云南紫杉烷Tc的分离和纯化。

本发明公开的采用三线技术通过红豆杉植物细胞培养生产紫杉烷的方法与现有方案所不同的关键点在于:

在植物细胞继代线G和终端的调控生产线P，中间插入中间线M，为G-M-P结构。原来只有G-P结构。GMP通过资源配置，以增加1条种子线的代价，提高了生产系统的稳定性。

常规的两线技术路线，见图2，生产的紫杉醇高产在100mg/L以上，只有20%频率的成功批次；高产紫杉醇、10DAB和云南紫杉烷Tc的三种细胞系与三种不同的悬浮继代培养基、中间过渡培养方法和调控生产培养基的组合，包括特定的一次性反应器体系（指的是中国专利201420705851.1，201410675127.3和ZL 201210021722.6），整个三线生产体系的构建方法和生产线结构，见图3。

MS培养基是1962年穆拉希吉克(Murashige，T.)和斯科克（Skoog，F.）为培养菸草材料而设计的，它对在固体培养条件下诱导愈伤组织，在液体培养条件下作细胞悬浮培养及用于胚、茎尖、茎段及花药等的培养和形态发生研究方面，均获得了明显的成功。MS培养基中无机养份的数量和比例均较合适，足以满足很多植物细胞在营养和生理上的需要。

B5培养基是甘博格(Gamborg)等1968年设计的，它的主要特点是含有较低的铵，而铵这一营养成分可能对有些培养基有抑制生长的作用。当在伤组织和悬浮培养中对B5培养基与MS培养基进行对比培养试验时，发现有些植物的愈伤组织和细胞培养物在MS培养基上生长得好，有些在B5培养基上生长得更适宜。

MS和B5都是植物细胞培养常见的培养基配方，本发明中所用的基本培养基，都是包括MS和B5标准配方中的大量元素、微量元素、有机物以及pH控制，但对植物激素、蔗糖含量和其他添加物有不同的规定，具体见各实施例。

附图说明：

图1、植物细胞建立到生产的技术路线图

图2、红豆杉植物细胞两阶段G-P两线技术路线图

图3、红豆杉植物细胞G-M-P两线技术路线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本发明所用到的试剂出特别说明外均有市售，南方红豆杉细胞系CGMCC no.10001、南方红豆杉细胞系CGMCC no.10002是指发明人专利细胞株；植物细胞培养中常用的B5和MS培养基基础配方也见常规文献，试剂也是常规AR级或其他适用级别。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件进行。

实施例1

南方红豆杉细胞系CGMCC no.10001（中国专利201410726274.9）在细胞早代次时能高产10DAB，可达到388mg/L；但当细胞在中代次时候，10DAB的产量下降到100~200mg/L；30代次之后，10DAB的产量下降到50mg/L以下，并伴随着褐化和衰退。对原G-P结构进行了更新，采用G-M-P三线技术，在南方红豆杉细胞系CGMCC no.10001的继代线G1之后，先建立一条过渡线M1，采用添加激素6-BA 2mg/L，GLN 2mg/L，调整蔗糖浓度为25g/L，并进行磷酸盐饥饿等方法进行细胞周期同步化培养，每代M1线的细胞有一半进入调控继代P1线，进行固定调控策略：P线上的反应器都是使用MS基础培养基，调整植物激素配比和含量，最终使用浓度，生长素为NAA 10mg/L，分裂素为6-BA 2mg/L；调整蔗糖浓度为45 g/L。接种时，MS基础培养基占50%的体积，原M线上培养14天的条件培养基及培养物占50%体积。接种的生物量为200g/L，在摇瓶上转速为110rpm，或在反应器上振荡频率为16rpm，避光培养。在培养第0~10天加入茉莉酸甲酯100μM。在第5天和第10天加入XAD-7大孔树脂各50g/L。在第7、11、15和21天进行补料培养，所补料液由蔗糖500g/L，谷氨酰胺200mM，MS基础培养基的大量元素和茉莉酸甲酯50mM组成，从第10天开始补料，一直补料到第30天，补料的速率是每天补加培养起始体积的0.5%。第30天可以收获，进行紫杉烷的分离和纯化。发现第20-30代G线，经过M1线调整，所获得调控P1线的第1~3代10DAB的产量得到了恢复。

实施例2

基本工艺参照实施例1。南方红豆杉细胞系CGMCC no.10002（中国专利201410726199.6）在细胞早代次，早1~10代次时能高产紫杉醇，可达到50~358mg/L；但细胞在中代次时候，紫杉醇的产量下降到20~200mg/L；30代次之后，紫杉醇的产量下降到0~150mg/L以下，并伴随着褐化和衰退。对原G-P结构进行了更新，采用G-M-P三线技术，在南方红豆杉细胞系CGMCC no.10002的继代线P2之后，先建立一条过渡线M2，采用添加激素6-BA2mg/L，GLN 2mg/L，调整蔗糖浓度为25g/L，并进行磷酸盐饥饿等方法进行细胞周期同步化培养，每代M2线的细胞一半进入调控生产线P2线，进行各种调控策略(甲基茉莉酸100μM、硫代硫酸银10mM，保持蔗糖浓度15~30g/L，保持蔗糖浓度15~30g/L，并配合添加XAD-7大孔树脂 5~200g/L))的跟踪，发现第20-70代G2线，经过M2线调整，所获得调控P2线第1~5代紫杉醇恢复了高产。

此G-M-P三线技术进一步在艾赛博公司专利反应器平台上进行了验证，紫杉醇的100mg/L以上的高产稳产性，从原来的20%批次提高到74%批次。

实施例3

基本工艺参照实施例1。南方红豆杉细胞系TA-2在摇瓶代次已经高达50~200代，继代生长基本稳定，G3线正常的继代，使用B5培养基，每个代次的继代鲜重倍增可以达到3~6倍，但基本不产紫杉醇和10DAB，原G-P生产云南紫杉烷Tc达到50~458mg/L；对原G-P结构进行了更新，采用G-M-P三线技术，在南方红豆杉细胞系TA-2的继代线G3线之后，先建立一条过渡线M3线，采用添加激素6-BA 2mg/L，GLN 2mg/L，调整蔗糖浓度为25g/L，并进行磷酸盐饥饿等方法进行细胞周期同步化培养，每代M3线的细胞之后有一部分细胞进入生产型P3期，进行各种调控策略(甲基茉莉酸100μM、硫代硫酸银10mM，保持蔗糖浓度15~30g/L，并配合添加XAD-7大孔树脂 5~200g/L)的跟踪，发现第50~200代红豆杉细胞系TA-2株的G3线，经过M3线调整，所获得调控P3线第1~5代产量能够更高产云南紫杉烷Tc可达150~1800mg/L。云南紫杉烷1g/L以上的批次超过90%。

参考文献：

[1] BRINGI,Venkataraman（美国）等，提高红豆杉细胞培养中紫杉醇和紫杉烷产量的方法，国际专利，WO 97/44476.

[2] Homare Tabata（日本）, Paclitaxel Production by Plant-Cell-CultureTechnology, Adv Biochem Engin/Biotechnol (2004) 7: 1–23.

[3] 张卫、魏先宇，带有曝气装置的一次性波浪式生物反应器，中国专利ZL201210021722.6。

[4] 王丽等，具有高产10-DAB特性的红豆杉细胞株及其应用，中国专利201410726274.9。

[5] 张卫等，具有高产紫杉醇特性的红豆杉细胞株及其应用，中国专利201410726199.6

[6] 张卫（ZHANG WEI）等，一种用于生物反应器的摇动平台(实用新型)，中国专利201410675127.3。

[7] 张卫（ZHANG WEI）等，一种用于生物反应器的摇动平台，中国专利201420705851.1

[8] 崔亨均(韩国)等，通过半连续培养大量生产紫杉醇的方法，中国专利96190419.4及CN1153533。

Claims

1.一种采用三线技术通过红豆杉植物细胞培养生产紫杉烷的方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（1）构建南方红豆杉细胞系的继代线，简称为G线，接种的细胞鲜重为100g/L，接种100%新鲜的膜过滤B5培养基，继代生长周期为14天，在500mL摇瓶阶段，新鲜B5的装液量为20%；在反应器中全培养液的装液量为10~20%；一个周期中细胞鲜重的倍增为2~4倍，在摇瓶培养转速为100~120rpm，或在反应器上振荡频率为12~16rpm，避光培养；所述的B5基础培养基指的是：生长素为2,4-D，含量10mg/L，分裂素为6-BA，含量为1mg/L，蔗糖浓度为15g/L；

（2）构建红豆杉细胞系的一条过渡线，简称M线，其方法是，M线第1代种子来源于G线的一个代次，其后代的种子都是来源于上一代的M线，一直持续到2~7代，接种的新鲜基础培养基为B5，但只加50%的磷酸盐，使用浓度0.85g/L，另调整植物激素配比和含量；另外还添加了谷氨酰胺GLN 2mg/L，调整蔗糖浓度为25g/L，并进行磷酸盐饥饿法进行细胞周期同步化培养，每代M1线的细胞进行固定调控策略，甲基茉莉酸100μM、硫代硫酸银10mM的跟踪，其磷酸盐饥饿法的步骤：在每代次的第7天、第10天和12天分别加入20%、20%和10%的磷酸盐，在摇瓶培养转速为100~120rpm，或在反应器上振荡频率为12~16rpm，避光培养；所述的植物激素指的是生长素为NAA 40mg/L，分裂素6-BA 2mg/L；

（3）构建红豆杉细胞系的一条生产线，简称P线，其方法是，M线的红豆杉植物细胞团作为P线的种子，每个M代次的反应器都对应一个P线上的一个反应器，P线上的反应器都是使用MS基础培养基，调整植物激素配比和含量，最终使用浓度，生长素为NAA 10~30mg/L，分裂素为6-BA 1~10mg/L；调整蔗糖浓度为25~60 g/L，接种时，MS基础培养基占50%的体积，原M线上培养14天的条件培养基及培养物占50%体积；

接种的生物量为160~300g/L，在摇瓶培养转速为100~120rpm，或在反应器上振荡频率为12~16rpm，避光培养；在培养第0~10天加入茉莉酸甲酯50-300μM，在第5~30天加入XAD-7性大孔树脂5-200g/L，在第7、11、15和21天进行补料培养，所补料液由蔗糖500g/L，谷氨酰胺200mM，MS基础培养基的大量元素和茉莉酸甲酯1~100mM组成，从第10天开始补料，一直补料到第30天，补料的速率是每天补加培养起始体积的0.5%；第30天可以收获，进行紫杉烷的分离和纯化。

2.权利要求1所述的采用三线技术通过红豆杉植物细胞培养生产紫杉烷的方法，其特征在于所用的种子系为高产紫杉醇的南方红豆杉细胞系CGMCC no.10002或高产10DAB 的南方红豆杉细胞系CGMCC no.10001。

3.权利要求1所述采用三线技术通过红豆杉植物细胞培养生产紫杉烷方法在提高生产紫杉醇批次稳定性方面的应用。

4.权利要求3所述的应用，其中提高生产紫杉醇批次稳定性指的是：紫杉醇高产在100mg/L以上批次，稳定性上升到74%；10DAB高产超过200mg/L以上批次超过70%；云南紫杉烷1g/L以上的批次超过90%。