CN104705189B - 一种粳稻花药诱导培养基配方 - Google Patents

一种粳稻花药诱导培养基配方 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种粳稻花药诱导培养基配方，该培养基的配方由一定比例的KNO3、(NH4)2SO4、KH2PO4、CaCl2∙2H2O、MgSO4∙7H2O、Na2‑EDTA、FeSO4∙7H2O、MnSO4∙4H2O、ZnSO4∙7H2O、H3BO3、KI、肌醇、丙三醇、二水柠檬酸钠、叶酸、甘氨酸、赖氨酸、维生素B1、维生素B6、烟酸、蔗糖、D‑阿拉伯糖基‑2‑去氧已糖、植物凝胶、2，4‑D、NAA、4‑氯‑2‑甲基苯氧基乙酸、甲基亚硝基脲、5‑溴尿嘧啶、水解蛋白、牛磺酸和生物素所组成。本发明所述的培养基具有高效率地诱导粳稻花药愈伤组织的优点，可以大幅度地提高粳稻花药培养效率。

Description

一种粳稻花药诱导培养基配方
技术领域
本发明涉及一种粳稻花药培养培养基配方，具体涉及一种高效率地诱导粳稻花药愈伤组织的诱导培养基配方，属于农业科学技术领域。
背景技术
花药培养是利用植物组织培养技术，把发育到一定阶段的花药，通过无菌操作技术，接种在人工培养基上以改变花药内花粉粒的发育程序，诱导其分化，并连续进行有丝分裂，形成细胞团，进而形成一团无分化的薄壁组织-愈伤组织，或分化成胚状体，随后使愈伤组织分化成完整的植株的过程。
1968年，日本新关和大野通过花药离体培养获得水稻花粉植株，揭开了人类利用花药创造水稻新种质的序幕，为作物育种开辟了一条新的有效途径。水稻花培具有缩短育种年限、扩大变异范围、提高选择效率等优势，近几十年来发展很快，在水稻育种中已被广泛应用。水稻花药培养是指离体培养水稻花药或花粉粒，诱导小孢子形成愈伤组织进而分化成完整的水稻植株。花培植株经过人工加倍或自然加倍产生纯合的二倍体植株，通过常规系统选育方法，选出综合性状优异的纯合稳定株系（品系），再经过品种比较、区域试验和生产示范育成新的品种，这种花培与常规育种相结合的方法就是花培育种。花培育种是近代生物技术的重要组成部分，也是生物技术各领域中最早在水稻方面进入实用化阶段的一种育种方法。
我国自1970年开始水稻花培技术研究，1975年天津市农科所（现天津市作物所前身）与中国科学院遗传所合作，用单倍体育种法育出了两个花培品种-花育1号和2号，1977年在日本召开的国际作物育种方法研讨会上，大野清春指出花育1号和2号为花药培养最早育成的品种。我国实现了花培育种从理论到应用的突破，也促进了国内外的花培育种技术的发展。随着花药培养的遗传特性、生理生化等不断深入研究，现在水稻花药培养已经成为当今生物技术育种中较为实用、有效的育种新技术，我国水稻花药培养育种的应用研究在国际上一直保持领先地位。
花培再生植株的数量是品种选育的重中之重。由于受培养基组分、材料的差异性以及培养环境等的影响，目前花培效率还不够理想，获得的再生植株群体小，花培后代的表现型不充足，这使选择、利用受到较大的限制。花培植株的生长发育受很多因素的影响，包括培养基的改良、附加成分的增减、单倍体的加倍技术、培养条件的改善等等，其目的都在于提高愈伤组织的诱导率和绿苗的分化率。其中培养基是花药培养的物质基础，直接关系到培养物的生长与分化，培养基组分是影响花培效率的一个很重要的因素。培养基各组分的合适用量，以及它们之间一定的组合关系，可导致花培效率的大幅度提高。继续筛选和优化基本培养基，提高培养基选用的针对性，是提高花药培养力的有效措施；大量的研究发现一些有机附加物可以显著提高花药培养力，发现和优化组合花药培养有机附加物质，可进一步提高花药培养力。因此，组合和优化培养基组分，摸索出高效的水稻花药培养基配方是提高花药培养效率的关键。
通过多年粳稻花药培养的摸索和实践，我们进一步优化了基本培养基配方，并且不断尝试加入一些提高粳稻花药诱导力的有机添加物并组合其种类搭配及浓度，最终摸索出了一种高效率地诱导粳稻花药诱导培养的培养基配方。我们的研究结果对于进一步推广和应用水稻单倍体育种和理论研究无疑有较大的现实意义和实用价值。
发明内容
本发明提供了一种粳稻花药诱导培养基配方，该培养基的配方如下：
KNO32200～2600mg/L，(NH4)2SO4370～430mg/L，KH2PO4330～370mg/L，CaCl2?2H2O130～150mg/L，MgSO4?7H2O150～170mg/L，Na2-EDTA30～35mg/L，FeSO4?7H2O22～26mg/L，MnSO4?4H2O3.6～4.2mg/L，ZnSO4?7H2O1.2～1.4mg/L，H3BO31.3～1.5mg/L，KI0.6～0.7mg/L，肌醇90～110mg/L，丙三醇4.5～5.5mg/L，二水柠檬酸钠0.25～0.35mg/L，叶酸0.25～0.35mg/L，甘氨酸1.8～2.2mg/L，赖氨酸1.8～2.2mg/L，维生素B10.9～1.1mg/L，维生素B60.45～0.55mg/L，烟酸0.45～0.55mg/L，蔗糖45～55g/L，D-阿拉伯糖基-2-去氧已糖0.13～0.17g/L，植物凝胶5～6g/L；
2，4-D1.8～2.2mg/L，NAA0.45～0.55mg/L，4-氯-2-甲基苯氧基乙酸4.5～5.5mg/L，甲基亚硝基脲1.8～2.2g/L，5-溴尿嘧啶0.25～0.35g/L，水解蛋白0.27～0.33g/L，牛磺酸0.04～0.06mg/L，生物素0.04～0.06mg/L，pH5.8-6.0。
本发明所述的培养基具有高效率地诱导粳稻花药愈伤组织，可以大幅度地提高粳稻花药培养效率。下面的实施例以及对比实验可以清楚地反映本发明所述培养基的特点。
具体实施方式
实施例1
配制如下配方的培养基：
KNO32400mg/L，(NH4)2SO4400mg/L，KH2PO4400mg/L，CaCl2?2H2O140mg/L，MgSO4?7H2O160mg/L，Na2-EDTA32.5mg/L，FeSO4?7H2O24mg/L，MnSO4?4H2O3.9mg/L，ZnSO4?7H2O1.3mg/L，H3BO31.4mg/L，KI0.65mg/L，肌醇100mg/L，丙三醇5.0mg/L，二水柠檬酸钠0.3mg/L，叶酸0.3mg/L，甘氨酸2.0mg/L，赖氨酸2.0mg/L，维生素B11.0mg/L，维生素B60.5mg/L，烟酸0.5mg/L，蔗糖50g/L，D-阿拉伯糖基-2-去氧已糖0.15g/L，植物凝胶5.5g/L；
2，4-D2.0mg/L，NAA0.5mg/L，4-氯-2-甲基苯氧基乙酸5mg/L，甲基亚硝基脲2.0g/L，5-溴尿嘧啶0.3g/L，水解蛋白0.3g/L，牛磺酸0.05mg/L，生物素0.05mg/L，pH5.9。
选取粳稻品种通科粳和黑壳紫粳作为花药培养花药供体，采集单核晚期花药作为供试材料，表面消毒后，4℃下低温预处理3天。预处理后，外植体灭菌（0.1%升汞溶液，15min），抖药法接种花药于该诱导培养基中诱导愈伤组织，每个三角瓶接种50枚花药，在温度为28℃、湿度为60%-70%的环境下暗培养。愈伤组织形成后（长到2mm左右），计算愈伤组织诱导率。
实施例2
配制如下配方的培养基（D-阿拉伯糖基-2-去氧已糖添加浓度的优选）：
KNO32400mg/L，(NH4)2SO4400mg/L，KH2PO4400mg/L，CaCl2?2H2O140mg/L，MgSO4?7H2O160mg/L，Na2-EDTA32.5mg/L，FeSO4?7H2O24mg/L，MnSO4?4H2O3.9mg/L，ZnSO4?7H2O1.3mg/L，H3BO31.4mg/L，KI0.65mg/L，肌醇100mg/L，丙三醇5.0mg/L，二水柠檬酸钠0.3mg/L，叶酸0.3mg/L，甘氨酸2.0mg/L，赖氨酸2.0mg/L，维生素B11.0mg/L，维生素B60.5mg/L，烟酸0.5mg/L，蔗糖50g/L，植物凝胶5.5g/L；
2，4-D2.0mg/L，NAA0.5mg/L，4-氯-2-甲基苯氧基乙酸5mg/L，甲基亚硝基脲2.0g/L，5-溴尿嘧啶0.3g/L，水解蛋白0.3g/L，牛磺酸0.05mg/L，生物素0.05mg/L，pH5.9。
D-阿拉伯糖基-2-去氧已糖的添加浓度设置以下8种：0；0.05mg/L；0.1mg/L；0.2mg/L；0.25mg/L；0.3mg/L；0.4mg/L；0.5mg/L。
同样选取该两个粳稻品种作为花药供体，操作方法、培养方法同实施例1，计算愈伤组织诱导率。
实施例3
配制如下配方的培养基（凝固剂的优选）：
KNO32400mg/L，(NH4)2SO4400mg/L，KH2PO4400mg/L，CaCl2?2H2O140mg/L，MgSO4?7H2O160mg/L，Na2-EDTA32.5mg/L，FeSO4?7H2O24mg/L，MnSO4?4H2O3.9mg/L，ZnSO4?7H2O1.3mg/L，H3BO31.4mg/L，KI0.65mg/L，肌醇100mg/L，丙三醇5.0mg/L，二水柠檬酸钠0.3mg/L，叶酸0.3mg/L，甘氨酸2.0mg/L，赖氨酸2.0mg/L，维生素B11.0mg/L，维生素B60.5mg/L，烟酸0.5mg/L，蔗糖50g/L，D-阿拉伯糖基-2-去氧已糖0.15g/L；
2，4-D2.0mg/L，NAA0.5mg/L，4-氯-2-甲基苯氧基乙酸5mg/L，甲基亚硝基脲2.0g/L，5-溴尿嘧啶0.3g/L，水解蛋白0.3g/L，牛磺酸0.05mg/L，生物素0.05mg/L，pH5.9。
凝固剂设置为以下2种：植物凝胶2.75g/L，琼脂3.5g；琼脂7g。
同样选取该两个粳稻品种作为花药供体，操作方法、培养方法同实施例1，计算愈伤组织诱导率。
实施例4
配制如下配方的培养基（激素配比浓度的优选）：
KNO32400mg/L，(NH4)2SO4400mg/L，KH2PO4400mg/L，CaCl2?2H2O140mg/L，MgSO4?7H2O160mg/L，Na2-EDTA32.5mg/L，FeSO4?7H2O24mg/L，MnSO4?4H2O3.9mg/L，ZnSO4?7H2O1.3mg/L，H3BO31.4mg/L，KI0.65mg/L，肌醇100mg/L，丙三醇5.0mg/L，二水柠檬酸钠0.3mg/L，叶酸0.3mg/L，甘氨酸2.0mg/L，赖氨酸2.0mg/L，维生素B11.0mg/L，维生素B60.5mg/L，烟酸0.5mg/L，蔗糖50g/L，D-阿拉伯糖基-2-去氧已糖0.15g/L，植物凝胶5.5g/L；
4-氯-2-甲基苯氧基乙酸5mg/L，甲基亚硝基脲2.0g/L，5-溴尿嘧啶0.3g/L，水解蛋白0.3g/L，牛磺酸0.05mg/L，生物素0.05mg/L，pH5.9。
2，4D和NAA组合浓度设置为以下8种：2，4D0.5mg/L，NAA0.5mg/L；2，4D1mg/L，NAA0.5mg/L；2，4D1.5mg/L，NAA0.5mg/L；2，4D2.5mg/L，NAA0.5mg/L；2，4D3mg/L，NAA0.5mg/L；2，4D2mg/L，NAA0.25mg/L；2，4D2mg/L，NAA0.75mg/L；2，4D2mg/L，NAA1mg/L。
同样选取该两个粳稻品种作为花药供体，操作方法、培养方法同实施例1，计算愈伤组织诱导率。
实施例5
配制如下配方的培养基（4-氯-2-甲基苯氧基乙酸添加浓度的优选）：
KNO32400mg/L，(NH4)2SO4400mg/L，KH2PO4400mg/L，CaCl2?2H2O140mg/L，MgSO4?7H2O160mg/L，Na2-EDTA32.5mg/L，FeSO4?7H2O24mg/L，MnSO4?4H2O3.9mg/L，ZnSO4?7H2O1.3mg/L，H3BO31.4mg/L，KI0.65mg/L，肌醇100mg/L，丙三醇5.0mg/L，二水柠檬酸钠0.3mg/L，叶酸0.3mg/L，甘氨酸2.0mg/L，赖氨酸2.0mg/L，维生素B11.0mg/L，维生素B60.5mg/L，烟酸0.5mg/L，蔗糖50g/L，D-阿拉伯糖基-2-去氧已糖0.15g/L，植物凝胶5.5g/L；
2，4-D2.0mg/L，NAA0.5mg/L，甲基亚硝基脲2.0g/L，5-溴尿嘧啶0.3g/L，水解蛋白0.3g/L，牛磺酸0.05mg/L，生物素0.05mg/L，pH5.9。
4-氯-2-甲基苯氧基乙酸的添加浓度设置为以下7种：0；1mg/L；2mg/L；3mg/L；4mg/L；6mg/L；7mg/L。
同样选取该两个粳稻品种作为花药供体，操作方法、培养方法同实施例1，计算愈伤组织诱导率。
实施例6
配制如下配方的培养基（甲基亚硝基脲添加浓度的优选）：
KNO32400mg/L，(NH4)2SO4400mg/L，KH2PO4400mg/L，CaCl2?2H2O140mg/L，MgSO4?7H2O160mg/L，Na2-EDTA32.5mg/L，FeSO4?7H2O24mg/L，MnSO4?4H2O3.9mg/L，ZnSO4?7H2O1.3mg/L，H3BO31.4mg/L，KI0.65mg/L，肌醇100mg/L，丙三醇5.0mg/L，二水柠檬酸钠0.3mg/L，叶酸0.3mg/L，甘氨酸2.0mg/L，赖氨酸2.0mg/L，维生素B11.0mg/L，维生素B60.5mg/L，烟酸0.5mg/L，蔗糖50g/L，D-阿拉伯糖基-2-去氧已糖0.15g/L，植物凝胶5.5g/L；
2，4-D2.0mg/L，NAA0.5mg/L，4-氯-2-甲基苯氧基乙酸5mg/L，5-溴尿嘧啶0.3g/L，水解蛋白0.3g/L，牛磺酸0.05mg/L，生物素0.05mg/L，pH5.9。
甲基亚硝基脲的添加浓度设置为以下5种：0；1mg/L；3mg/L；4mg/L；5mg/L。
同样选取该两个粳稻品种作为花药供体，操作方法、培养方法同实施例1，计算愈伤组织诱导率。
实施例7
配制如下配方的培养基（5-溴尿嘧啶添加浓度的优选）：
KNO32400mg/L，(NH4)2SO4400mg/L，KH2PO4400mg/L，CaCl2?2H2O140mg/L，MgSO4?7H2O160mg/L，Na2-EDTA32.5mg/L，FeSO4?7H2O24mg/L，MnSO4?4H2O3.9mg/L，ZnSO4?7H2O1.3mg/L，H3BO31.4mg/L，KI0.65mg/L，肌醇100mg/L，丙三醇5.0mg/L，二水柠檬酸钠0.3mg/L，叶酸0.3mg/L，甘氨酸2.0mg/L，赖氨酸2.0mg/L，维生素B11.0mg/L，维生素B60.5mg/L，烟酸0.5mg/L，蔗糖50g/L，D-阿拉伯糖基-2-去氧已糖0.15g/L，植物凝胶5.5g/L；
2，4-D2.0mg/L，NAA0.5mg/L，4-氯-2-甲基苯氧基乙酸5mg/L，甲基亚硝基脲2.0g/L，水解蛋白0.3g/L，牛磺酸0.05mg/L，生物素0.05mg/L，pH5.9。
5-溴尿嘧啶的添加浓度设置为以下5种：0；0.1g/L；0.2g/L；0.4g/L；0.5g/L。
同样选取该两个粳稻品种作为花药供体，操作方法、培养方法同实施例1，计算愈伤组织诱导率。
实施例8
配制如下配方的培养基（水解蛋白添加浓度的优选）：
KNO32400mg/L，(NH4)2SO4400mg/L，KH2PO4400mg/L，CaCl2?2H2O140mg/L，MgSO4?7H2O160mg/L，Na2-EDTA32.5mg/L，FeSO4?7H2O24mg/L，MnSO4?4H2O3.9mg/L，ZnSO4?7H2O1.3mg/L，H3BO31.4mg/L，KI0.65mg/L，肌醇100mg/L，丙三醇5.0mg/L，二水柠檬酸钠0.3mg/L，叶酸0.3mg/L，甘氨酸2.0mg/L，赖氨酸2.0mg/L，维生素B11.0mg/L，维生素B60.5mg/L，烟酸0.5mg/L，蔗糖50g/L，D-阿拉伯糖基-2-去氧已糖0.15g/L，植物凝胶5.5g/L；
2，4-D2.0mg/L，NAA0.5mg/L，4-氯-2-甲基苯氧基乙酸5mg/L，甲基亚硝基脲2.0g/L，5-溴尿嘧啶0.3g/L，牛磺酸0.05mg/L，生物素0.05mg/L，pH5.9。
水解蛋白添加浓度设置以下6种：0；0.1g/L；0.2g/L；0.4g/L；0.5g/L；0.6g/L。
同样选取该两个粳稻品种作为花药供体，操作方法、培养方法同实施例1，计算愈伤组织诱导率。
培养基对比实验
将实施例2-8分别与实施例1进行对比，对比的结果如下表所示：
从表1-7可以看出，使用本发明所提供的培养基比使用其它任何对比培养基诱导粳稻花药愈伤组织的效率更高，表明本发明提供的培养基配方是经过大量单因子、多因子试验所筛选的最优组合，多年来我们亦围绕本发明的组合配比做了小范围单因子改变优化组合试验，大量的实验研究亦得出本发明的组分配比是最优的。使用本发明所提供的培养基对粳稻品种通科粳、黑壳紫粳的愈伤组织诱导率高达39.2%和37.6%，充分说明了本发明提供的培养基是一种优良的粳稻花药诱导培养基。
实施例9
为了比较本发明所提供的培养基与前人采用的培养基诱导粳稻花药愈伤效果的差异，我们从相关文献查找了6个粳稻花药愈伤诱导培养基配方，配制成花药愈伤诱导培养基，同样选取粳稻品种通科粳和黑壳紫粳作为花药供体诱导花药愈伤，操作方法、培养方法同实施例1，计算愈伤组织诱导率。
其它6个诱导培养基为：
MS基本培养基+3％蔗糖、3％麦芽糖+2，4-D（2mg/L）、NAA（2mg/L）+琼脂（7g/L），pH为5.8（对比文件来自于汪庆等《高花药培养效率粳稻杂交组合的筛选》）；
N6基本培养基+3％蔗糖、3％麦芽糖+2，4-D（2mg/L）、NAA（2mg/L）+琼脂（7g/L），pH为5.8（对比文件来自于汪庆等《高花药培养效率粳稻杂交组合的筛选》）；
改良N6培养基配方：KNO32830mg/L，(NH4)2SO4463mg/L，KH2PO4400mg/L，MgSO4?7H2O185mg/L，CaCl2?2H2O166mg/L，MnSO4?4H2O4.4mg/L，ZnSO4?7H2O1.55mg/L，H3BO31.6mg/L，KI0.8mg/L，CuSO4?5H2O0.025mg/L，CoCl2?6H2O0.025mg/L，Na2MoO4?2H2O0.25mg/L，Fe-EDTA5.57mg/L，甘氨酸2mg/L，维生素B11mg/L，维生素B60.5mg/L，烟酸0.5mg/L，蔗糖50g/L，葡萄糖醇100mg/L，LH500mg/L，2，4-D2mg/L，琼脂6g，pH为5.8（对比文件来自于孙之荣等《粳稻花药培养基优化试验研究》）；
SK3基本培养基+2，4-D（2mg/L）、NAA（1mg/L）、KT（1mg/L）、LH（0.5g/L）+蔗糖（50g/L）+琼脂（4.2g/L），pH为5.8（对比文件来自于苗立新等《北方粳稻不同基因型花药培养特性比较》）；
M8基本培养基+3％蔗糖、3％麦芽糖+2，4-D（2mg/L）、NAA（2mg/L）+琼脂（7g/L），pH为5.8（对比文件来自于汪庆等《高花药培养效率粳稻杂交组合的筛选》）；
B5基本培养基+3％蔗糖、3％麦芽糖+2，4-D（2mg/L）、NAA（2mg/L）+琼脂（7g/L），pH为5.8（对比文件来自于汪庆等《高花药培养效率粳稻杂交组合的筛选》）。
培养基对比实验
将实施例9与实施例1进行对比，对比的结果如下表所示：
从不同培养基的诱导效果来看，本发明培养基对粳稻花药愈伤组织平均诱导率为38.4%，MS、N6、改良N6、SK3、M8、B5培养基则为3.2%、16.1%、22.7%、15.6%、9.2%、4.8%，可以发现本发明对粳稻花药愈伤组织的诱导率要显著高于其他6种诱导培养基。
以上9个实施例可以说明本发明提供的培养基配方的组分配比是最优组合，本发明提供的培养基对粳稻花药愈伤组织的诱导比前人发现的粳稻花药诱导培养基具有明显优势。我们的研究结果对于进一步推广和应用单倍体育种无疑有较大的现实意义和实用价值。
本领域技术人员可以根据本发明公开的内容和所掌握的本领域技术对本发明内容作出替换或变型，但是这些替换或变型都不应视为脱离本发明构思的，这些替换或变型均在本发明要求保护的权利范围内。

Claims (1)

1.一种粳稻花药诱导培养基配方，其特征在于该培养基的配方如下：
KNO32200～2600mg/L，(NH4)2SO4370～430mg/L，KH2PO4330～370mg/L，CaCl2?2H2O130～150mg/L，MgSO4?7H2O150～170mg/L，Na2-EDTA30～35mg/L，FeSO4?7H2O22～26mg/L，MnSO4?4H2O3.6～4.2mg/L，ZnSO4?7H2O1.2～1.4mg/L，H3BO31.3～1.5mg/L，KI0.6～0.7mg/L，肌醇90～110mg/L，丙三醇4.5～5.5mg/L，二水柠檬酸钠0.25～0.35mg/L，叶酸0.25～0.35mg/L，甘氨酸1.8～2.2mg/L，赖氨酸1.8～2.2mg/L，维生素B10.9～1.1mg/L，维生素B60.45～0.55mg/L，烟酸0.45～0.55mg/L，蔗糖45～55g/L，D-阿拉伯糖基-2-去氧已糖0.13～0.17g/L，植物凝胶5～6g/L；
2，4-D1.8～2.2mg/L，NAA0.45～0.55mg/L，4-氯-2-甲基苯氧基乙酸4.5～5.5mg/L，甲基亚硝基脲1.8～2.2g/L，5-溴尿嘧啶0.25～0.35g/L，水解蛋白0.27～0.33g/L，牛磺酸0.04～0.06mg/L，生物素0.04～0.06mg/L，pH5.8-6.0。
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