CN105961200B - 一种烟草花药分化培养基及配制方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种烟草花药分化培养基及配制方法。培养基配方由大量元素、微量元素、铁盐及络合剂、有机成分、无机添加物、植物生长调节剂、生理活性物质、碳源、凝固剂及其它添加物所组成。培养基的配制方法包括配制母液、制备生理活性物质、配制培养液、培养液加热溶解与分装、培养基高压蒸汽灭菌、培养基加入IAA等步骤。本发明所述的培养基具有对烟草花药愈伤组织分化成苗率高、培养基褐化轻的优点，可以显著提高烟草花药培养效率，大大加快烟草花培育种进程。

Description

一种烟草花药分化培养基及配制方法

技术领域

本发明涉及一种烟草花药分化培养基及配制方法，具体涉及一种可以显著提高烟草花药培养效率的烟草花药分化培养基及其配制方法，属于农业科学技术领域。

背景技术

烟草（Nicotiana tabacum）在植物分类学上属于双子叶植物纲、管花目、茄科、烟属，为一年年生或多年生经济作物。烟属多数是草本，少数呈灌木或乔木状，多数一年生，少数多年生，植株在种间差异较大，但都能产生植物碱。一般把烟属分为3个亚属，即黄花烟亚属、普通烟亚属和碧冬烟亚属，共计66个种。目前可直接利用的栽培种有普通烟草种和黄花烟草种，其它为野生种。

烟草起源于美洲、大洋洲及南太平洋的某些岛屿。大量考古发现证明，人类尚处于原始社会时，美洲印第安人就开始种植烟草，16世纪中叶烟草传入中国，并在中国迅速发展，现在我国烤烟种植面积、总产量和总销售额均居于世界首位，占据了全球1/3的卷烟市场、全球1/3的卷烟产量和全球1/3的烟叶产量，是名副其实的烟草大国。烟草在国民经济中具有很高的价值，在我国云南、河南、贵州等烟草大省，种烟面积为当地耕地面积的1/4，而烟草的经济效益则为农业总收入的一半以上。烟草是我国税收贡献率最高的产业之一，在云南等烟草大省地方财政收入的一半来自于烟草税。作为发展地方经济的主要来源，烟草业连续20年贡献近一成国家财政，烟草业作为第一大经济产业的地位难以动摇。如今烟草行业已发展成为一个十分庞大的产业链，涉及工、农、商、贸及与其生产配套的许多相关行业，据中国社科院工经所的相关统计，中国烟草行业拥有千亿资产和千万从业人员。可见，烟草业作为国民经济的一个重要产业，不仅可以推动农业发展，提高农民生活质量，增加地方和国家财政收入，促进就业，而且烟草是一种外销产品，能给国家带来大量的外汇收入。

近年来，我国烟草育种研究者通过杂交育种与传统育相结合的方法，从国外引进优良品种，并自己培育了红花大金元、云烟85、云烟87、中烟100、龙911等一批具有抗病性的优质烤烟新品种，丰富了烟草种质资源。然而我国在烟草育种和生产应用中却面临着如品种遗传基础狭窄、亲本匮乏、盲目性、重复性大等诸多严峻问题。具体体现在3个方面：1）目前我国烟草生产以引进品种为主，品种普遍表现抗病性弱、适应能力差，影响了我国烟草产量与品质的提高。2）部分国内选育的品种，不只特色品种少，而且烟叶香气质差、化学成分不协调、田间产量低、缺乏低危害草品种等，造成生产表现一般、外观及内在质量工艺性状等有所不足。3）常规育种周期长，盲目性大，不能满足烟叶生产的需要。

随着生物技术的快速发展，单倍体育种技术开始应用于烟草育种研究，目前运用单倍体技术成功地进行了体细胞远缘杂交、细胞培养以及理化诱变和加压选择等。烟草花药培养是单倍体技术最重要的操作手段，通过对烟草花药的离体培养诱导雄核发育、获得单倍体或双单倍体植株从而迅速获得烟草纯合系的花培育种技术不但可以缩短烟草的育种周期、加快烟草的育种进程，而且所获得的纯合系很有可能结合双亲的优点，获得更加优良的新种质，因而烟草花药离体培养技术的研究具有十分重要的理论意义和实际应用价值。

烟草花药培养育种虽取得很大的成功，但在理论和应用上仍存在一些问题。目前烟草花药胚状体或愈伤组织的诱导率和分化率还比较低，离实际应用要求有较大差距。因此，加快烟草花培育种机理研究，开发出花药愈伤诱导率分化率更高的培养基配方，具有重要的现实需求。

多年来我们对烟草花药培养进行了大量的摸索和实践，进一步优化了基本培养基，不断尝试加入一些提高烟草愈伤组织分化率的有机添加物并组合其种类搭配及浓度，最终摸索出了一种可大大提高烟草花药愈伤绿苗分化率的烟草花培分化培养基。我们的研究对烟草花培育种产业化具有重要的价值。

发明内容

本发明是针对目前烟草花药培养中愈伤组织绿苗分化率低的现状，提供了一种烟草花药分化培养基及其配制方法。

本发明的目的是通过以下方式实现的：

一种烟草花药分化培养基及配制方法，其特征在于：所述培养基的组成为：

大量元素：KNO₃ 900～1000mg/L，NH₄NO₃ 800～850mg/L，KH₂PO₄ 650～700mg/L，MgSO₄∙7H₂O 1400～1600mg/L，谷氨酰胺 360～420mg/L，CaCl₂∙2H₂O 200～240mg/L；

微量元素：MnSO₄∙4H₂O 17～19mg/L，ZnSO₄∙7H₂O 25～30mg/L，H₃BO₃ 5.5～7.0mg/L，KI 0.75～0.85mg/L；

铁盐及络合剂：FeSO₄∙7H₂O 80～90mg/L，Na₂-EDTA∙2H₂O 105～120mg/L；

有机成分：肌醇45～55mg/L，维生素B1 0.35～0.45mg/L，维生素B6 0.45～0.55mg/L，烟酸4.5～5.5mg/L，腺嘌呤22～28mg/L，甘氨酸 1.8～2.2mg/L，叶酸0.35～0.45mg/L，生物素 0.09～0.11mg/L；

无机添加物：活性炭 12～14g/L，甲基磺酸乙酯 28～32mg/L；

植物生长调节剂：2，4-D 0.55～0.65mg/L，IAA 0.16～0.2mg/L；

生理活性物质：马铃薯提取液 25～30g/L，椰乳18～22g/L；

碳源：葡萄糖 23～27g/L，麦芽糖 9～11g/L；

凝固剂及其它添加物：植物凝胶 6.5～7.0g/L，山梨醇23～27g/L，水解蛋白 0.9～1.1g/L。

所述的培养基的组分的最佳含量为：

大量元素：KNO₃ 950mg/L，NH₄NO₃ 825mg/L，KH₂PO₄ 675mg/L，MgSO₄∙7H₂O 1500mg/L，谷氨酰胺 390mg/L，CaCl₂∙2H₂O 220mg/L；

微量元素：MnSO₄∙4H₂O 18mg/L，ZnSO₄∙7H₂O 27.5mg/L，H₃BO₃ 6.25mg/L，KI 0.8mg/L；

铁盐及络合剂：FeSO₄∙7H₂O 85mg/L，Na₂-EDTA∙2H₂O 112.5mg/L；

有机成分：肌醇50mg/L，维生素B1 0.4mg/L，维生素B6 0.5mg/L，烟酸5.0mg/L，腺嘌呤25mg/L，甘氨酸 2.0mg/L，叶酸0.4mg/L，生物素 0.1mg/L；

无机添加物：活性炭 13g/L，甲基磺酸乙酯 30mg/L；

植物生长调节剂：2，4-D 0.6mg/L，IAA 0.18mg/L；

生理活性物质：马铃薯提取液 27.5g/L，椰乳20g/L；

碳源：葡萄糖 25g/L，麦芽糖 10g/L；

凝固剂及其它添加物：植物凝胶 6.75g/L，山梨醇25g/L，水解蛋白 1.0g/L。

所述的培养基配方的配制pH值为：5.6～6.0，最佳配制pH值为5.8。

所述的培养基的配制方法包括如下步骤：

（1）配制母液

大量元素、微量元素、铁盐及络合剂母液分别配制成10、100、10倍的母液；肌醇单独配制成100倍母液，其它有机成分配制成500倍母液；IAA称量好后用少量无水酒精溶解，然后用热的蒸馏水定容，2，4-D称量好后加入1mol/L的NaOH，磁力搅拌器搅拌10h即溶解，2，4-D和IAA母液均配制成0.5g/L；

所有母液预先配制，4℃冷藏保存备用，IAA需用棕色容量瓶装，避光保存；

（2）制备生理活性物质

马铃薯提取液的制备：将马铃薯块茎洗净后称取50g，带皮切成碎片，加入100ml蒸馏水，煮沸20min，用4～6层纱布过滤静置，待沉淀后将取上清液；

椰乳的提取：将新鲜椰汁从椰壳中取出放入容器中，加热至80℃左右，稍静置后过滤至密封塑料瓶中，-20℃冷藏保存备用；

（3）配制培养液

先在烧杯中加入一些蒸馏水，分别量取所需量的大量元素、微量元素、铁盐及络合剂、有机成分母液加入烧杯中，将称量好的无机添加物、山梨醇、水解蛋白、2，4-D，马铃薯提取液和椰乳加入烧杯中，搅拌溶解定容至1L后用pH计调节pH值；

（4）培养液加热溶解与分装

将称量好的植物凝胶加入配好的培养液中，用电炉加热至沸腾，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈透明状后停止加热，稍微冷却后，按照50ml培养基/瓶分装入200ml三角瓶中，封口膜密封，扎紧；

（5）培养基高压蒸汽灭菌

将三角瓶置于温度为121℃、压力为15kPa高压蒸汽条件下灭菌20min，而后降温至55℃左右取出，置于超净工作台中；

（6）培养基内添加IAA

按照50ml培养基/瓶的用量计算需加入的IAA母液用量，无菌操作下加入已灭菌的IAA母液，趁热摇匀，密封后自然冷却。

所述步骤6中的IAA母液的灭菌方法为：用灭菌的0.22μm的微孔滤膜无菌操作，过滤灭菌。

本发明所述的培养基具有对烟草花药愈伤组织分化成苗率高、培养基褐化轻的优点，可以显著提高烟草花药培养效率，大大加快烟草花培育种进程。

具体实施方式

下面结合实施案例对本发明作进一步说明，而非限制本发明。

实施例1

（1）配制母液

大量元素母液：按照培养基中大量元素的配方：KNO₃ 950mg/L，NH₄NO₃ 825mg/L，KH₂PO₄ 675mg/L，MgSO₄∙7H₂O 1500mg/L，谷氨酰胺 390mg/L，CaCl₂∙2H₂O 220mg/L配制大量元素母液，各成分溶解在一起，配制为10倍的母液；

微量元素母液：按照培养基中微量元素的配方：MnSO₄∙4H₂O 18mg/L，ZnSO₄∙7H₂O27.5mg/L，H₃BO₃ 6.25mg/L，KI 0.8mg/L配制微量元素母液，各成分溶解在一起，配制为100倍的母液；

铁盐及络合剂母液：按照培养基中铁盐及络合剂的配方：FeSO₄∙7H₂O 85mg/L，Na₂-EDTA∙2H₂O 112.5mg/L配制铁盐及络合剂母液，二者溶解在一起，配制为10倍的母液；

肌醇母液：按照培养基中肌醇的配方：肌醇 50mg/L单独配制肌醇母液，配制成100倍母液；

有机成分母液：按照培养基中其它有机成分的配方：维生素B1 0.4mg/L，维生素B60.5mg/L，烟酸5.0mg/L，腺嘌呤25mg/L，甘氨酸 2.0mg/L，叶酸0.4mg/L，生物素 0.1mg/L配制有机成分母液，各成分溶解在一起，配制为500倍的母液；

植物生长调节剂母液：IAA称量好后用少量无水酒精溶解，然后用热的蒸馏水定容，2，4-D称量好后加入1mol/L的NaOH，磁力搅拌器搅拌10h即溶解，2，4-D和IAA母液均配制成0.5g/L；

所有母液预先配制，4℃冷藏保存备用，IAA需用棕色容量瓶装，避光保存；

（2）制备生理活性物质

马铃薯提取液的制备：将马铃薯块茎洗净后称取50g，带皮切成碎片，加入100ml蒸馏水，煮沸20min，用4～6层纱布过滤静置，待沉淀后将取上清液；

椰乳的提取：将新鲜椰汁从椰壳中取出放入容器中，加热至80℃左右，稍静置后过滤至密封塑料瓶中，-20℃冷藏保存备用；

（3）配制培养液

先在烧杯中加入一些蒸馏水，分别量取所需量的大量元素、微量元素、铁盐及络合剂、有机成分母液加入烧杯中，将称量好的无机添加物、山梨醇、水解蛋白、2，4-D，马铃薯提取液和椰乳加入烧杯中，搅拌溶解定容至1L后用pH计调节pH值；

（4）培养液加热溶解与分装

将称量好的植物凝胶加入配好的培养液中，用电炉加热至沸腾，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈透明状后停止加热，稍微冷却后，按照50ml培养基/瓶分装入200ml三角瓶中，封口膜密封，扎紧；

（5）培养基高压蒸汽灭菌

将三角瓶置于温度为121℃、压力为15kPa高压蒸汽条件下灭菌20min，而后降温至55℃左右取出，置于超净工作台中；

（6）培养基内添加IAA

将IAA母液预先用灭菌的0.22μm的微孔滤膜无菌操作，过滤灭菌，然后按照50ml培养基/瓶的用量计算需加入的IAA母液用量，无菌操作下加入已灭菌的IAA母液，趁热摇匀，密封后自然冷却。

选择烟草品种云烟100和龙911作为花药培养的烟草花药供体，2015年取大田生长的该两个烟草品种单核晚期的花药进行诱导培养，花药愈伤组织产生后，挑选直径为6～8毫米大小的愈伤组织接种于该分化培养基上诱导绿苗，培养条件控制为：温度27℃、湿度75%、光照2500lx l4h/暗10h，待绿苗分化生长到苗高1.5cm以上时，计算愈伤组织绿苗分化率和白化苗率。绿苗分化率（%）=分化绿苗数/转移的愈伤块数×100%；白化苗率（%）=白化苗数/转移的愈伤块数×100%，结果如下表。

由上表可以发现，本发明提供的烟草花药分化培养基对烟草品种云烟100和龙911的花药愈伤平均绿苗分化率高达55.1%，而白化苗率仅23.2%，可以发现本发明的烟草花药分化培养基是一种高效的烟草花药分化培养基。我们的研究结果对于进一步推广和应用烟草单倍体育种具有极大的价值。

本领域技术人员可以根据本发明公开的内容和所掌握的本领域技术对本发明内容作出替换或变型，但是这些替换或变型都不应视为脱离本发明构思的，这些替换或变型均在本发明要求保护的权利范围内。

Claims (5)

1.一种烟草花药分化培养基，其特征在于：所述培养基的组成为：

大量元素：KNO₃ 900～1000mg/L，NH₄NO₃ 800～850mg/L，KH₂PO₄ 650～700mg/L，MgSO₄∙7H₂O 1400～1600mg/L，谷氨酰胺360～420mg/L，CaCl₂∙2H₂O 200～240mg/L；

微量元素：MnSO₄∙4H₂O 17～19mg/L，ZnSO₄∙7H₂O 25～30mg/L，H₃BO₃ 5.5～7.0mg/L，KI0.75～0.85mg/L；

铁盐及络合剂：FeSO₄∙7H₂O 80～90mg/L，Na₂-EDTA∙2H₂O 105～120mg/L；

有机成分：肌醇45～55mg/L，维生素B1 0.35～0.45mg/L，维生素B6 0.45～0.55mg/L，烟酸4.5～5.5mg/L，腺嘌呤22～28mg/L，甘氨酸1.8～2.2mg/L，叶酸0.35～0.45mg/L，生物素0.09～0.11mg/L；

无机添加物：活性炭 12～14g/L，甲基磺酸乙酯 28～32mg/L；

植物生长调节剂：2,4-D 0.55～0.65mg/L，IAA 0.16～0.2mg/L；

生理活性物质：马铃薯提取液 25～30g/L，椰乳18～22g/L；

碳源：葡萄糖 23～27g/L，麦芽糖 9～11g/L；

凝固剂及其它添加物：植物凝胶 6.5～7.0g/L，山梨醇23～27g/L，水解蛋白0.9～1.1g/L。

2.根据权利要求1所述的烟草花药分化培养基，其特征在于：所述的培养基的组成为：

大量元素：KNO₃ 950mg/L，NH₄NO₃ 825mg/L，KH₂PO₄ 675mg/L，MgSO₄∙7H₂O 1500mg/L，谷氨酰胺390mg/L，CaCl₂∙2H₂O 220mg/L；

微量元素：MnSO₄∙4H₂O 18mg/L，ZnSO₄∙7H₂O 27.5mg/L，H₃BO₃ 6.25mg/L，KI0.8mg/L；

铁盐及络合剂：FeSO₄∙7H₂O 85mg/L，Na₂-EDTA∙2H₂O 112.5mg/L；

有机成分：肌醇50mg/L，维生素B1 0.4mg/L，维生素B6 0.5mg/L，烟酸5.0mg/L，腺嘌呤25mg/L，甘氨酸2.0mg/L，叶酸0.4mg/L，生物素0.1mg/L；

无机添加物：活性炭13g/L，甲基磺酸乙酯30mg/L；

植物生长调节剂：2,4-D 0.6mg/L，IAA 0.18mg/L；

生理活性物质：马铃薯提取液27.5g/L，椰乳20g/L；

碳源：葡萄糖25g/L，麦芽糖10g/L；

凝固剂及其它添加物：植物凝胶 6.75g/L，山梨醇25g/L，水解蛋白1.0g/L。

3.根据权利要求1或2所述的烟草花药分化培养基，其特征在于：所述的培养基的pH值为：5.6～6.0。

4.根据权利要求1、2或3所述的烟草花药分化培养基的配制方法，其特征在于：所述的培养基的配制方法包括如下步骤：

（1）配制母液

大量元素、微量元素、铁盐及络合剂分别配制成10、100、10倍的母液；肌醇单独配制成100倍母液，其它有机成分配制成500倍母液；IAA称量好后用少量无水酒精溶解，然后用热的蒸馏水定容，2,4-D称量好后加入1mol/L的NaOH，磁力搅拌器搅拌10h即溶解，2,4-D和IAA母液均配制成0.5g/L；

所有母液预先配制，4℃冷藏保存备用，IAA需用棕色容量瓶装，避光保存；

（2）制备生理活性物质

马铃薯提取液的制备：将马铃薯块茎洗净后称取50g，带皮切成碎片，加入100ml蒸馏水，煮沸20min，用4～6层纱布过滤静置，待沉淀后取上清液；

椰乳的提取：将新鲜椰汁从椰壳中取出放入容器中，加热至80℃左右，稍静置后过滤至密封塑料瓶中，-20℃冷藏保存备用；

（3）配制培养液

先在烧杯中加入一些蒸馏水，分别量取所需量的大量元素、微量元素、铁盐及络合剂、有机成分母液加入烧杯中，将称量好的无机添加物、山梨醇、水解蛋白、2,4-D、马铃薯提取液和椰乳加入烧杯中，搅拌溶解定容至1L后用pH计调节pH值；

（4）培养液加热溶解与分装

将称量好的植物凝胶加入配好的培养液中，用电炉加热至沸腾，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈透明状后停止加热，稍微冷却后，按照50ml培养基/瓶分装入200ml三角瓶中，封口膜密封，扎紧；

（5）培养基高压蒸汽灭菌

将三角瓶置于温度为121℃、压力为15kPa高压蒸汽条件下灭菌20min，而后降温至55℃取出，置于超净工作台中；

（6）培养基内添加IAA

按照50ml培养基/瓶的用量计算需加入的IAA母液用量，无菌操作下加入已灭菌的IAA母液，趁热摇匀，密封后自然冷却。

5.根据权利要求4所述的烟草花药分化培养基及配制方法，其特征在于：所述步骤（6）中IAA母液的灭菌方法为：用灭菌的0.22μm的微孔滤膜无菌操作，过滤灭菌。