CN108142289A - 一种基于活性炭和柠檬酸的烟草外植体防褐化方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于活性炭和柠檬酸的烟草外植体防褐化方法，包括如下步骤：步骤（1），种子的消毒；步骤（2），种子培养；步骤（3），烟草外植体预培养；步骤（4），烟草外植体组织培养；步骤（5），外植体防褐化培养；本发明将多种防褐化手段有效结合，彼此作用，不仅防褐化效果更佳，还使得生根天数大幅度缩短，外植体褐化率为9.9‑15.9%，外植体7‑10天生根，培养40‑46天，根长＞1cm，根数≥2条，效果良好。

Description

一种基于活性炭和柠檬酸的烟草外植体防褐化方法

技术领域

本发明涉及一种烟草外植体防褐化方法，具体是一种基于活性炭和柠檬酸的烟草外植体防褐化方法，属于植物组织培养领域。

背景技术

烟草是一种经济价值较高的作物，在我国占有巨大的经济市场。烟草除主要用于吸食、蛋白食用和药用外，还具有广泛的用途。随着植物科学的发展，烟草作为基础研究和应用中的模式作物在植物遗传、发育、生理生化和此生代谢研究等方面发挥了重要的作用。但是烟草外植体在组织培养过程中的褐化问题是多发的常见的，几乎不可避免，所以防止褐化是在烟草组织培养中要极力解决的问题。

产生褐化现象的外植体仍能生长并生根，但增殖速度和生根率受到明显影响，情况严重还会导致外植体基部逐渐褐化并危及其生存。由于褐化现象只出现在少数组培苗中，而且与外植体材料的生理状态有一定的关系，因此在外植体选材时需尽量选取幼嫩的生长旺盛的外植体，继代过程中需要抛弃老枝部分，只将新生部分继代，这样可以减少部分褐化现象，但是这种操作所培养出的组培苗数量较少，不适宜大规模的生产。

克服烟草外植体褐化的方法主要有：接种前用抗氧化剂短时间浸泡外植体；培养基添加抗褐化剂（抗氧化剂、抗氧化酶活性促进剂和酚类物质吸附剂）；外植体热激处理（45-50℃抑杀多酚氧化酶、苯并氨酸酶），培养物多次转移到新鲜培养基。然而，这些方法虽然能起到一定的防褐化作用，但是效果不显著。

针对烟草外植体，需要探索一种效果更好的防褐化方法。

发明内容

为了解决上述为问题，本发明的目的在于提供一种基于活性炭和柠檬酸的烟草外植体防褐化方法，可有效缓解烟草组培过程中出现的褐化问题。

本发明采用解决技术问题方案如下：

一种基于活性炭和柠檬酸的烟草外植体防褐化方法，其特征在于：包括如下步骤：

步骤（1），种子的消毒；

步骤（2），种子培养：将步骤（1）得到的种子接种到MS培养基中培养，种子发芽长成外植体幼苗，然后用浸泡过生土豆的水涂覆外植体幼苗表面；种子的培养条件为：在培养温度为25±1℃，光照强度30-50μmol/(m²·s)，光照时间为16h/d的条件下培养60d；

步骤（3），烟草外植体预培养：将步骤（2）中得到的外植体幼苗转移并接种于添加有10-15g/L核桃粒且包括有MS基本培养基、4g/L琼脂、30g/L蔗糖的MS预培养固体培养基中培养，控制温度为24℃，光照强度为1500lux，光照时间为10小时/天，培养时间为3天，最后将得到预培养后的外植体，反复接种于MS培养基4-5次，使组织中的酚类物质部分渗入培养基；

步骤（4），烟草外植体组织培养：将步骤（3）中得到的外植体置于MS分化培养基中培养，控制白天温度为28℃，夜间温度为25℃，光照强度为30-50μmol/(m²·s)，光照时间为16小时/天，培养时间为7天，得到外植体愈伤组织；

步骤（5），外植体防褐化培养：将步骤（4）中得到的外植体置于MS防褐化培养基中，控制白天温度为28℃，夜间温度为25℃，光照强度为30-50μmol/(m²·s)，光照时间为16小时/天，培养时间为40天；MS防褐化培养基为MS基本培养基中添加0.3-1.0g/L活性炭、4-8mg/L柠檬酸、30g/L蔗糖和4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.7。

进一步地，步骤（1）中，种子消毒的具体步骤为：取饱满的烟草种子，然后移至超净工作台上，用75％酒精将种子浸泡30s，无菌水冲洗2遍，再用1％AgNO₃消毒10min，无菌水浸泡清洗5次，用无菌滤纸吸干种子表面水分后进行接种，其中无菌水为经高压灭菌的超纯水。

进一步地，步骤（2）中，MS培养基为MS基本培养基中添加30g/L蔗糖和4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.7。

进一步地，步骤（4）中，MS分化培养基为MS基本培养基中添加0.5mg/L的萘乙酸NAA、2mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、30g/L蔗糖和4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.7。

进一步地，步骤（6）中，MS防褐化培养基的制备方法如下：

配制1L MS防褐化培养基：将4.43g MS基本培养基、30g蔗糖和1L超纯水混合，并调节培养基的pH值为5.7；添加4-8mg/L柠檬酸，0.3-1.0g/L活性炭和4g琼脂，121℃灭菌15min；

灭菌后，摇匀培养基。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：

1、添加活性炭和柠檬酸在培养基中，可以有效缓解烟草外植体褐化现象，改善外植体整体的分化状态，并且能够缩短组培苗生根时间，增加根长和生根数量，符合了继续进行继代培养和直接进行移栽种植的要求。

2、本发明用浸泡过土豆的清水涂覆外植体表面，浸泡过生土豆的水里含有淀粉和多酚酶等物质，使外植体表面覆有易氧化物质隔绝种子与空气的接触，进一步减少褐化的发生。

3、本发明在分化培养之前将烟草外植体接种于添加了核桃粒的MS培养基进行预培养，核桃粒富含褪黑激素，清除自由基，可以防止细胞氧化损伤致褐化。

4、本发明将多种防褐化手段有效结合，彼此作用，不仅防褐化效果更佳，还使得生根天数大幅度缩短，外植体褐化率为9.9-15.9%，外植体7-10天生根，培养40-46天，根长＞1cm，根数≥2条，效果良好。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。

本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

实施例1

本实施例的基于活性炭和柠檬酸的烟草外植体防褐化方法，包括如下步骤：

步骤（1），种子的消毒：取饱满的烟草种子，然后移至超净工作台上，用75％酒精将种子浸泡30s，无菌水冲洗2遍，再用1％AgNO₃消毒10min，无菌水浸泡清洗5次，用无菌滤纸吸干种子表面水分后进行接种，其中无菌水为经高压灭菌的超纯水。

步骤（2），种子培养：将步骤（1）得到的种子接种到MS培养基中，在培养温度为25±1℃，光照强度30μmol/(m2·s)，光照时间为16h/d的条件下培养60d，种子发芽长成外植体幼苗，然后用浸泡过生土豆的水涂覆表面，浸泡过生土豆的水里含有淀粉和多酚酶等物质，使外植体表面覆有易氧化物质隔绝与空气的接触。MS培养基为MS基本培养基中添加30g/L蔗糖和4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.7。

步骤（3），烟草外植体预培养：将步骤（2）中得到的外植体幼苗转移并接种于添加有13g/L核桃粒且包括有MS基本培养基、4g/L琼脂、30g/L蔗糖的MS预培养固体培养基中培养。控制温度为24℃，光照强度为1500lux，光照时间为10小时/天，培养时间为3天，最后将得到预培养后的外植体，反复接种于MS培养基4-5次，使组织中的酚类物质部分渗入培养基，可以促进外植体快速出芽。核桃粒富含褪黑激素，清除自由基，防止细胞氧化损伤致褐化。

步骤（4），烟草外植体组织培养：将步骤（3）中得到的外植体置于MS分化培养基中培养，控制白天温度为28℃，夜间温度为25℃，光照强度为30-50μmol/(m²·s)，光照时间为16小时/天，培养时间为7天，得到烟草外植体愈伤组织，MS分化培养基为MS基本培养基中添加0.5mg/L的萘乙酸NAA、2mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、30g/L蔗糖和4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.7；

步骤（5），外植体防褐化培养：将步骤4中得到的外植体愈伤组织置于MS防褐化培养基中，控制白天温度为28℃，夜间温度为25℃，光照强度为30-50μmol/(m²·s)，光照时间为16小时/天，培养时间为40天，MS防褐化培养基的制备方法如下：

配制1L MS防褐化培养基：将4.43g MS基本培养基、30g蔗糖和1L超纯水混合，并调节培养基的pH值为5.7；添加8mg/L柠檬酸、1.0g/L活性炭和4g琼脂，121℃灭菌15min；灭菌后，摇匀培养基，防止活性炭沉底。1L的MS防褐化培养基约可倒100mm培养皿30个，150mm培养皿10个，300mL培养瓶15个。

本实施例中，外植体褐化率为15.9%，外植体10天生根，培养46天，根长＞1cm，根数≥2条。

实施例2

本实施例的基于活性炭和柠檬酸的烟草外植体防褐化方法，其中：

步骤（1）-（2）与实施例1相同；

步骤（3），烟草外植体预培养：将步骤（2）中得到的外植体幼苗转移并接种于添加有10g/L核桃粒且包括有MS基本培养基、4g/L琼脂、30g/L蔗糖的MS预培养固体培养基中培养。控制温度为24℃，光照强度为1500lux，光照时间为10小时/天，培养时间为3天，最后将得到预培养后的外植体，反复接种于MS培养基4-5次，使组织中的酚类物质部分渗入培养基，可以促进外植体快速出芽。核桃粒富含褪黑激素，清除自由基，防止细胞氧化损伤致褐化。

步骤（4）与实施例1相同；

步骤（5），外植体防褐化培养：将步骤（4）中得到的外植体愈伤组织置于MS防褐化培养基中，控制白天温度为28℃，夜间温度为25℃，光照强度为30-50μmol/(m²·s)，光照时间为16小时/天，培养时间为40天，MS防褐化培养基的制备方法如下：

配制1L MS防褐化培养基：将4.43g MS基本培养基、30g蔗糖和1L超纯水混合，并调节培养基的pH值为5.7；添加5mg/L柠檬酸、0.6g/L活性炭和4g琼脂，121℃灭菌15min；灭菌后，摇匀培养基，防止活性炭沉底。其余与实施例1相同。

本实施例中，外植体褐化率为9.9%，外植体7天生根，培养44天，根长＞1cm，根数≥2条。

实施例3

本实施例的基于活性炭和柠檬酸的烟草外植体防褐化方法，其中：

步骤（1）-（2）与实施例1相同；

步骤（3），烟草外植体预培养：将步骤（2）中得到的外植体幼苗转移并接种于添加有15g/L核桃粒且包括有MS基本培养基、4g/L琼脂、30g/L蔗糖的MS预培养固体培养基中培养。控制温度为24℃，光照强度为1500lux，光照时间为10小时/天，培养时间为3天，最后将得到预培养后的外植体，反复接种于MS培养基4-5次，使组织中的酚类物质部分渗入培养基，可以促进外植体快速出芽。核桃粒富含褪黑激素，清除自由基，防止细胞氧化损伤致褐化。

步骤（4）与实施例1相同；

步骤（5），外植体防褐化培养：将步骤（4）中得到的外植体愈伤组织置于MS防褐化培养基中，控制白天温度为28℃，夜间温度为25℃，光照强度为30-50μmol/(m²·s)，光照时间为16小时/天，培养时间为40天。MS防褐化培养基的制备方法如下：

配制1L MS防褐化培养基：将4.43g MS基本培养基、30g蔗糖和1L超纯水混合，并调节培养基的pH值为5.7；添加4mg/L柠檬酸、0.3g/L活性炭和4g琼脂，121℃灭菌15min；灭菌后，摇匀培养基，防止活性炭沉底。其余与实施例1相同。

本实施例中，外植体褐化率为12.4%，外植体8天生根，培养44天，根长＞1cm，根数≥2条。

对照实验：

对照实验在种子培养步骤中不用浸泡过生土豆的清水涂覆表面，不进行烟草外植体预培养，其余与实施例1相同，外植体褐化率为31.2％，外植体15天左右生根，培养50天，根长＞1cm，根数≥2条。可见，仅适用防褐化剂的情况下，有一定的防褐化效果，但是生根天数较长。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (5)

1.一种基于活性炭和柠檬酸的烟草外植体防褐化方法，其特征在于：包括如下步骤：

步骤（1），种子的消毒；

步骤（2），种子培养：将步骤（1）得到的种子接种到MS培养基中培养，种子发芽长成外植体幼苗，然后用浸泡过生土豆的水涂覆外植体幼苗表面；种子的培养条件为：在培养温度为25±1℃，光照强度30-50μmol/(m²·s)，光照时间为16h/d的条件下培养60d；

步骤（3），烟草外植体预培养：将步骤（2）中得到的外植体幼苗转移并接种于添加有10-15g/L核桃粒且包括有MS基本培养基、4g/L琼脂、30g/L蔗糖的MS预培养固体培养基中培养，控制温度为24℃，光照强度为1500lux，光照时间为10小时/天，培养时间为3天，最后将得到预培养后的外植体，反复接种于MS培养基4-5次，使组织中的酚类物质部分渗入培养基；

步骤（4），烟草外植体组织培养：将步骤（3）中得到的外植体置于MS分化培养基中培养，控制白天温度为28℃，夜间温度为25℃，光照强度为30-50μmol/(m²·s)，光照时间为16小时/天，培养时间为7天，得到外植体愈伤组织；

步骤（5），外植体防褐化培养：将步骤（4）中得到的外植体置于MS防褐化培养基中，控制白天温度为28℃，夜间温度为25℃，光照强度为30-50μmol/(m²·s)，光照时间为16小时/天，培养时间为40天；MS防褐化培养基为MS基本培养基中添加0.3-1.0g/L活性炭、4-8mg/L柠檬酸、30g/L蔗糖和4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.7。

2.根据权利要求1所述的基于活性炭和柠檬酸的烟草外植体防褐化方法，其特征在于：步骤（1）中，种子消毒的具体步骤为：取饱满的烟草种子，然后移至超净工作台上，用75％酒精将种子浸泡30s，无菌水冲洗2遍，再用1％AgNO₃消毒10min，无菌水浸泡清洗5次，用无菌滤纸吸干种子表面水分后进行接种，其中无菌水为经高压灭菌的超纯水。

3.根据权利要求1所述的基于活性炭和维生素C的烟草外植体防褐化方法，其特征在于：步骤（2）中，MS培养基为MS基本培养基中添加30g/L蔗糖和4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.7。

4.根据权利要求1所述的基于活性炭和维生素C的烟草外植体防褐化方法，其特征在于：步骤（4）中，MS分化培养基为MS基本培养基中添加0.5mg/L的萘乙酸NAA、2mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、30g/L蔗糖和4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.7。

5.根据权利要求1所述的基于活性炭和维生素C的烟草外植体防褐化方法，其特征在于：步骤（6）中，MS防褐化培养基的制备方法如下：

配制1L MS防褐化培养基：将4.43g MS基本培养基、30g蔗糖和1L超纯水混合，并调节培养基的pH值为5.7；添加4-8mg/L柠檬酸，0.3-1.0g/L活性炭和4g琼脂，121℃灭菌15min；

灭菌后，摇匀培养基。