CN104839020A - 一种防止黄花蒿组织培养褐化的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种防止黄花蒿组织培养褐化的方法，取消毒后的黄花蒿的幼嫩茎段，将黄花蒿的幼嫩茎段浸泡于浓度为1.8～2.2g/L的可溶性聚乙烯吡咯烷酮溶液10～15min。本发明通过控制培养基的组分及pH及前处理能够有效防止酚氧化并吸收醌类物质，实现防止黄花蒿外植体褐化现象的产生，甚至完全消除褐化现象，实现黄花蒿的快速繁育，为生产提供大量优质种苗。
Description
技术领域
本发明涉及植物组织培养领域，具体涉及一种防止黄花蒿组织培养褐化的方法。
背景技术
黄花篙作为重要的药用植物，是一种宝贵的生物资源，其分布也极其广泛，是世界广布种，分布于欧洲、亚洲、非洲和美洲，主要栽培产地在中国，越南、肯尼亚、坦桑尼亚和印度等国也有栽培，但世界上青篙素类药物的原料80-90％来自中国。黄花篙基因型丰富，在自然条件下很难实现优良基因资源的人工保存及其繁殖利用。在天然植物中，青篙素含量普遍偏低，且不稳定，用大规模的自然或人工繁殖黄花篙来获得青篙素，不但会降低黄花篙的品质，破坏自然资源，不利于野生资源的保护而且还会受到自然条件的制约，而组织培养技术则可以克服以上问题，但在黄花蒿外植体的组织培养中，容易出现褐变现象，严重时会导致整个外植体变褐死亡，直接影响愈伤组织诱导及植株再生，因此在黄花蒿的组织培养中，防治褐变是至关重要的一个环节。寻找一种防止黄花蒿组织培养褐化的方法，是目前亟需解决的技术难题。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种防止黄花蒿组织培养褐化的方法，其通过控制培养基的组分及pH及前处理能够有效防止酚氧化并吸收醌类物质，实现防止黄花蒿外植体褐化现象的产生，甚至完全消除褐化现象，实现黄花蒿的快速繁育，为生产提供大量优质种苗。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种防止黄花蒿组织培养褐化的方法，取消毒后的黄花蒿的幼嫩茎段，将黄花蒿的幼嫩茎段浸泡于浓度为1.8～2.2g/L的可溶性聚乙烯吡咯烷酮溶液10～15min。
优选的是，所述的防止黄花蒿组织培养褐化的方法，所述的可溶性聚乙烯吡咯烷酮溶液为通过孔径为0.20～0.24μm的滤膜灭菌后的可溶性聚乙烯吡咯烷酮溶液。
优选的是，所述的防止黄花蒿组织培养褐化的方法，将浸泡后的黄花蒿的幼嫩茎段接种于MS诱导液体培养基进行诱导培养，所述的MS诱导液体培养基包括：MS、1.0～2.0mg/L的6-苄氨基腺嘌呤、0.3～0.6mg/L的萘乙酸、100～200mg/L的维生素C和0.1～0.5g/L的活性炭。
优选的是，所述的防止黄花蒿组织培养褐化的方法，调节所述的MS诱导液体培养基的pH值为5.3～5.7。
优选的是，所述的防止黄花蒿组织培养褐化的方法，在进行诱导培养之前，将黄花蒿的幼嫩茎段接种于MS预培养固体培养基进行预培养，重复2～3次，所述的MS预培养固体培养基包括：MS、4.5g/L琼脂、30g/L蔗糖。
优选的是，所述的防止黄花蒿组织培养褐化的方法，在黄花蒿的幼嫩茎段浸泡于聚乙烯吡咯烷酮溶液前，用浸泡过土豆的清水涂覆黄花蒿的幼嫩茎段表面，风干后用黑色罩布蒙住，置于磁场强度为100～200mT的磁场中磁化处理8～10min。
优选的是，所述的防止黄花蒿组织培养褐化的方法，黄花蒿的幼嫩茎段进行预培养期间，依次接种于分别添加有10～15g鱼腥草、10～15g核桃粒、10～15g蜂蜜的MS预培养固体培养基中，每次培养5～10天。
优选的是，所述的防止黄花蒿组织培养褐化的方法，将黄花蒿的幼嫩茎段接种于MS诱导液体培养基后，送入24～27℃的摇床内，转速为100～120r/min，培养5～10min，然后培养5～10天。
优选的是，所述的防止黄花蒿组织培养褐化的方法，黄花蒿的幼嫩茎段进行预培养时，控制温度为24～27℃，光照强度为1500lux，光照时间为10～12小时/天；黄花蒿的幼嫩茎段进行诱导培养时，控制温度为24～27℃，光照强度为2000lux，光照时间为10～12小时/天。
优选的是，所述的防止黄花蒿组织培养褐化的方法，黄花蒿的幼嫩茎段的消毒操作为：依次用1％洗洁精水溶液浸泡3～5min，线状自来水冲洗10～15min，用经高压灭菌的无菌水润洗一次，用75％体积分数的酒精浸泡30～50s，再用添加了2～3滴吐温-20的150mL，0.1％体积分数的升汞消毒6～8min，用经高压灭菌的无菌水润洗3～5次，最后去除表面水分。
本发明至少包括以下有益效果：
第一、本发明将黄花蒿的幼嫩茎段在PVP溶液中浸泡，PVP具有极低的毒性和生理惰性，对黄花蒿的幼嫩茎段无刺激，PVP为吸收剂，可以吸收醌类物质，PVP溶液的浓度为1.8～2.2g/L，可以针对黄花蒿物种有的放矢；将PVP溶液通过孔径为0.20～0.24μm的微孔滤膜灭菌，选择成本较超滤膜低的微孔滤膜，然后选择孔径较小的0.20～0.24μm，可以有效滤除微粒细菌，达到灭菌目的；然后反复接种于MS空白培养基中，使组织中的酚类物质部分渗入培养基，最后接种于MS诱导培养基中，采用适合黄花蒿外植体出芽的最佳pH，降低了常规组织培养的pH，在整个过程中多种关键手段防止褐化，攻克了技术难题；
第二、由于培养基的pH值可能对酚类物质和酚氧化酶结合部位产生影响，本发明诱导培养过程中降低了常规组织培养的pH，营造稍弱的酸性环境5.3～5.7，适合黄花蒿外植体出芽，有利于防止黄花蒿的幼嫩茎段褐化；
第三、本发明使用的MS诱导液体培养基在常规MS培养基基础上添加了传统的营养物质，但是却是最佳含量搭配，当含量达到如下时1.0～2.0mg/L的6-苄氨基腺嘌呤、0.3～0.6mg/L的萘乙酸，100～200mg/L的维生素C和0.1～0.5g/L的活性炭，可以促进黄花蒿的外植体快速出芽；
第四、本发明在诱导培养之前重复利用添加有琼脂和蔗糖的MS培养基预培养，使组织中的酚类物质部分渗入培养基中，更换新鲜的相同的培养基重复2～3次，切口愈合后，褐变即可减轻；
第五、本发明用浸泡过土豆的清水涂覆黄花蒿茎段表面，用轻薄的淀粉水凝聚在切口上风干，浸泡过生土豆的水里含有淀粉和多酚酶等物质，茎段切口表面覆有易氧化物质隔绝切口与空气的接触，用黑色罩布蒙住后进行暗处理，置于磁场强度为100～200mT的磁场中磁化处理8～10min，不利于酚类、醌类物质合成，然后浸泡于PVP溶液，可吸收醌类物质并洗去表面替代茎段氧化的淀粉类物质，露出茎段进行下步培养；
第六、将黄花蒿茎段依次接种于分别添加了不同物质的MS培养基进行预培养，鱼腥草对多种微生物均有抑制作用，可以对茎段表面消毒杀菌；蜂蜜可以遮挡鱼腥草的腥臭味，且可以促进褪黑激素的生成；核桃粒富含褪黑激素，清除自由基，防止细胞氧化损伤致褐化；
第七、将黄花蒿茎段接种于MS诱导液体培养基后，100～120r/min的转速使得茎段及培养基保持形态，5～10min摇床振荡让茎段充分吸收营养物质。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
<实施例1>
本发明提供了一种防止黄花蒿组织培养褐化的方法，包括以下步骤：
步骤一、取材：取材以黄花蒿幼嫩茎段为主，先去掉1cm长的茎尖，然后选取去掉茎尖后4cm长的幼嫩茎段，经常规消毒后(常规消毒是指依次用1％洗洁精水溶液浸泡3min，线状自来水冲洗10min，冲洗后在接种室超净台上用经高压灭菌的无菌水润洗一次，然后用75％的酒精浸泡30s，再用添加了2滴吐温-20的150ml，0.1％升汞消毒6min，无菌水冲洗3次，最后摊开在消毒滤纸上以除去表面水分)，去掉茎段的首尾部位，切成1cm长的茎段，立刻放入经0.22μm的滤膜灭菌的可溶性聚乙烯吡咯烷酮(PVP，2g/L)溶液中浸泡10min，最后摊开在消毒滤纸上以除去表面水分，得到无菌外植体；
步骤二、预培养：将步骤一外植体接种于MS空白培养基上，培养3d，再转移到空白培养基2次，每次培养3d，几轮循环持续时间15d，所述的MS空白培养基含有下列浓度物质：4.5g/L琼脂、30g/L蔗糖；
步骤三、诱导培养：将步骤二的外植体接种于MS诱导培养基中，所述的MS诱导培养基含有下列浓度物质：4.5g/L琼脂、30g/L蔗糖，6-BA1.5mg/L、NAA 0.5mg/L，150mg/L Vc，0.3g/L活性炭，pH 5.5，5-10d后即诱导出芽。
<实施例2>
本发明提供了一种防止黄花蒿组织培养褐化的方法，包括以下步骤：
步骤一、取材：取材以黄花蒿幼嫩茎段为主，先去掉3cm长的茎尖，然后选取去掉茎尖后7cm长的幼嫩茎段，经常规消毒后(常规消毒是指依次用1％洗洁精水溶液浸泡5min，线状自来水冲洗15min，冲洗后在接种室超净台上用经高压灭菌的无菌水润洗一次，然后用75％的酒精浸泡50s，再用添加了3滴吐温-20的150ml，0.1％升汞消毒8min，无菌水冲洗5次，最后摊开在消毒滤纸上以除去表面水分)，去掉茎段的首尾部位，切成2cm长的茎段，立刻放入经0.22μm的滤膜灭菌的可溶性聚乙烯吡咯烷酮(PVP，2g/L)溶液中浸泡15min，最后摊开在消毒滤纸上以除去表面水分，得到无菌外植体；
步骤二、预培养：将步骤一外植体接种于MS空白培养基上，培养4d，再转移到空白培养基3次，每次培养4d，几轮循环持续时间18d，所述的MS空白培养基含有下列浓度物质：4.5g/L琼脂、30g/L蔗糖；
步骤三、诱导培养：将步骤二的外植体接种于MS诱导培养基中，所述的MS诱导培养基含有下列浓度物质：4.5g/L琼脂、30g/L蔗糖，6-BA1.5mg/L、NAA0.5mg/L，150mg/L Vc，0.3g/L活性炭，pH 5.5，5-10d后即诱导出芽。
<实施例3>
本发明提供了一种防止黄花蒿组织培养褐化的方法，包括以下步骤：
步骤一、取材：取材以黄花蒿幼嫩茎段为主，先去掉2cm长的茎尖，然后选取去掉茎尖后5cm长的幼嫩茎段，经常规消毒后(常规消毒是指依次用1％洗洁精水溶液浸泡4min，线状自来水冲洗13min，冲洗后在接种室超净台上用经高压灭菌的无菌水润洗一次，然后用75％的酒精浸泡40s，再用添加了3滴吐温-20的150ml，0.1％升汞消毒7min，无菌水冲洗4次，最后摊开在消毒滤纸上以除去表面水分)，去掉茎段的首尾部位，切成2cm长的茎段，立刻放入经0.22μm的滤膜灭菌的可溶性聚乙烯吡咯烷酮(PVP，2g/L)溶液中浸泡13min，最后摊开在消毒滤纸上以除去表面水分，得到无菌外植体；
步骤二、预培养：将步骤一外植体接种于MS空白培养基上，培养4d，再转移到空白培养基3次，每次培养4d，几轮循环持续时间18d，所述的MS空白培养基含有下列浓度物质：4.5g/L琼脂、30g/L蔗糖；
步骤三、诱导培养：将步骤二的外植体接种于MS诱导培养基中，所述的MS诱导培养基含有下列浓度物质：4.5g/L琼脂、30g/L蔗糖，6-BA1.5mg/L、NAA 0.5mg/L，150mg/L Vc，0.3g/L活性炭，pH 5.5，8d后即诱导出芽。
<实施例4>
本发明提供了一种防止黄花蒿组织培养褐化的方法，包括以下步骤：
步骤一、取黄花蒿去除2cm的茎尖，然后取4cm的幼嫩茎段，消毒后去除首尾后切成1cm的茎段，用浸泡过土豆的清水涂覆表面，轻薄的淀粉水凝聚在切口上风干，浸泡过生土豆的水里含有淀粉和多酚酶等物质，茎段切口表面覆有易氧化物质隔绝切口与空气的接触，风干后用黑色罩布蒙住置于磁场强度为100mT的磁场中磁化处理8min，不利于酚类、醌类物质合成，然后将茎段取出并浸泡于所述的可溶性聚乙烯吡咯烷酮溶液10min，PVP具有极低的毒性和生理惰性，对黄花蒿的幼嫩茎段无刺激，PVP为吸收剂，可以吸收醌类物质，并洗去表面替代茎段氧化的淀粉类物质，露出茎段进行下步培养，去除表面水分，得到无菌的外植体；
步骤二、将步骤一得到的外植体接种于添加有10g鱼腥草且包括有MS、4.5g/L琼脂、30g/L蔗糖的MS预培养固体培养基中，控制温度为24℃，光照强度为1500lux，光照时间为10小时/天，培养时间为3天，鱼腥草对多种微生物均有抑制作用，可以对茎段表面消毒杀菌，然后将外植体转移并接种于浸泡有10g蜂蜜的MS预培养固体培养基中，控制温度为24℃，光照强度为1500lux，光照时间为10小时/天，培养时间为3天，蜂蜜可以遮挡鱼腥草的腥臭味，且可以促进褪黑激素的生成，最后将外植体转移并接种于混合有10g核桃粒的MS预培养固体培养基中，控制温度为24℃，光照强度为1500lux，光照时间为10小时/天，培养时间为3天，核桃粒富含褪黑激素，清除自由基，防止细胞氧化损伤致褐化，得到预培养后的外植体，反复接种于MS空白培养基使组织中的酚类物质部分渗入培养基，可以促进黄花蒿的外植体快速出芽；
步骤三、将步骤二得到的外植体接种于所述的MS诱导液体培养基中，pH值为5.3～5.7，降低了常规组织培养的pH，适合黄花蒿外植体出芽，有利于防止黄花蒿的幼嫩茎段褐化，MS诱导液体培养基包括：MS、1.0mg/L的6-苄氨基腺嘌呤、0.3mg/L的萘乙酸、100mg/L的维生素C和0.1g/L的活性炭，在常规MS培养基基础上添加了传统的营养物质，但是却是最佳含量搭配，可以促进黄花蒿的外植体快速出芽，送入24℃的摇床内，转速为100r/min使得茎段及培养基保持形态，培养5min，然后控制温度为24℃，光照强度为2000lux，光照时间为10小时/天，培养5天后，即诱导出芽。
<实施例5>
本发明提供了一种防止黄花蒿组织培养褐化的方法，包括以下步骤：
步骤一、取黄花蒿去除3cm的茎尖，然后取7cm的幼嫩茎段，消毒后去除首尾后切成2cm的茎段，用浸泡过土豆的清水涂覆表面，轻薄的淀粉水凝聚在切口上风干，浸泡过生土豆的水里含有淀粉和多酚酶等物质，茎段切口表面覆有易氧化物质隔绝切口与空气的接触，风干后用黑色罩布蒙住置于磁场强度为200mT的磁场中磁化处理10min，不利于酚类、醌类物质合成，然后将茎段取出并浸泡于所述的可溶性聚乙烯吡咯烷酮溶液15min，PVP具有极低的毒性和生理惰性，对黄花蒿的幼嫩茎段无刺激，PVP为吸收剂，可以吸收醌类物质，并洗去表面替代茎段氧化的淀粉类物质，露出茎段进行下步培养，去除表面水分，得到无菌的外植体；
步骤二、将步骤一得到的外植体接种于添加有15g鱼腥草且包括有MS、4.5g/L琼脂、30g/L蔗糖的MS预培养固体培养基中，控制温度为27℃，光照强度为1500lux，光照时间为12小时/天，培养时间为5天，鱼腥草对多种微生物均有抑制作用，可以对茎段表面消毒杀菌，然后将外植体转移并接种于浸泡有15g蜂蜜的MS预培养固体培养基中，控制温度为27℃，光照强度为1500lux，光照时间为12小时/天，培养时间为5天，蜂蜜可以遮挡鱼腥草的腥臭味，且可以促进褪黑激素的生成，最后将外植体转移并接种于混合有15g核桃粒的MS预培养固体培养基中，控制温度为27℃，光照强度为1500lux，光照时间为12小时/天，培养时间为5天，核桃粒富含褪黑激素，清除自由基，防止细胞氧化损伤致褐化，得到预培养后的外植体，反复接种于MS空白培养基使组织中的酚类物质部分渗入培养基，可以促进黄花蒿的外植体快速出芽；
步骤三、将步骤二得到的外植体接种于所述的MS诱导液体培养基中，pH值为5.3～5.7，降低了常规组织培养的pH，适合黄花蒿外植体出芽，有利于防止黄花蒿的幼嫩茎段褐化，MS诱导液体培养基包括：MS、2.0mg/L的6-苄氨基腺嘌呤、0.6mg/L的萘乙酸、200mg/L的维生素C和0.5g/L的活性炭，在常规MS培养基基础上添加了传统的营养物质，但是却是最佳含量搭配，可以促进黄花蒿的外植体快速出芽，送入27℃的摇床内，转速为120r/min使得茎段及培养基保持形态，培养10min，然后控制温度为24℃，光照强度为2000lux，光照时间为12小时/天，培养10天后，即诱导出芽。
<实施例6>
本发明提供了一种防止黄花蒿组织培养褐化的方法，包括以下步骤：
步骤一、取黄花蒿去除3cm的茎尖，然后取6cm的幼嫩茎段，消毒后去除首尾后切成2cm的茎段，用浸泡过土豆的清水涂覆表面，轻薄的淀粉水凝聚在切口上风干，浸泡过生土豆的水里含有淀粉和多酚酶等物质，茎段切口表面覆有易氧化物质隔绝切口与空气的接触，风干后用黑色罩布蒙住置于磁场强度为150mT的磁场中磁化处理9min，不利于酚类、醌类物质合成，然后将茎段取出并浸泡于所述的可溶性聚乙烯吡咯烷酮溶液12min，PVP具有极低的毒性和生理惰性，对黄花蒿的幼嫩茎段无刺激，PVP为吸收剂，可以吸收醌类物质，并洗去表面替代茎段氧化的淀粉类物质，露出茎段进行下步培养，去除表面水分，得到无菌的外植体；
步骤二、将步骤一得到的外植体接种于添加有12g鱼腥草且包括有MS、4.5g/L琼脂、30g/L蔗糖的MS预培养固体培养基中，控制温度为25℃，光照强度为1500lux，光照时间为11小时/天，培养时间为4天，鱼腥草对多种微生物均有抑制作用，可以对茎段表面消毒杀菌，然后将外植体转移并接种于浸泡有12g蜂蜜的MS预培养固体培养基中，控制温度为25℃，光照强度为1500lux，光照时间为11小时/天，培养时间为4天，蜂蜜可以遮挡鱼腥草的腥臭味，且可以促进褪黑激素的生成，最后将外植体转移并接种于混合有12g核桃粒的MS预培养固体培养基中，控制温度为25℃，光照强度为1500lux，光照时间为11小时/天，培养时间为4天，核桃粒富含褪黑激素，清除自由基，防止细胞氧化损伤致褐化，得到预培养后的外植体，反复接种于MS空白培养基使组织中的酚类物质部分渗入培养基，可以促进黄花蒿的外植体快速出芽；
步骤三、将步骤二得到的外植体接种于所述的MS诱导液体培养基中，pH值为5.3～5.7，降低了常规组织培养的pH，适合黄花蒿外植体出芽，有利于防止黄花蒿的幼嫩茎段褐化，所述的MS诱导液体培养基包括：MS、1.5mg/L的6-苄氨基腺嘌呤、0.5mg/L的萘乙酸、150mg/L的维生素C和0.3g/L的活性炭，在常规MS培养基基础上添加了传统的营养物质，但是却是最佳含量搭配，可以促进黄花蒿的外植体快速出芽，送入25℃的摇床内，转速为110r/min使得茎段及培养基保持形态，培养8min，培养8天后，即诱导出芽。
<对比例1>
取材以黄花蒿幼嫩茎段为主，先去掉2cm长的茎尖，然后选取去掉茎尖后5cm长的幼嫩茎段，经常规消毒后直接接种于MS培养基中，pH值为5.8。
表1各实施例对黄花蒿组织培养褐化率及生长的影响
| 对比例1 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | 实施例5 | 实施例6 | |
| 褐化率(％) | 42.5 | 27.2 | 22.4 | 21.6 | 14.8 | 13.7 | 12.1 |
| 诱导率(％) | 53.8 | 74.2 | 72.4 | 76.7 | 80.5 | 79.6 | 82.4 |
由表1可看出，用灭菌后的PVP溶液浸泡黄花蒿的幼嫩茎段，反复接种于添加有琼脂和蔗糖的培养基，然后接种于降低pH值的MS诱导培养基，可有效降低黄花蒿组织培养的褐化率，并提高黄花蒿的诱导率；并且，用浸泡过土豆的清水涂覆黄花蒿茎段表面，用黑色罩布蒙住后置于磁场中磁化处理，然后将黄花蒿茎段依次接种于分别添加了鱼腥草、蜂蜜、核桃粒的MS培养基进行预培养，然后将黄花蒿茎段接种于MS诱导液体培养基后摇床振荡，能够进一步降低黄花蒿组织培养的褐化率，并提高黄花蒿的诱导率。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本风能并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。
Claims (10)
1.一种防止黄花蒿组织培养褐化的方法，其特征在于，取消毒后的黄花蒿的幼嫩茎段，将黄花蒿的幼嫩茎段浸泡于浓度为1.8～2.2g/L的可溶性聚乙烯吡咯烷酮溶液10～15min。
2.如权利要求1所述的防止黄花蒿组织培养褐化的方法，其特征在于，所述的可溶性聚乙烯吡咯烷酮溶液为通过孔径为0.20～0.24μm的滤膜灭菌后的可溶性聚乙烯吡咯烷酮溶液。
3.如权利要求2所述的防止黄花蒿组织培养褐化的方法，其特征在于，将浸泡后的黄花蒿的幼嫩茎段接种于MS诱导液体培养基进行诱导培养，所述的MS诱导液体培养基包括：MS、1.0～2.0mg/L的6-苄氨基腺嘌呤、0.3～0.6mg/L的萘乙酸、100～200mg/L的维生素C和0.1～0.5g/L的活性炭。
4.如权利要求3所述的防止黄花蒿组织培养褐化的方法，其特征在于，调节所述的MS诱导液体培养基的pH值为5.3～5.7。
5.如权利要求4所述的防止黄花蒿组织培养褐化的方法，其特征在于，在进行诱导培养之前，将黄花蒿的幼嫩茎段接种于MS预培养固体培养基进行预培养，重复2～3次，所述的MS预培养固体培养基包括：MS、4.5g/L琼脂、30g/L蔗糖。
6.如权利要求5所述的防止黄花蒿组织培养褐化的方法，其特征在于，在黄花蒿的幼嫩茎段浸泡于聚乙烯吡咯烷酮溶液前，用浸泡过土豆的清水涂覆黄花蒿的幼嫩茎段表面，风干后用黑色罩布蒙住，置于磁场强度为100～200mT的磁场中磁化处理8～10min。
7.如权利要求6所述的防止黄花蒿组织培养褐化的方法，其特征在于，黄花蒿的幼嫩茎段进行预培养期间，依次接种于分别添加有10～15g鱼腥草、10～15g核桃粒、10～15g蜂蜜的MS预培养固体培养基中，每次培养5～10天。
8.如权利要求7所述的防止黄花蒿组织培养褐化的方法，其特征在于，将黄花蒿的幼嫩茎段接种于MS诱导液体培养基后，送入24～27℃的摇床内，转速为100～120r/min，培养5～10min，然后培养5～10天。
9.如权利要求8所述的防止黄花蒿组织培养褐化的方法，其特征在于，黄花蒿的幼嫩茎段进行预培养时，控制温度为24～27℃，光照强度为1500lux，光照时间为10～12小时/天；黄花蒿的幼嫩茎段进行诱导培养时，控制温度为24～27℃，光照强度为2000lux，光照时间为10～12小时/天。
10.如权利要求1所述的防止黄花蒿组织培养褐化的方法，其特征在于，黄花蒿的幼嫩茎段的消毒操作为：依次用1％洗洁精水溶液浸泡3～5min，线状自来水冲洗10～15min，用经高压灭菌的无菌水润洗一次，用75％体积分数的酒精浸泡30～50s，再用添加了2～3滴吐温-20的150mL，0.1％体积分数的升汞消毒6～8min，用经高压灭菌的无菌水润洗3～5次，最后去除表面水分。
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