CN115918540A - 消除黄花蒿组织培养中细菌污染的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种消除黄花蒿组织培养中细菌污染的方法，包括以下步骤：1)将受细菌污染的黄花蒿组培苗进行预处理以清除表面细菌；2)将步骤1)得到的组培苗接种至MS去菌培养基中培养15‑30天，得到去菌组培苗，MS去菌培养基中含有50‑150mg/L的卡那霉素，0.05％‑1.0％的植物组培抗菌剂；3)将去菌组培苗接种至MS除菌培养基中培养15‑30天，得到无菌组培苗，MS除菌培养基中含有20‑50mg/L的卡那霉素，2‑20mg/L的头孢噻肟钠；4)将无菌组培苗接入复壮培养基中培养20‑30天得到黄花蒿健康组培苗。本发明能够消除黄花蒿组织培养中的细菌污染，为种质保存及工厂化生产提供健康种源保证。
Description
技术领域
本发明涉及植物组织培养技术领域。更具体地说，本发明涉及一种消除黄花蒿组织培养中细菌污染的方法。
背景技术
黄花蒿(Artemisia annua L.)又名青蒿、臭蒿、香蒿、苦蒿，为菊科(Compositae)蒿属(Artemisia L.)一年生草本植物，是传统中药，具有清热解暑、除蒸、截疟的功效，早在公元340年东晋医药学家葛洪《肘后备急方》中就有记载。黄花蒿作为重要的药用植物，是一种宝贵的生物资源，其分布极其广泛，是世界广布种，但世界上青蒿素类药物的原料80％～90％来自中国。黄花篙基因型丰富，在自然条件下很难实现优良基因资源的人工保存及其繁殖利用。在天然黄花蒿植物中，青篙素含量普遍偏低，且不稳定，用大规模的自然或人工繁殖黄花篙来获得青篙素，不但会降低黄花篙的品质，破坏自然资源，不利于野生资源的保护而且还会受到自然条件的制约，而组织培养技术则可以克服以上问题，而且可以实现优良种质的长期保存。但实验过程中发现，在黄花蒿组培苗的继代与保存过程中，随着时间的推移，组培苗基部会遇到大量的细菌污染并产生恶性循环，严重时培养基表面出现白色或黄色水渗样物质，使污染的组培苗生长缓慢，既不增殖也不生根，甚至死亡，试验材料无法得到保存，并给后续试验及种苗推广带来巨大的损失，因此摸索消除黄花蒿组织培养中细菌污染的方法具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种消除黄花蒿组织培养中细菌污染的方法，能显著降低甚至消除黄花蒿组织培养中的细菌污染，能为种质保存及工厂化生产提供健康种源保证。
为了实现本发明的目的和其它优点，提供了一种消除黄花蒿组织培养中细菌污染的方法，包括以下步骤：
1)将受细菌污染的黄花蒿组培苗进行预处理以清除表面细菌，备用；
2)将步骤1)得到的组培苗接种至MS去菌培养基中培养15-30天，得到去菌组培苗，MS去菌培养基中含有50-150mg/L的卡那霉素，0.05％-1.0％的植物组培抗菌剂；
3)将步骤2)得到的去菌组培苗接种至MS除菌培养基中培养15-30天，得到无菌组培苗，MS除菌培养基中含有20-50mg/L的卡那霉素，2-20mg/L的头孢噻肟钠；
4)将无菌组培苗接入复壮培养基中复壮培养20-30天得到黄花蒿健康组培苗。
优选的是，所述的消除黄花蒿组织培养中细菌污染的方法，MS去菌培养基和MS除菌培养基中还均含有0.3mg/L的6-苄基氨基嘌呤、0.3mg/L的萘乙酸、30g/L的蔗糖和4.5g/L的琼脂，其pH值为5.8。
优选的是，所述的消除黄花蒿组织培养中细菌污染的方法，复壮培养基中含有0.5mg/L的6-苄基氨基嘌呤、0.5mg/L的萘乙酸，30g/L的蔗糖和4.5g/L的琼脂，1g/L的活性炭，其pH值为5.8。
优选的是，所述的消除黄花蒿组织培养中细菌污染的方法，步骤1)中预处理具体为：将受细菌污染的黄花蒿组培苗去除部分叶片，留健壮枝干，放入含有50-100mg/L卡那霉素、0.5-1g/L的聚乙烯吡咯烷酮的无菌水中，在气浴恒温振荡器中以10-50rpm转速摇5-30分钟，然后以无菌水清洗3-5次。
优选的是，所述的消除黄花蒿组织培养中细菌污染的方法，步骤2)去菌培养、步骤3)中除菌培养以及步骤4)中复壮培养时，培养温度为24-27℃，光照强度为2000lux，光照时间为10-12小时/天。
优选的是，所述的消除黄花蒿组织培养中细菌污染的方法，MS去菌培养基中含有100-120mg/L的卡那霉素，0.5％的植物组培抗菌剂。
优选的是，所述的消除黄花蒿组织培养中细菌污染的方法，MS除菌培养基中含有40-50mg/L的卡那霉素，15mg/L的头孢噻肟钠。
优选的是，所述的消除黄花蒿组织培养中细菌污染的方法，步骤2)中去菌培养15天，MS去菌培养基中含有50mg/L的卡那霉素，0.5％的植物组培抗菌剂；
步骤3)中除菌培养15天，MS除菌培养基中含有20mg/L的卡那霉素，15mg/L的头孢噻肟钠，还含有0.01mg/L的蜂毒与30μmol/L的茉莉酸甲酯，且除菌培养时由白光与红蓝光交替环境下光照处理，先白光光照7小时/天，再红蓝光光照3小时/天，最后暗培养14小时/天，依次循环，其中红光与蓝光比为3:1。
优选的是，所述的消除黄花蒿组织培养中细菌污染的方法，复壮培养30天，复壮培养基中还含有0.2％的EM菌、0.05mg/L的壳寡糖与20μmol/L的茉莉酸甲酯。
本发明至少包括以下有益效果：
(1)本发明将受污染的黄花蒿组培苗经去菌培养与除菌培养之后，黄花蒿组培苗的污染率可降至1.7％，壮苗培养的萌发率可达90％，增殖系数可达3.24，且组培苗初期生长正常，后续萌芽正常，叶片黄绿，长势较好。
(2)在除菌培养时，发明人发现加入适宜浓度的蜂毒可以刺激黄花蒿组培苗，适宜浓度的茉莉酸甲酯可以增强黄花蒿组培苗的防御能力，结合红蓝光照处理，对卡那霉素的杀菌效果起到增效作用，故而可以降低卡那霉素浓度，减少除菌培养时间，减小卡那霉素对黄花蒿组培苗长势的影响，提高组培苗继续培养的萌发率与增殖系数，且发明人意外发现，黄花蒿组培苗的叶片中青蒿素含量显著增加。
(3)复壮培养基添加EM菌、壳寡糖与茉莉酸甲酯，可以增强黄花蒿的代谢能力与自身的抗性，增强其长势，提高增殖系数。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
需要说明的是，下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
一种消除黄花蒿组织培养中细菌污染的方法，包括以下步骤：
1)将受细菌污染的黄花蒿组培苗进行预处理以清除表面细菌，备用；
2)将步骤1)得到的组培苗接种至MS去菌培养基中培养15-30天，得到去菌组培苗，MS去菌培养基中含有50-150mg/L的卡那霉素，0.05％-1.0％的植物组培抗菌剂(PPM，购买得到，植物组培抗菌剂的用量以质量百分数计)；
3)将步骤2)得到的去菌组培苗接种至MS除菌培养基中培养15-30天，得到无菌组培苗，MS除菌培养基中含有20-50mg/L的卡那霉素，2-20mg/L的头孢噻肟钠；
4)将无菌组培苗接入复壮培养基中复壮培养20-30天得到黄花蒿健康组培苗。
更优地，所述的消除黄花蒿组织培养中细菌污染的方法，MS去菌培养基和MS除菌培养基中还均含有0.3mg/L的6-苄基氨基嘌呤、0.3mg/L的萘乙酸、30g/L的蔗糖和4.5g/L的琼脂，其pH值为5.8。
更优地，所述的消除黄花蒿组织培养中细菌污染的方法，复壮培养基中含有0.5mg/L的6-苄基氨基嘌呤、0.5mg/L的萘乙酸，30g/L的蔗糖和4.5g/L的琼脂，1g/L的活性炭，其pH值为5.8。
更优地，所述的消除黄花蒿组织培养中细菌污染的方法，步骤1)中预处理具体为：将受细菌污染的黄花蒿组培苗去除部分叶片，留健壮枝干，放入含有50-100mg/L卡那霉素、0.5-1g/L的聚乙烯吡咯烷酮的无菌水中，在气浴恒温振荡器中以10-50rpm转速摇5-30分钟，然后以无菌水清洗3-5次。
更优地，所述的消除黄花蒿组织培养中细菌污染的方法，步骤2)去菌培养、步骤3)中除菌培养以及步骤4)中复壮培养时，培养温度为24-27℃，光照强度为2000lux，光照时间为10-12小时/天。
更优地，所述的消除黄花蒿组织培养中细菌污染的方法，MS去菌培养基中含有100-120mg/L的卡那霉素，0.5％的植物组培抗菌剂(用量以质量百分数计)，MS除菌培养基中含有40-50mg/L的卡那霉素，15mg/L的头孢噻肟钠。在本技术方案下，黄花蒿组培苗的污染率可降至1.7％，壮苗培养的萌发率可达90％，增殖系数可达3.24，且组培苗初期生长正常，后续萌芽正常，叶片黄绿，长势较好。
更优地，所述的消除黄花蒿组织培养中细菌污染的方法，步骤2)中去菌培养15天，MS去菌培养基中含有50mg/L的卡那霉素，0.5％的植物组培抗菌剂(用量以质量百分数计)；
步骤3)中除菌培养15天，MS除菌培养基中含有20mg/L的卡那霉素，15mg/L的头孢噻肟钠，还含有0.01mg/L的蜂毒与30μmol/L的茉莉酸甲酯，且除菌培养时由白光与红蓝光交替环境下光照处理，先白光光照7小时/天，再红蓝光光照3小时/天，最后暗培养14小时/天，依次循环，其中红光与蓝光比为3:1。在本技术方案下，发明人发现在除菌培养时，加入适宜浓度的蜂毒可以刺激黄花蒿组培苗，适宜浓度的茉莉酸甲酯可以增强黄花蒿组培苗的防御能力，结合红蓝光照处理，对卡那霉素的杀菌效果起到增效作用，故而可以降低卡那霉素浓度，减少除菌培养时间，减小卡那霉素对黄花蒿组培苗长势的影响，提高组培苗继续培养的萌发率与增殖系数，且发明人意外发现，黄花蒿组培苗的叶片中青蒿素含量显著增加。
更优地，所述的消除黄花蒿组织培养中细菌污染的方法，复壮培养30天，复壮培养基中还含有0.2％的EM菌(用量以质量百分数计)、0.05mg/L的壳寡糖与20μmol/L的茉莉酸甲酯。在本技术方案下，复壮培养基添加EM菌、壳寡糖与茉莉酸甲酯，可以增强黄花蒿的代谢能力与自身的抗性，增强其长势，提升增殖系数。
本发明的技术方案还可以包括以下技术细节，以更好地实现技术效果，本发明中所有的黄花蒿组培苗为同一来源得到。
实施例1：
一种消除黄花蒿组织培养中细菌污染的方法，包括以下步骤：
1)将受细菌污染的黄花蒿组培苗进行预处理以清除表面细菌，备用；
2)将步骤1)得到的组培苗接种至MS去菌培养基中培养30天，得到去菌组培苗，MS去菌培养基中含有120mg/L的卡那霉素，0.05％的植物组培抗菌剂(用量以质量百分数计)；
3)将步骤2)得到的去菌组培苗接种至MS除菌培养基中培养30天，得到无菌组培苗，MS除菌培养基中含有40mg/L的卡那霉素，2mg/L的头孢噻肟钠；
4)将无菌组培苗接入复壮培养基中复壮培养30天得到黄花蒿健康组培苗。
其中，MS去菌培养基和MS除菌培养基中还均含有0.3mg/L的6-苄基氨基嘌呤、0.3mg/L的萘乙酸、30g/L的蔗糖和4.5g/L的琼脂，其pH值为5.8。
其中，复壮培养基中含有0.5mg/L的6-苄基氨基嘌呤、0.5mg/L的萘乙酸，30g/L的蔗糖和4.5g/L的琼脂，1g/L的活性炭，其pH值为5.8。
其中，步骤1)中预处理具体为：将受细菌污染的黄花蒿组培苗去除部分叶片，留健壮枝干，放入含有50mg/L卡那霉素、0.5g/L的聚乙烯吡咯烷酮的无菌水中，在气浴恒温振荡器中以10rpm转速摇5分钟，然后以无菌水清洗3次。
其中，步骤2)去菌培养、步骤3)中除菌培养以及步骤4)中复壮培养时，培养温度为24-27℃，光照强度为2000lux，光照时间为10小时/天，光照为白光照射。
实施例2：
一种消除黄花蒿组织培养中细菌污染的方法，包括以下步骤：
1)将受细菌污染的黄花蒿组培苗进行预处理以清除表面细菌，备用；
2)将步骤1)得到的组培苗接种至MS去菌培养基中培养30天，得到去菌组培苗，MS去菌培养基中含有150mg/L的卡那霉素，1.0％的植物组培抗菌剂(用量以质量百分数计)；
3)将步骤2)得到的去菌组培苗接种至MS除菌培养基中培养30天，得到无菌组培苗，MS除菌培养基中含有50mg/L的卡那霉素，20mg/L的头孢噻肟钠；
4)将无菌组培苗接入复壮培养基中复壮培养30天得到黄花蒿健康组培苗。
其中，MS去菌培养基和MS除菌培养基中还均含有0.3mg/L的6-苄基氨基嘌呤、0.3mg/L的萘乙酸、30g/L的蔗糖和4.5g/L的琼脂，其pH值为5.8。
其中，复壮培养基中含有0.5mg/L的6-苄基氨基嘌呤、0.5mg/L的萘乙酸，30g/L的蔗糖和4.5g/L的琼脂，1g/L的活性炭，其pH值为5.8。
其中，步骤1)中预处理具体为：将受细菌污染的黄花蒿组培苗去除部分叶片，留健壮枝干，放入含有100mg/L卡那霉素、1g/L的聚乙烯吡咯烷酮的无菌水中，在气浴恒温振荡器中以50rpm转速摇30分钟，然后以无菌水清洗5次。
其中，步骤2)去菌培养、步骤3)中除菌培养以及步骤4)中复壮培养时，培养温度为24-27℃，光照强度为2000lux，光照时间为12小时/天，光照为白光照射。
实施例3：
一种消除黄花蒿组织培养中细菌污染的方法，包括以下步骤：
1)将受细菌污染的黄花蒿组培苗进行预处理以清除表面细菌，备用；
2)将步骤1)得到的组培苗接种至MS去菌培养基中培养30天，得到去菌组培苗，MS去菌培养基中含有100mg/L的卡那霉素，0.5％的植物组培抗菌剂(用量以质量百分数计)；
3)将步骤2)得到的去菌组培苗接种至MS除菌培养基中培养30天，得到无菌组培苗，MS除菌培养基中含有40mg/L的卡那霉素，15mg/L的头孢噻肟钠；
4)将无菌组培苗接入复壮培养基中复壮培养30天得到黄花蒿健康组培苗。
其中，MS去菌培养基和MS除菌培养基中还均含有0.3mg/L的6-苄基氨基嘌呤、0.3mg/L的萘乙酸、30g/L的蔗糖和4.5g/L的琼脂，其pH值为5.8。
其中，复壮培养基中含有0.5mg/L的6-苄基氨基嘌呤、0.5mg/L的萘乙酸，30g/L的蔗糖和4.5g/L的琼脂，1g/L的活性炭，其pH值为5.8。
其中，步骤1)中预处理具体为：将受细菌污染的黄花蒿组培苗去除部分叶片，留健壮枝干，放入含有50mg/L卡那霉素、0.5g/L的聚乙烯吡咯烷酮的无菌水中，在气浴恒温振荡器中以30rpm转速摇15分钟，然后以无菌水清洗4次。
其中，步骤2)去菌培养、步骤3)中除菌培养以及步骤4)中复壮培养时，培养温度为24-27℃，光照强度为2000lux，光照时间为10小时/天，光照为白光照射。
实施例4：
在实施例3的基础上，MS去菌培养基中含有120mg/L的卡那霉素，MS除菌培养基中含有50mg/L的卡那霉素。其余同实施例3。
实施例5：
在实施例3的基础上，步骤2)中去菌培养15天，MS去菌培养基中含有50mg/L的卡那霉素，0.5％的植物组培抗菌剂(用量以质量百分数计)；
步骤3)中除菌培养15天，MS除菌培养基中含有20mg/L的卡那霉素，15mg/L的头孢噻肟钠，还含有0.01mg/L的蜂毒与30μmol/L的茉莉酸甲酯，且除菌培养时由白光与红蓝光交替环境下光照处理，先白光光照7小时/天，再红蓝光光照3小时/天，最后暗培养14小时/天，依次循环，其中红光与蓝光比为3:1。其余同实施例3。
实施例6：
在实施例5的基础上，复壮培养30天，复壮培养基中还含有0.2％的EM菌(用量以质量百分数计)、0.05mg/L的壳寡糖与20μmol/L的茉莉酸甲酯。其余同实施例5。
对比例1：
在实施例3的基础上，去除步骤3)中除菌培养过程，其余同实施例3。
对比例2：
在实施例3的基础上，MS去菌培养基中卡那霉素浓度为50mg/L，MS除菌培养基中卡那霉素浓度为20mg/L，其余同实施例3。
对比例3：
在实施例5的基础上，MS除菌培养基中去除0.01mg/L的蜂毒，其余同实施例5。
对比例4：
在实施例5的基础上，MS除菌培养基中去除30μmol/L的茉莉酸甲酯，其余同实施例5。
对比例5：
在实施例5的基础上，除菌培养时由白光照射10小时/天，其余同实施例5。
对比例6：
在实施例6的基础上，复壮培养基去除0.2％的EM菌，其余同实施例6。
试验一、
发明人在对比例1的基础上，研究了步骤2)MS去菌培养基中卡那霉素浓度对黄花蒿组培苗细菌污染及生长的影响，结果发现，卡那霉素浓度越高，组培苗污染率越低，甚至在卡那霉素浓度为200mg/L时，污染率降至0％，但是高浓度的卡那霉素对黄花蒿组培苗伤害大，黄花蒿组培苗经去菌培养后壮苗培养的萌发率仅11.7％，增殖系数仅1.23，黄花蒿组培苗长势较差，因此，将去菌培养时MS去菌培养基中卡那霉素浓度控制在50-150mg/L之间，污染率控制在15％-65％之间。但该程度下得到的黄花蒿组培苗如不进行二次除菌培养，后续培养过程中，组培苗初期生长正常，但生长较长一段时间后，组培苗基部继续布满细菌，最终死亡。
试验二、
由于仅通过试验一中单次的去菌培养不能完全去除细菌，故进行了步骤3)中的除菌培养，二次除菌，发明人在实施例3的基础上，研究了步骤3)中除菌培养时卡那霉素浓度对黄花蒿组培苗细菌污染及生长的影响，结果发现，当步骤3)中除菌培养时MS除菌培养基中卡那霉素浓度依次为20、30、40、50、60、80mg/L时，组培苗污染率依次为21.7％、15％、3.3％、1.7％、0％、0％，组培苗培养萌芽率依次为78.3％、81.6％、86.7％、88.3％、83.3％、75％，增殖系数依次为1.64、1.82、3.17、3.19、1.76、1.24，卡那霉素浓度为20、30mg/L时，组培苗初期生长正常，后期仍受较小程度细菌污染，长势较慢，叶片较黄，当卡那霉素浓度为40、50mg/L时，组培苗初期生长正常，后续萌芽正常，叶片黄绿，长势较好，当那霉素浓度为60、80mg/L时，组培苗初期生长正常，后续萌芽正常，叶片黄绿，长势一般。从组培苗复壮培养后统计的萌芽率、增殖系数以及长势来看，步骤3)中除菌培养时那霉素浓度宜控制在40-50mg/L。
为了说明进一步说明本发明的消除黄花蒿组织培养中细菌污染的方法的技术效果，发明人还针对实施例3-6与对比例1-6的技术方案采用同一条件下获得的受细菌污染的黄花蒿组培苗进行了试验，每个技术方案每组20瓶样本，每瓶1株组培苗，并做3次平行试验，结果见表1。其中，污染率＝(组培苗继续细菌污染的瓶数/样本数)×100％，萌芽率＝(组培苗萌发新芽的瓶数/样本数)×100％，增殖系数＝(组培苗新芽增殖总芽数/萌芽瓶数)×100％，青蒿素含量取黄花蒿叶片测量，以干重计。
表1.不同技术方案对黄花蒿组培苗细菌污染及生长发育影响
从表1可知，实施例3与实施例4的技术方案，经过去菌培养与除菌培养，可以将污染的黄花蒿组培苗的污染率降至1.7％，复壮培养后萌芽率可达90％，增殖系数可达3.24，且复壮培养后的黄花蒿组培苗初期生长正常，后续萌芽正常，叶片黄绿，长势较好，可以进一步进行增殖培养或者保存。
从实施例5与实施例3对比可知，在除菌培养时，培养基中加入适宜浓度的蜂毒、茉莉酸甲酯，结合红蓝光照处理，可以降低卡那霉素浓度，减少除菌培养时间，减小卡那霉素对黄花蒿组培苗长势的影响，提高组培苗继续培养的萌发率与增殖系数，且黄花蒿组培苗的叶片中青蒿素含量显著增加。
从实施例6与实施例5的对比可知，复壮培养基添加EM菌、壳寡糖与茉莉酸甲酯，可以增强黄花蒿的代谢能力与自身的抗性，增强其长势，提高增殖系数。结合对比例6可知，EM菌对黄花蒿组培苗的复壮起到较大作用。
从实施例5与对比例2-5的对比可知，封毒在除菌培养时，可能对卡那霉素的除菌起到增效作用，故而可以在较低浓度的卡那霉素去菌培养与除菌培养时，使黄花蒿组培苗污染率大大降低，提高黄花蒿组培苗的萌发率，增强其长势，而红蓝光照处理和适宜浓度的茉莉酸甲酯对黄花蒿组培苗起到诱导与保护作用，进一步提高黄花蒿组培苗的生长状况，因此，三者缺一不可。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。
Claims (9)
1.消除黄花蒿组织培养中细菌污染的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将受细菌污染的黄花蒿组培苗进行预处理以清除表面细菌，备用；
2)将步骤1)得到的组培苗接种至MS去菌培养基中培养15-30天，得到去菌组培苗，MS去菌培养基中含有50-150mg/L的卡那霉素，0.05％-1.0％的植物组培抗菌剂；
3)将步骤2)得到的去菌组培苗接种至MS除菌培养基中培养15-30天，得到无菌组培苗，MS除菌培养基中含有20-50mg/L的卡那霉素，2-20mg/L的头孢噻肟钠；
4)将无菌组培苗接入复壮培养基中复壮培养20-30天得到黄花蒿健康组培苗。
2.如权利要求1所述的消除黄花蒿组织培养中细菌污染的方法，其特征在于，MS去菌培养基和MS除菌培养基中还均含有0.3mg/L的6-苄基氨基嘌呤、0.3mg/L的萘乙酸、30g/L的蔗糖和4.5g/L的琼脂，其pH值为5.8。
3.如权利要求1所述的消除黄花蒿组织培养中细菌污染的方法，其特征在于，复壮培养基中含有0.5mg/L的6-苄基氨基嘌呤、0.5mg/L的萘乙酸，30g/L的蔗糖和4.5g/L的琼脂，1g/L的活性炭，其pH值为5.8。
4.如权利要求1所述的消除黄花蒿组织培养中细菌污染的方法，其特征在于，步骤1)中预处理具体为：将受细菌污染的黄花蒿组培苗去除部分叶片，留健壮枝干，放入含有50-100mg/L卡那霉素、0.5-1g/L的聚乙烯吡咯烷酮的无菌水中，在气浴恒温振荡器中以10-50rpm转速摇5-30分钟，然后以无菌水清洗3-5次。
5.如权利要求1所述的消除黄花蒿组织培养中细菌污染的方法，其特征在于，步骤2)去菌培养、步骤3)中除菌培养以及步骤4)中复壮培养时，培养温度为24-27℃，光照强度为2000lux，光照时间为10-12小时/天。
6.如权利要求1-5中任一所述的消除黄花蒿组织培养中细菌污染的方法，其特征在于，MS去菌培养基中含有100-120mg/L的卡那霉素，0.5％的植物组培抗菌剂。
7.如权利要求6所述的消除黄花蒿组织培养中细菌污染的方法，其特征在于，MS除菌培养基中含有40-50mg/L的卡那霉素，15mg/L的头孢噻肟钠。
8.如权利要求1-5中任一所述的消除黄花蒿组织培养中细菌污染的方法，其特征在于，步骤2)中去菌培养15天，MS去菌培养基中含有50mg/L的卡那霉素，0.5％的植物组培抗菌剂；
步骤3)中除菌培养15天，MS除菌培养基中含有20mg/L的卡那霉素，15mg/L的头孢噻肟钠，还含有0.01mg/L的蜂毒与30μmol/L的茉莉酸甲酯，且除菌培养时由白光与红蓝光交替环境下光照处理，先白光光照7小时/天，再红蓝光光照3小时/天，最后暗培养14小时/天，依次循环，其中红光与蓝光比为3:1。
9.如权利要求8所述的消除黄花蒿组织培养中细菌污染的方法，其特征在于，复壮培养30天，复壮培养基中还含有0.2％的EM菌、0.05mg/L的壳寡糖与20μmol/L的茉莉酸甲酯。
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