CN116941530A - 黄花蒿离体保存方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种黄花蒿离体保存方法，属于黄花蒿组培技术领域，包括：将黄花蒿组培苗置于含1/2MS+6‑BA 0.02mg/L+活性炭0.5g/L+多效唑0.5～5mg/L+脯氨酸0.05～0.2mg/L的离体保存培养基中，在光照强度1200Lx、光照时长8小时/天、培养温度12～21℃的减少光照和降低温度的培养条件下，进行离体保存培养。本发明通过降低培养温度、减少光照时间、添加多效唑和脯氨酸使得黄花蒿组培苗保持6个月以上不用转接，存活率均在80％以上，最高可达96.7％，部分实施例可以做到400天存活率50％以上，有效减少了配置培养基和转接的步骤，节省了人力和时间，保证了存活率。
Description
技术领域
本发明涉及植物组培技术领域，具体的说是黄花蒿组培技术领域，更具体地说，本发明涉及一种黄花蒿离体保存方法。
背景技术
黄花蒿(Artemisia annua L.)又名青蒿、臭蒿、香蒿、苦蒿，为菊科(Compositae)蒿属(Artemisia L.)一年生草本植物，是传统中药，具有清热解暑，除蒸，截疟的功效，早在公元340年东晋医药学家葛洪《肘后备急方》中就有关于黄花蒿的记载。黄花蒿作为重要的药用植物，是一种宝贵的生物资源，其分布极其广泛，是世界广布种，但世界上青蒿素类药物的原料80％～90％来自中国。黄花篙基因型丰富，在自然条件下很难实现优良基因资源的人工保存及其繁殖利用。在天然黄花蒿植物中，青篙素含量普遍偏低，且不稳定，用大规模的自然繁殖黄花篙来获得青篙素，会降低黄花篙的品质，破坏自然资源，不利于野生资源的保护而且还会受到自然条件的制约。而组织培养技术则可以克服以上问题，而且可以实现优良种质的长期保存。
常规的黄花蒿组织培养过程中，除了耕种季节需要种苗扩繁和生根、移栽，其余时间组培苗都处于保苗保种状态，这个时候用常规的MS培养基离体保存的话，组培苗生长过快甚至变老，1个月左右就得转接，即会出现组培苗长得快，需要反复继代的问题，不利于黄花蒿种质的长期保存，因此寻找转接次数少保存时间长的离体保存方式很有必要。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种黄花蒿离体保存方法，其主要通过在培养条件上降低培养温度和弱化光照条件，以及在培养基上添加多效唑和脯氨酸，达到延长保存时间，减少转接次数，同时保持组培苗较高存活率的目的。
为了实现本发明的这些目的和其它优点，本发明提供的黄花蒿离体保存方法，包括：
将黄花蒿组培苗置于含1/2MS+6-BA0.02mg/L+活性炭0.5g/L+多效唑0.5～5mg/L+脯氨酸0.05～0.2mg/L的离体保存培养基中，在光照强度1200～1800Lx、光照时长8小时/天、培养温度12～21℃的减少光照和降低温度的培养条件下，进行离体保存培养。
优选的是，所述的黄花蒿离体保存方法中，所述培养温度为15～21℃，多效唑添加量为1.5～4.0mg/L、脯氨酸添加量为0.05～0.15mg/L。
优选的是，所述的黄花蒿离体保存方法中，所述培养温度为15～18℃，多效唑添加量为1.5～3.0mg/L、脯氨酸添加量为0.05～0.15mg/L。
优选的是，所述的黄花蒿离体保存方法中，所述培养温度为18℃，多效唑用量为1.5mg/L或2.0mg/L或3.0mg/L或4.0mg/L，脯氨酸用量为0.05mg/L或0.1mg/L或0.15mg/L。
优选的是，所述的黄花蒿离体保存方法中，所述培养温度为18℃，多效唑用量为3.0或4.0mg/L，脯氨酸用量为0.05mg/L或0.1mg/L。
优选的是，所述的黄花蒿离体保存方法中，所述培养温度为15℃，多效唑用量为3.0mg/L，脯氨酸用量为0.05mg/L。
优选的是，所述的黄花蒿离体保存方法中，所述离体保存培养中，以6～8天光照强度1200Lx，6～8天1800Lx进行光照处理，如此交替循环。
优选的是，所述的黄花蒿离体保存方法中，包括以下步骤：
步骤一、外植体准备：取黄花蒿的幼嫩枝条，自来水冲洗10-15分钟，剪下接近茎尖的幼嫩茎段，切成一个个1-2厘米长的带腋芽的茎段，备用；
步骤二、诱导培养：取步骤一的茎段，经无菌水冲洗3-5次后，放入75％的酒精消毒30秒，接着无菌水冲洗3-5次，再放入0.1％的升汞溶液中消毒6-8分钟，然后用无菌水冲洗3-5次，最后接入MS+6-BA0.5mg/L+KT 0.2mg/L培养基中，进行诱导培养得到无菌芽；培养温度为24-26℃，光照强度为1800LX，光照时长为10-12小时/天；
步骤三、扩繁培养：取步骤二中诱导出来的无菌芽，接种到MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L的培养基中进行扩繁培养得到扩繁芽；培养温度为24-26℃，光照强度为1800LX，光照时长为10-12小时/天；
步骤四、壮苗培养：取步骤三中得到的扩繁芽，接种到MS+IBA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+活性炭1g/L的培养基中进行壮苗培养得到组培苗；培养温度为24-26℃，光照强度为1800LX，光照时长为10-12小时/天；
步骤五、离体保存：取步骤四中经过壮苗培养的组培苗，接种到含1/2MS+6-BA0.02mg/L+活性炭0.5g/L+适量多效唑+适量脯氨酸的离体保存培养基中，进行离体保存培养，离体保存培养条件温度为12-21℃，光照强度为1200～1800LX，光照时长为8小时/天。
本发明至少包括以下有益效果：
1、本发明通过降低培养温度和减少光照时间减缓黄花蒿组培面的生长速度，同时添加多效唑(PPP333)和脯氨酸提高组培苗对低温和少光照的抗性，使得黄花蒿组培苗保持6个月以上不用转接，存活率均在80％以上，最高可达96.7％，部分实施例可以做到400天存活率50％以上，有效减少了配置培养基和转接的步骤，节省了人力和时间，保证了存活率。而常温、常规光照、不添加多效唑(PPP333)和脯氨酸的常规培养基条件下进行离体保存培养，组培苗生长速度过快，一个月左右就需要转接，不转接会导致组培苗逐渐死亡，培养至200天已无组培苗存活。
2、本发明的方法的实施例中，将离体保存的培养温度设置为18℃，多效唑用量为3.0或4.0mg/L，脯氨酸用量为0.05mg/L或0.1mg/L，保存培养200天的存活率达80％以上，最高达96.7％，400天存活率最高达60％，存活率高，可以满足400天以下的保苗保种需求。
3、本发明在离体保存中使用交替变化的不同光照强度进行光照，提高了组培苗存活率。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明实施例4的组培苗在200天时的生长图片；
图2为本发明实施例4的组培苗在400天时的生长图片；
图3为本发明实施例15的组培苗在200天时的生长图片；
图4为本发明实施例15的组培苗在400天时的生长图片。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
实施例1
本研究课题组提供的黄花蒿离体保存方法，包括以下步骤：
(1)外植体准备：剪下黄花蒿的幼嫩枝条，在自来水下细水冲洗10-15分钟，剪下接近茎尖的幼嫩茎段，切成一个个约1-2厘米长的带腋芽的茎段，备用；
(2)诱导培养：取(1)的茎段，经无菌水冲洗3-5次后，放入75％的酒精消毒30秒，接着无菌水冲洗3-5次，再放入0.1％的升汞溶液中消毒6-8分钟，然后用无菌水冲洗3-5次，最后接入MS+6-BA0.5mg/L+KT 0.2mg/L培养基中，进行诱导培养得到无菌芽；培养温度为24℃，光照强度为1800LX，光照时长为12小时/天；
(3)扩繁培养：取(2)中诱导出来的无菌芽，接种到MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L的培养基中进行扩繁培养得到扩繁芽；培养温度为24-26℃，光照强度为1800LX，光照时长为12小时/天；
(4)壮苗培养：取(3)中得到的扩繁芽，接种到MS+IBA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+活性炭1g/L的培养基中进行壮苗培养得到组培苗；培养温度为24℃，光照强度为1800LX，光照时长为12小时/天；
(5)离体保存：取(4)中经过壮苗培养的组培苗，接种到含1/2MS+6-BA0.02mg/L+活性炭0.5g/L+0.5mg/L PPP333(多效唑)+0.05mg/L脯氨酸的离体保存培养基中，进行离体保存培养，离体保存培养条件温度为18℃，光照强度为1200LX，光照时长为8小时/天。
其中，实施例各步骤的培养基中均含有蔗糖25g/L，pH＝5.8。
实施例2
与实施例1的区别在于(5)离体保存步骤的不同：取(4)中经过壮苗培养的组培苗，接种到含1/2MS+6-BA0.02mg/L+活性炭0.5g/L+1.5mg/L PPP333(多效唑)+0.05mg/L脯氨酸的离体保存培养基中，进行离体保存培养，离体保存培养条件温度为18℃，光照强度为1200LX，光照时长为8小时/天。
实施例3
与实施例1的区别在于(5)离体保存步骤的不同：取(4)中经过壮苗培养的组培苗，接种到含1/2MS+6-BA0.02mg/L+活性炭0.5g/L+2.0mg/L PPP333(多效唑)+0.05mg/L脯氨酸的离体保存培养基中，进行离体保存培养，离体保存培养条件温度为18℃，光照强度为1200LX，光照时长为8小时/天。
实施例4
与实施例1的区别在于(5)离体保存步骤的不同：取(4)中经过壮苗培养的组培苗，接种到含1/2MS+6-BA0.02mg/L+活性炭0.5g/L+3.0mg/L PPP333(多效唑)+0.05mg/L脯氨酸的离体保存培养基中，进行离体保存培养，离体保存培养条件温度为18℃，光照强度为1200LX，光照时长为8小时/天。
实施例5
与实施例1的区别在于(5)离体保存步骤的不同：取(4)中经过壮苗培养的组培苗，接种到含1/2MS+6-BA0.02mg/L+活性炭0.5g/L+4.0mg/L PPP333(多效唑)+0.05mg/L脯氨酸的离体保存培养基中，进行离体保存培养，离体保存培养条件温度为18℃，光照强度为1200LX，光照时长为8小时/天。
实施例6
与实施例1的区别在于(5)离体保存步骤的不同：取(4)中经过壮苗培养的组培苗，接种到含1/2MS+6-BA0.02mg/L+活性炭0.5g/L+5.0mg/L PPP333(多效唑)+0.05mg/L脯氨酸的离体保存培养基中，进行离体保存培养，离体保存培养条件温度为18℃，光照强度为1200LX，光照时长为8小时/天。
实施例7
与实施例1的区别在于(5)离体保存步骤的不同：取(4)中经过壮苗培养的组培苗，接种到含1/2MS+6-BA0.02mg/L+活性炭0.5g/L+3.0mg/L PPP333(多效唑)+0.01mg/L脯氨酸的离体保存培养基中，进行离体保存培养，离体保存培养条件温度为18℃，光照强度为1200LX，光照时长为8小时/天。
实施例8
与实施例1的区别在于(5)离体保存步骤的不同：取(4)中经过壮苗培养的组培苗，接种到含1/2MS+6-BA0.02mg/L+活性炭0.5g/L+3.0mg/L PPP333(多效唑)+0.1mg/L脯氨酸的离体保存培养基中，进行离体保存培养，离体保存培养条件温度为18℃，光照强度为1200LX，光照时长为8小时/天。
实施例9
与实施例1的区别在于(5)离体保存步骤的不同：取(4)中经过壮苗培养的组培苗，接种到含1/2MS+6-BA0.02mg/L+活性炭0.5g/L+3.0mg/L PPP333(多效唑)+0.15mg/L脯氨酸的离体保存培养基中，进行离体保存培养，离体保存培养条件温度为18℃，光照强度为1200LX，光照时长为8小时/天。
实施例10
与实施例1的区别在于(5)离体保存步骤的不同：取(4)中经过壮苗培养的组培苗，接种到含1/2MS+6-BA0.02mg/L+活性炭0.5g/L+3.0mg/L PPP333(多效唑)+0.2mg/L脯氨酸的离体保存培养基中，进行离体保存培养，离体保存培养条件温度为18℃，光照强度为1200LX，光照时长为8小时/天。
实施例11
与实施例1的区别在于(5)离体保存步骤的不同：取(4)中经过壮苗培养的组培苗，接种到含1/2MS+6-BA0.02mg/L+活性炭0.5g/L+3.0mg/L PPP333(多效唑)+0.05mg/L脯氨酸的离体保存培养基中，进行离体保存培养，离体保存培养条件温度为12℃，光照强度为1200LX，光照时长为8小时/天。
实施例12
与实施例1的区别在于(5)离体保存步骤的不同：取(4)中经过壮苗培养的组培苗，接种到含1/2MS+6-BA0.02mg/L+活性炭0.5g/L+3.0mg/L PPP333(多效唑)+0.05mg/L脯氨酸的离体保存培养基中，进行离体保存培养，离体保存培养条件温度为15℃，光照强度为1200LX，光照时长为8小时/天。
实施例13
与实施例1的区别在于(5)离体保存步骤的不同：取(4)中经过壮苗培养的组培苗，接种到含1/2MS+6-BA0.02mg/L+活性炭0.5g/L+3.0mg/L PPP333(多效唑)+0.05mg/L脯氨酸的离体保存培养基中，进行离体保存培养，离体保存培养条件温度为21℃，光照强度为1200LX，光照时长为8小时/天。
实施例14
与实施例1的区别在于(5)离体保存步骤的不同：取(4)中经过壮苗培养的组培苗，接种到含1/2MS+6-BA0.02mg/L+活性炭0.5g/L+3.0mg/L PPP333(多效唑)+0.05mg/L脯氨酸的离体保存培养基中，进行离体保存培养，离体保存培养条件温度为24℃，光照强度为1200LX，光照时长为8小时/天。
实施例15
与实施例1的区别在于(5)离体保存步骤的不同：取(4)中经过壮苗培养的组培苗，接种到含1/2MS+6-BA0.02mg/L+活性炭0.5g/L+3.0mg/L PPP333(多效唑)+0.05mg/L脯氨酸的离体保存培养基中，进行离体保存培养，离体保存培养条件温度为18℃，光照条件设置为：7天光照强度为1200LX+7天光照强度为1800LX，如此交替循环，光照时长为8小时/天。
对比例1
与上述实施例1不同的是，(5)离体保存中，离体保存培养基含有1/2MS+6-BA0.02mg/L+活性炭0.5g/L，不添加PPP333(多效唑)和脯氨酸，离体保存培养条件温度为24℃，光照强度为1800LX，光照时长为12小时/天。
具体为：
(1)外植体准备：剪下黄花蒿的幼嫩枝条，在自来水下细水冲洗10-15分钟，剪下接近茎尖的幼嫩茎段，切成一个个约1-2厘米长的带腋芽的茎段，备用；
(2)诱导培养：取(1)的茎段，经无菌水冲洗3-5次后，放入75％的酒精消毒30秒，接着无菌水冲洗3-5次，再放入0.1％的升汞溶液中消毒6-8分钟，然后用无菌水冲洗3-5次，最后接入MS+6-BA0.5mg/L+KT 0.2mg/L培养基中，进行诱导培养得到无菌芽；培养温度为24℃，光照强度为1800LX，光照时长为12小时/天；
(3)扩繁培养：取(2)中诱导出来的无菌芽，接种到MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L的培养基中进行扩繁培养得到扩繁芽；培养温度为24℃，光照强度为1800LX，光照时长为12小时/天；
(4)壮苗培养：取(3)中得到的扩繁芽，接种到MS+IBA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+活性炭1g/L的培养基中进行壮苗培养得到组培苗；培养温度为24℃，光照强度为1800LX，光照时长为12小时/天；
(5)离体保存中，离体保存培养基含有1/2MS+6-BA0.02mg/L+活性炭0.5g/L，不添加PPP333(多效唑)和脯氨酸，离体保存培养条件温度为24℃，光照强度为1800LX，光照时长为12小时/天。
其中，对比例各步骤的培养基中均含有蔗糖25g/L，pH＝5.8。
对比例2
与对比例1不同在于：(5)离体保存中，离体保存培养基含有1/2MS+6-BA0.02mg/L+活性炭0.5g/L，不添加PPP333(多效唑)和脯氨酸，离体保存培养条件温度为18℃，光照强度为1200LX，光照时长为8小时/天。
对比例3
与对比例1不同在于：(5)离体保存中，离体保存培养基含有1/2MS+6-BA0.02mg/L+活性炭0.5g/L，不添加PPP333(多效唑)和脯氨酸，离体保存培养条件温度为12℃，光照强度为1200LX，光照时长为8小时/天。
各实施例和对比例的处理材料数量为30个，统计观测各具体实施例和对比例的组培苗离体保存培养200天和400天的存活率。
各实施例和对比例中离体保存培养条件、PPP333和脯氨酸的添加量、存活率如下表1所示：
表1各实施例对比例培养条件、PPP333、脯氨酸和存活率
从上表1可以看到，实施例1～15中200天存活率最高可达96.7％，最低也有80.0％，均能满足6个月的保苗保种需要。实施例3～5、实施例7～10、实施例1～13和实施例15的400天存活率均在30％及以上，可以满足长达12个月的保苗保种需求。实施例15采用1200LX和1800LX光照强度交替变化进行离体保存，相比实施4只用1200LX处理，200天存活率进一步提升，400天存活率提升更加明显，猜测与光照增加影响了脯氨酸积累有关。相比之下，对比例1～3未添加PPP333和脯氨酸，无论是在正常培养调节下，还是在弱光和低温胁迫条件下，200天和400存活率极低，无法满足6～12个月的保苗保种要求。
因此，本发明降低培养温度、减少光照时间、添加多效唑(PPP333)和脯氨酸的设计可以使得黄花蒿组培苗保持6～12个月不用转接，存活率高，部分实施例可以做到400天存活率50％以上，有效减少了配置培养基和转接的步骤，节省了人力和时间，保证了存活率。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。
Claims (8)
1.黄花蒿离体保存方法，其特征在于，包括：将黄花蒿组培苗置于含1/2MS+6-BA0.02mg/L+活性炭0.5g/L+多效唑0.5～5mg/L+脯氨酸0.05～0.2mg/L的离体保存培养基中，在光照强度1200～1800Lx、光照时长8小时/天、培养温度12～21℃的减少光照和降低温度的培养条件下，进行离体保存培养。
2.如权利要求1所述的黄花蒿离体保存方法，其特征在于，所述培养温度为15～21℃，多效唑添加量为1.5～4.0mg/L、脯氨酸添加量为0.05～0.15mg/L。
3.如权利要求1所述的黄花蒿离体保存方法，其特征在于，所述培养温度为15～18℃，多效唑添加量为1.5～3.0mg/L、脯氨酸添加量为0.05～0.15mg/L。
4.如权利要求1所述的黄花蒿离体保存方法，其特征在于，所述培养温度为18℃，多效唑用量为1.5mg/L或2.0mg/L或3.0mg/L或4.0mg/L，脯氨酸用量为0.05mg/L或0.1mg/L或0.15mg/L。
5.如权利要求1或4所述的黄花蒿离体保存方法，其特征在于，所述培养温度为18℃，多效唑用量为3.0或4.0mg/L，脯氨酸用量为0.05mg/L或0.1mg/L。
6.如权利要求1所述的黄花蒿离体保存方法，其特征在于，所述培养温度为15℃，多效唑用量为3.0mg/L，脯氨酸用量为0.05mg/L。
7.如权利要求1所述的黄花蒿离体保存方法，其特征在于，所述离体保存培养中，以6～8天光照强度1200Lx，6～8天1800Lx进行光照处理，如此交替循环。
8.如权利要求1所述的黄花蒿离体保存方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、外植体准备：取黄花蒿的幼嫩枝条，自来水冲洗10-15分钟，剪下接近茎尖的幼嫩茎段，切成一个个1-2厘米长的带腋芽的茎段，备用；
步骤二、诱导培养：取步骤一的茎段，经无菌水冲洗3-5次后，放入75％的酒精消毒30秒，接着无菌水冲洗3-5次，再放入0.1％的升汞溶液中消毒6-8分钟，然后用无菌水冲洗3-5次，最后接入MS+6-BA 0.5mg/L+KT 0.2mg/L培养基中，进行诱导培养得到无菌芽；培养温度为24-26℃，光照强度为1800Lx，光照时长为10-12小时/天；
步骤三、扩繁培养：取步骤二中诱导出来的无菌芽，接种到MS+6-BA 0.5mg/L+NAA0.2mg/L的培养基中进行扩繁培养得到扩繁芽；培养温度为24-26℃，光照强度为1800Lx，光照时长为10-12小时/天；
步骤四、壮苗培养：取步骤三中得到的扩繁芽，接种到MS+IBA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+活性炭1g/L的培养基中进行壮苗培养得到组培苗；培养温度为24-26℃，光照强度为1800Lx，光照时长为10-12小时/天；
步骤五、离体保存：取步骤四中经过壮苗培养的组培苗，接种到含1/2MS+6-BA0.02mg/L+活性炭0.5g/L+适量多效唑+适量脯氨酸的离体保存培养基中，进行离体保存培养，离体保存培养条件温度为12-21℃，光照强度为1200～1800Lx，光照时长为8小时/天。
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