CN104026008B - 一种抑制漆树外植体污染和褐变的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物组培技术领域，尤其是组培中抑制外植体的污染和褐变的方法。本发明公开了一种抑制漆树外植体污染和褐变的方法，其特征在于包括使用苯扎氯铵来消毒处理漆树外植体步骤和将消毒好的材料接种在添加半胱氨酸的White培养基上暗培养的步骤。本发明的方法抑制漆树外植体的污染和防止漆树外植体的褐变。为漆树组织培养提供充足的无菌外植体，有力地保证了后续组织培养的成功率，且成本低，适于工业化生产。

Description

一种抑制漆树外植体污染和褐变的方法

技术领域

本发明涉及植物组培技术领域，尤其是组培中抑制外植体的污染和褐变的方法。

背景技术

漆树（Toxicodendronvernicifluum）是漆树科（Anacardiacceae）漆属植物，因产生漆而得名，是我国特有的最具民族特征的经济林木，而生漆是是目前世界上唯一来自绿色植物，在生物酶催化作用下，常温能固化成膜的生物高分子涂料，已广泛用于军工、化工、轻工、石油、采矿、美术等方面，也是我国重要的出口农产品。由于漆树聚集了天然涂料、油料和木材等多种用途，不仅是我国重要的特用经济树种，也是优良的生态树种，对我国贫困山区的经济发展和农民经济收入增加以及生态环境建设都有着重要的作用。

漆树属于枝插较为困难的树种，在良种苗木培育中，主要采用种子繁殖的实生育苗和根萌繁殖的无性育苗。但漆树属异花授粉的经济树种，采用种子繁殖的实生育苗，必然产生较大分化，其优良品质的遗传特性难以保持。同时，漆树存在天然败育现象，其繁育方式主要为埋根育苗。埋根育苗的成苗率低，繁殖速度慢，采集根段对母树易造成一定的伤害，影响产量，不能满足大规模繁殖的生产要求。

当前，快速高效的苗木培育技术成为了推广漆树优良品种和优良单株的瓶颈。因此，探索一条在不损害、不降低漆树优良品种种性的前提下，能满足生产要求的大规模苗木繁殖方法是当前漆树产业发展中急需解决的问题。而利用植物组织培养技术快速育苗是一个新兴的生物技术应用领域，由于取材对母体无伤害且用量少，繁殖系数高，繁殖速度快，已成为许多植物商品化育苗的重要途径。

有关漆树组培快繁技术的研究报道很少，到目前为止，漆树组织通过愈伤化、继代、分化及生根进而培育出植株的完整组培快繁技术体系尚未建立。其主要问题是，在进行漆树的组织培养试验中，存在严重的细菌和真菌污染问题，污染率达到100%。同时，由于漆树的漆酚含量较高，组织培养中出现严重的外植体褐变现象。其茎、叶的切片组织从表面向培养基释放褐色物质以至培养基逐渐变成成褐色，外植体随之进一步变褐而死亡，不能存活。

因此，为了建立高效的漆树组培快繁技术体系，首要解决漆树外植体的污染和褐变问题。

发明内容

本发明要解决的是在高效的漆树组培快繁技术体系中，漆树外植体的污染和褐变问题，从而提出一种可有效去除表面细菌和内生真菌，防止外植体褐变的方法。

本发明公开了一种抑制漆树外植体污染和褐变的方法，其特征在于包括使用苯扎氯铵来消毒处理漆树外植体步骤和将消毒好的材料接种在添加半胱氨酸的White培养基上暗培养的步骤。

步骤具体如下：

（1）采取生长健壮、无病虫害的漆树1~2年生茎段或幼嫩叶片，用毛刷蘸肥皂水轻拭，刷净材料表面污物，置于烧杯中，自来水冲洗2h；

（2）转入超净工作台内，75%乙醇浸泡20s，无菌水冲洗3min；

（3）用1%苯扎氯铵浸泡1min，无菌水冲洗3min；

（4）用0.1%升汞消毒20min，无菌水冲洗5~8次，每次2min；

（5）用消毒过的滤纸吸干水分，将材料切割为1cm茎段或1cm×1cm的方块；

（6）接种于添加半胱氨酸的White培养基，比例为1L的White培养基附加100mg半胱氨酸，pH调节为5.8；

（7）暗培养2周，温度20±2℃；

（8）转于光照强度1000~2000Lux，光照时间12h/d，温度25±2℃的培养条件下常规培养。

在本发明中通过使用苯扎氯铵的消毒处理，有效去除漆树外植体材料的表面细菌和内生真菌；二是将消毒好的材料接种在添加半胱氨酸的White培养基上暗培养，防止漆树外植体的褐变，步骤（1）~（4）目的在于抑制漆树外植体的污染；步骤（5）~（7）目的在于抑制漆树外植体的褐变。

苯扎氯铵是一种阳离子表面活性剂，属非氧化性杀菌剂，具有广谱、高效的杀菌灭藻能力。常用于医疗方面，手术前皮肤的消毒、黏膜和伤口的清洗消毒、创伤和烧伤感染的治疗、手术器械的消毒和保存，对人体无毒害作用。另还可用作药用防腐剂以及工业水处理剂和匀染剂。但在组织培养领域，尚未见有使用苯扎氯铵进行植物材料消毒，去除外植体内生真菌的研究报道。在多次试用数十种常规外植体消毒杀菌剂仍不能解决漆树外植体污染问题的情况下，本发明利用苯扎氯铵能改变菌体胞浆膜的通透性，使菌体胞浆物质外渗，从而达到杀菌灭菌效果的原理，首次将医疗常用的消毒剂苯扎氯铵应用在植物组织培养领域，对真菌污染严重的漆树材料进行消毒杀菌处理，取得了良好的效果，苯扎氯铵处理后的漆树外植体成活率高达96.03~97.85%。

具体实施方式

实施例1、

（1）采取生长健壮、无病虫害的漆树1~2年生茎段或幼嫩叶片，用毛刷蘸肥皂水轻拭，刷净材料表面污物，置于烧杯中，自来水冲洗2h；

（2）转入超净工作台内，75%乙醇浸泡20s，无菌水冲洗3min；

（3）用1%苯扎氯铵浸泡1min，无菌水冲洗3min；

（4）用0.1%升汞消毒20min，无菌水冲洗5~8次，每次2min；

（5）用消毒过的滤纸吸干水分，将材料切割为1cm茎段或1cm×1cm的方块；

（6）接种于添加半胱氨酸的White培养基，比例为1L的White培养基附加100mg半胱氨酸，蔗糖30g，琼脂粉6g，pH调节为5.8；

（7）暗培养2周，温度20±2℃；

（8）转于光照强度1000~2000Lux，光照时间12h/d，温度25±2℃的培养条件下常规培养。

消毒处理的对比试验：

实验步骤同上述，在步骤（3）使用常规的抗真菌剂，制菌霉素和两性霉素B，与发明使用的苯扎氯铵分别处理，进行对比试验，在步骤（6）（7）时，接种于常规培养基上常规培养。试验结果如下表：

从对比数据来看，使用苯扎氯铵大大降低了接种污染率

抑制褐变对比试验：

实验步骤同上述，在步骤（6），将外植体材料分别接种于常规的MS培养基和White培养基，与发明使用的附加半胱氨酸的White培养基，进行对比试验。试验结果如下表：

使用本发明的培养基大大降低了外植体褐变率。

本发明的方法防止漆树外植体的褐变。为漆树组织培养提供充足的无菌外植体，有力地保证了后续组织培养的成功率，且成本低，适于工业化生产。

Claims (1)

1.一种抑制漆树外植体污染褐变的方法，包括使用苯扎氯铵来消毒处理漆树外植体步骤和将消毒好的材料接种在添加半胱氨酸的White培养基上暗培养的步骤，其特征在于具体步骤如下：

（1）采取生长健壮、无病虫害的漆树1~2年生茎段或幼嫩叶片，用毛刷蘸肥皂水轻拭，刷净材料表面污物，置于烧杯中，自来水冲洗2h；

（2）转入超净工作台内，75%乙醇浸泡20s，无菌水冲洗3min；

（3）用1%苯扎氯铵浸泡1min，无菌水冲洗3min；

（4）用0.1%升汞消毒20min，无菌水冲洗5~8次，每次2min；

（5）用消毒过的滤纸吸干水分，将材料切割为1cm茎段或1cm×1cm的方块；

（6）接种于添加半胱氨酸的White培养基，比例为1L的White培养基附加100mg半胱氨酸，蔗糖30g，琼脂粉6g，pH调节为5.8；

（7）暗培养2周，温度20±2℃；

（8）转于光照强度1000~2000Lux，光照时间12h/d，温度25±2℃的培养条件下常规培养。