CN109997692B

CN109997692B - 青钱柳愈伤组织诱导及继代增殖培养基及其培养方法

Info

Publication number: CN109997692B
Application number: CN201910259943.9A
Authority: CN
Inventors: 成圆; 洑香香; 张洋; 尚旭岚; 方升佐
Original assignee: Nanjing Forestry University
Current assignee: Nanjing Forestry University
Priority date: 2019-04-02
Filing date: 2019-04-02
Publication date: 2020-10-30
Anticipated expiration: 2039-04-02
Also published as: CN109997692A

Abstract

本发明公开了青钱柳愈伤组织诱导及继代增殖培养基，还公开了基于青钱柳愈伤组织诱导及继代增殖培养基的培养方法，包括外植体的选择、外植体的灭菌、无菌抗褐化体系建立和增殖培养。本发明能够有效提高青钱柳愈伤组织的抗褐化能力，在较短时间内获得大量无褐化、生长速度快的愈伤组织，通过生物技术手段解决青钱柳资源紧缺的问题，为后期工业化提取青钱柳三萜、黄酮、多糖等次生代谢产物奠定基础。

Description

青钱柳愈伤组织诱导及继代增殖培养基及其培养方法

技术领域

本发明涉及一种青钱柳愈伤组织诱导及继代增殖培养基及其培养方法，属于植物组织培养技术领域。

背景技术

青钱柳[Cyclocarya paliurus(Batal.)Iljinskaja]属双子叶植物纲(Dicotyledoneae)胡桃科(Juglandaceae)青钱柳属(Cyclocarya)植物，是一种重要的药食同源植物，为我国特有的单种属植物(中国植物志，1979)，近年来，因其叶含有特有的三萜黄酮多糖物质，被证明具降血压(侯小利等，2014)、降血脂(Jiang et al，2015；Ma et al，2015)、降血糖(Yoshitomi et al，2017；黄维琳等，2017)、抗氧化(Wang et al，2015；Xieet al，2015)等生理功能，并具有改善肾功能、调节血糖紊乱、缓解肝脏损伤、提高免疫功能(Wang et al，2017)等生理作用而被广泛关注。青钱柳的药用成分主要从叶片中提取，但是，其天然资源分布零散，种源、个体间成分含量差异明显，因此为有效保护种质资源和实现次生代谢产物的工业化生产，通过组织培养技术，在组织细胞水平促进次生代谢物的生物合成是具有特殊的理论和现实意义。

愈伤组织培养技术具有增殖效率高、培养成本低、材料生长快等特点，不仅是植物间接快繁的重要步骤，也是植物种质资源保存、次生代谢产物生产的理想方法，具有较为广阔的应用前景。在间接快繁研究方面，胡杨(Populus euphratica)(Cai et al.,2015)、合欢(Albizia julibrissin)(Rahmani et al.,2016)、檀香(Santalum album)(Singh etal.,2016)等均通过愈伤脱分化再生植株建立快繁体系。在种质资源保存方面，荔枝(Litchi chinensis)(王梓清，2006)、柑橘(Citrus reticulata)(王子成，2003)、龙眼(Dimocarpus longan)(叶炜，2006)等均通过胚性愈伤组织进行离体保存研究。在次生代谢产物生产方面，一些重要的次生代谢产物如杜仲(Eucommia ulmoides)(房慧勇等，2014)中的木脂素类，雷公藤(Tripterygium wilfordii)(李琰等，2010)中的内酯醇，红景天(Rhodiola rosea)(邵春绘，2014)中的红景天苷，小叶毛果芸香(Pilocarpusmicrophyllus)(Abreu et al.,2005)中的毛果芸香碱，均是通过体外愈伤诱导培养获得的。综上所述，愈伤组织培养技术是一门具有潜在应用价值的技术，尤其在药用植物次生代谢产物生产方面具有重要价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种青钱柳愈伤组织诱导及继代增殖培养基及其培养方法，该方法能够有效提高青钱柳愈伤组织的抗褐化能力，在较短时间内获得大量无褐化、生长速度快的愈伤组织，通过生物技术手段解决青钱柳资源紧缺的问题，为后期工业化提取青钱柳三萜、黄酮、多糖等次生代谢产物奠定基础。

为解决上述技术问题，本发明提供一种青钱柳愈伤组织诱导及继代增殖培养基，其特征是，包括植物愈伤组织诱导培养基和继代增殖培养基；

植物愈伤组织诱导培养基配方分别为：

基本培养基WPM中添加6-BA0.2～0.8mg·L^-1、IBA0.05～0.1mg·L^-1、蔗糖25～35g·L^-1、琼脂粉7～7.2g·L^-1、抗褐化剂PVP 100～200mg·L^-1，并调节pH至5.78～5.82；

或改良MS基本培养基中添加6-BA1.0～1.5mg·L^-1、NAA 0.05～0.1mg·L^-1、蔗糖30～35g·L^-1、琼脂粉6～6.3g·L^-1、抗褐化剂PVP100～200mg·L^-1，并调节pH至5.78～5.82；

植物愈伤组织继代增殖培养基配方分别为：

基本培养基WPM中添加6-BA0.5～1.5mg·L^-1、IBA或NAA0.05～0.1mg·L^-1、蔗糖25～30g·L^-1、琼脂粉6.0～6.3g·L^-1、抗褐化剂PVP 100～200mg·L^-1，并调节pH至5.78～5.82。

进一步地，所述的改良MS基本培养基为3/4MS基本培养基。

基于青钱柳愈伤组织诱导及继代增殖培养基的培养方法，其特征是，包括如下步骤:

(1)外植体的选择：取样时间为4月至9月，于温室培养的2～5年生植株上选取当年生青钱柳半木质化带芽茎段；

(2)外植体的灭菌：在酒精中浸泡青钱柳茎段，用无菌水冲洗2～3次后，放入次氯酸钠溶液中浸泡，用无菌水冲洗4～5次后备用；

(3)无菌抗褐化体系建立：将修剪好的茎段平放于灭菌的诱导培养基中，用封口膜密封后放入培养室培养；

(4)增殖培养：待愈伤组织诱导培养40天后，切取淡黄色无褐变、质地疏松、生长旺盛的愈伤组织，将其移至继代增殖培养基中进行继代增殖培养，用封口膜密封后放入培养室培养，每隔40～45d继代一次。

进一步地，所述步骤(1)中，外植体选择的具体方法为：在晴好天气下，从2～5年生青钱柳植株上向阳面外围，选取当年生健康、无病害的营养枝，从顶端1、2节处剪取长度为3～4cm的半木质化带芽茎段，保留1个腋芽，腋芽要求已膨大但芽鳞尚未张开。温室的温度、湿度，环境条件易于控制，且植株病虫害容易处理管理，从源头上降低外植体的污染率；3～4cm的半木质化带芽茎段容易诱导愈伤组织，茎段贮存的养分能够在愈伤组织诱导初期提供养分。本发明的所选取的茎段材料状态良好，不易污染，配方反应效果佳。

进一步地，所述步骤(2)中，酒精浓度为75％，浸泡25～30s，次氯酸钠浓度为10％，浸泡3～4min。

进一步地，所述步骤(2)中，外植体灭菌前，修剪茎段上的叶片，保留叶柄和1/5叶片，自来水冲洗1～2小时，转置超净工作台进行消毒处理。

进一步地，所述步骤(3)中，将消毒好的青钱柳茎段平铺于已消毒的滤纸上晾干后再进行接种。经过消毒处理后的茎段体表带有水分，置于已消毒的滤纸上吸干晾干，可以除去茎段表面的水分，防止空气中的细菌以及操作所带来的细菌吸附于茎段表面，影响试验成功率。

进一步地，所述步骤(3)中，修剪方法为：用已灭菌的剪刀去除茎段首尾两端和部分叶柄，避免消毒剂未完全从材料伤口处冲洗掉；将修剪好的茎段平放于灭菌的培养基中时，平放部位深度占茎段直径的1/4，每瓶培养基平放2～3个茎段，茎段的平放深度不宜过深，过深则透气性差，茎段容易死亡；过浅则茎段不易吸收培养中的营养成分。茎段内有含促进愈伤组织生长的特殊物质，每瓶中平放2～3个茎段有利于有益物质的积累。

进一步地，所述步骤(4)中，愈伤组织的切取方法为：在超净工作台上用组培刀将愈伤分离成小块，剔除愈伤组织上的褐化组织，剔除褐化组织可以避免褐化现象的进一步发展，有利于愈伤组织在增殖培养基上的正常生长；进行继代增殖培养时，每瓶培养基接入3个愈伤组织材料，愈伤组织材料内有含促进其生长的特殊物质，每瓶中平放3个愈伤组织材料增加培养基表面放置愈伤组织数量，有利于有益物质的积累，提高增殖系数，降低成本。

进一步地，所述步骤(3)和步骤(4)中，培养室环境条件为：培养室光照时间为12h/天，光照强度为1500Lx，温度为21±2℃，该环境的光周期和光照强度模拟了青钱柳在自然条件下的光照条件，21±2℃的环境温度适宜于青钱柳组培材料的生长，同时能抑制培养室内的细菌滋生。

本发明所达到的有益效果：本发明优化了青钱柳组织培养各个阶段的操作方法，有效降低了褐化率，控制了污染，提高了增殖率，具体地：

(1)75％乙醇、10％次氯酸钠处理可以杀灭青钱柳茎段表面附着的微生物，污染率和死亡率降到最低，解决在后续处理中残留微生物污染愈伤组织出现褐化的问题。

(2)培养基低pH能够抑制褐化，本发明的培养基pH值均为5.78～5.82。

(3)温度能够影响植物体内酶活性，本发明不定芽的诱导和增殖培养置于21℃±2℃温度条件下，在保证青钱柳正常生长的前提下抑制酚类物质产生，有效减轻褐化现象发生。

(4)青钱柳伤口处酚类物质的长期积累会引起褐化发生，本发明中缩短了不定芽继代培养的时间，将继代培养时间定为40～45d，抑制褐化现象的发生。

(5)本发明采用的愈伤组织诱导配方中采用改良的MS基本培养基为3/4MS基本培养基，更好的满足青钱柳叶片愈伤组织快速生长的需要，在降低培养基成本的同时，促进淡黄色紧密愈伤组织的快速继代繁殖。

(6)本发明采用的愈伤组织诱导配方和愈伤组织增殖配方培养获得的青钱柳愈伤诱导率高达85％，愈伤增长率达2.9，青钱柳愈伤组织生长速度快，长势旺盛，颜色正常、无玻璃化现象。

综上所述，采用本发明诱导和培养青钱柳愈伤组织，操作简单、增殖速度快、重演性强、产量大、生产周期短，耗能耗时少，培养室内愈伤组织的生长条件可控，能实现大规模生产，能有效解决工业化提取青钱柳次生代谢产物对原料的需求与野生种质资源缺乏之间的矛盾。

具体实施方式

下面对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。

本发明基于青钱柳愈伤组织诱导及继代增殖培养基的培养方法，具体包括以下步骤:

(1)外植体的选取：取样时间为4月至9月，在晴好天气下，从2～5年生青钱柳植株上向阳面外围，选取当年生健康、无病害的营养枝，从顶端1、2节处剪取长度为3～4cm的半木质化带芽茎段，保留1个腋芽，腋芽要求已膨大但芽鳞尚未张开。

(2)外植体的灭菌：外植体灭菌前，修剪茎段上的叶片，保留叶柄和1/5叶片，自来水冲洗1～2小时，转置超净工作台进行消毒处理。先用75％酒精浸泡25～30s，无菌水冲洗2～3次后，再用10％的次氯酸钠浸泡3～4min，用无菌水冲洗4～5次后备用。

(3)无菌抗褐化体系建立：将消毒好的青钱柳茎段平铺于已消毒的滤纸上晾干后再进行接种。用已灭菌的剪刀去除茎段首尾两端和部分叶柄，避免消毒剂未完全从材料伤口处冲洗掉；将修剪好的茎段平放于灭菌的培养基中时，平放部位深度占茎段直径的1/4，每瓶培养基平放2～3个茎段，用封口膜密封后放入培养室培养。培养室环境条件为：培养室光照时间为12h/天，光照强度为1500Lx，温度为21±2℃。

所述诱导培养基配方分别为：

或3/4MS基本培养基中添加6-BA1.0～1.5mg·L^-1、NAA 0.05～0.1mg·L^-1、蔗糖30～35g·L^-1、琼脂粉6～6.3g·L^-1、抗褐化剂PVP100～200mg·L^-1，并调节pH至5.78～5.82。

(4)增殖培养：待愈伤组织诱导培养40天后，切取生长健壮的愈伤组织材料(0.5～1.0g左右)，将其移至继代增殖培养基中进行继代增殖培养，用封口膜密封后放入培养室培养，每隔40～45d继代一次。愈伤组织的切取方法为：在超净工作台上用组培刀将愈伤分离成小块，剔除愈伤组织上的褐化组织；进行继代增殖培养时，每瓶培养基接入3个愈伤组织材料。培养室环境条件为：培养室光照时间为12h/天，光照强度为1500Lx，温度为21±2℃。

继代增殖培养基配方为：

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。

以2017年南京林业大学白马基地青钱柳苗圃和南京林业大学生物技术大楼10楼温室采集的当年生健康、无病害营养枝作为试验材料。

实施例1、外植体的选取与消毒时间筛选

外植体的选取：于2017年分别在南京林业大学白马基地青钱柳苗圃和南京林业大学生物技术大楼10楼温室采集当年生健康、无病害营养枝，从顶端1、2节处剪取长约3～4cm的半木质化带芽茎段，保留1个腋芽。

外植体的修剪和清洗：修剪茎段上的叶片，保留叶柄和1/5叶片，用自来水冲洗1～2小时。

为了筛选出最佳的青钱柳茎段消毒时间处理组合，选择了酒精和次氯酸钠两种消毒剂对青钱柳的消毒处理进行研究，其中75％酒精消毒时间选用2个水平：25s、30s。10％次氯酸钠处理时间选用3个水平：3min、3.5min、4min。实验设计详见表1。茎段经过修剪和冲洗后置于超净工作台上，用乙醇和次氯酸钠进行进一步的消毒，消毒完成后用无菌水冲洗4～5次。在滤纸上将消毒好的带芽茎段切去与消毒液接触的部分并平放于培养基中，10d后观察外植体接种后的污染情况，并观察外植体污染特征，进一步判定造成污染的原因，并统计污染率和死亡率。

表1消毒处理实验设计方案

茎段培养10d后，对带芽茎段的污染数、死亡数进行调查，不同处理组合的污染率、死亡率差异较明显，结果如表2所示。

表2消毒处理和材料来源对茎段污染率和死亡率的影响

注：本表中小写字母表示注表示在α＝0.05水平有显著性差异，下同。

由上表2可以看出，随取样时间延长，温室材料整体污染率、死亡率低，相比大田材料更易操作控制，温室材料取样时间可从4月延伸至9月。对于不同处理条件下外植体的污染和死亡情况，不同处理组合差异较显著。取样时间为4～7月时，处理2的污染率和死亡率最低，取样时间为8～9月时，处理2的污染率最低，但死亡率略高于处理1。因此，综合考虑外植体的污染率、死亡率及取样时间，认为处理2为青钱柳带芽茎段的最佳消毒处理方案。

因此，本部分选择用75％的酒精消毒25s后用10％的次氯酸钠消毒3.5min作为温室材料青钱柳带芽茎段的最佳消毒操作，此时外植体污染率为11～13％，死亡率为2％～6％。

实施例2、防褐化剂浓度筛选

实验中发现接种后茎段出现褐化现象，为了研究防褐化剂PVP(聚乙烯吡咯烷酮)对青钱柳愈伤组织诱导褐化程度的影响，本实验中PVP添加浓度设置4个水平：0、100mg·L^-1、150mg·L^-1、200mg·L^-1。实验采用单因素随机区组实验进行，将消毒好的青钱柳茎段置于已消毒的滤纸(11×11cm)上晾干，用已灭菌的剪刀去除茎段首尾两端和叶腋处部分叶柄，将剪好的茎段平放灭菌的愈伤组织诱导培养基(培养基配方为WPM+1.5mg·L^-16-BA+0.3mg·L^-1 IBA)，分别添加不同浓度PVP，茎段平放部位深度占茎段长度的1/4，每瓶培养基平放2～3个茎段，一次接种20瓶，重复3次，在此过程中，控制培养室内的环境条件，及时清理被污染和褐化的茎段材料和培养基。培养20d后统计褐化率，见表3。

表3抗褐化剂浓度对青钱柳愈伤褐化的影响

由上表3可以得出，本发明中的配方所得愈伤组织的褐化率整体相对不高，愈伤组织在添加抗褐化剂的培养基上培养后发现，没有添加PVP的培养基和添加200mg·L^-1 PVP的培养基上愈伤组织褐化现象差异较显著。添加适当浓度的抗褐化剂能起到较好的抗褐化效果，能将褐化率有效降低至16.67％。青钱柳愈伤褐化在继代过程中容易蔓延，但未褐化或远离褐化区域的愈伤一般不会褐化。

综合考虑，认为PVP浓度为200mg·L^-1时，抗褐化效果最佳。

实施例3、无菌抗褐化体系愈伤组织诱导培养基配方筛选

为了诱导青钱柳茎段产生愈伤组织，本实验在改良MS基本培养基中添加200mg·L^-1 PVP、6-BA和NAA，在WPM基本培养基中添加200mg·L^-1 PVP、6-BA和IBA两种激素。主要研究生长调节剂浓度对愈伤组织诱导的影响，其中激素的浓度处理组合见下表4。外植体选用上一阶段构建的无菌培养体系的茎段，修剪后平放入愈伤组织诱导培养基中，平放部位深度占茎段长度的1/4，每瓶培养基平放2～3个茎段，一次接种20瓶，重复3次，在此过程中，控制培养室内的环境条件，及时清理被污染、被褐化的材料和培养基。培养20d后，统计愈伤组织诱导情况。

表4不同激素配比对青钱柳愈伤诱导的影响(浓度：mg·L^-1)

注：⁺表示愈伤数量，⁺越多数量越多。

由上表4可以看出，所有处理的培养基上都诱导出了愈伤组织，且愈伤诱导率均在85％以上，但不同处理之间诱导出愈伤组织的生长情况差异显著。在WPM培养基中，随着6-BA浓度的提高，在0.2～0.6mg·L^-1范围时，茎段诱导出的愈伤组织数量不断增加，颜色浅黄至深褐，质地逐渐紧密至硬，且当6-BA浓度不变，添加0.1mg·L^-1的IBA所诱导出的愈伤组织数量多于添加0.05mg·L^-1IBA；但在0.6～0.8mg·L^-1范围时，愈伤组织数量增加不明显，颜色较深，质地硬。综合考虑茎段诱导出的愈伤组织数量、颜色及质地等方面，选择培养基配方为WPM+0.5mg·L^-1 6-BA+0.1mg·L^-1 IBA，该配方下茎段诱导出的愈伤组织数量最多，生长旺盛，颜色正常，质地紧密。此外，在改良MS培养基中，IBA浓度为0.5mg·L^-1时，愈伤组织数量较多但生长状态不好，颜色较深，质地硬，不适宜进一步增殖培养。愈伤组织生长状态良好，颜色正常，能进一步增殖培养的配方还有3/4MS+1.0mg·L^-1 6-BA+0.1mg·L^-1 NAA和3/4MS+1.5mg·L^-1 6-BA+0.05mg·L^-1 NAA。

实施例4、愈伤组织继代增殖培养

增殖培养：青钱柳愈伤经过一段时间的培养，数量体积扩大，选取生长健壮、颜色正常的愈伤材料，组培刀将其分离，剔除褐化组织，移至愈伤增殖培养基(继代增殖培养基配方见表5)中进行继代增殖培养，主要研究生长调节剂6-BA、IBA、NAA浓度对愈伤组织增殖的影响，每瓶接入3个愈伤团，密封后放入培养室培养，每40～45d继代一次，一次接种20瓶，重复3次，统计愈伤组织增长率和生长状态。(增长率＝(继代一次后重量-继代前重量)/继代前重量)

表5不同继代增殖配方对青钱柳愈伤组织增殖的影响

注：⁺表示愈伤数量，⁺越多数量越多。

由上表5可以看出，生长调节物质NAA、IBA、6-BA对不定芽增殖培养均有促进作用，本发明提供的增殖配方WPM+0.5mg·L^-16-BA+0.1mg·L^-1IBA，WPM+1.0mg·L^-1 6-BA+0.1mg·L^-1 NAA和WPM+1.5mg·L^-1 6-BA+0.05mg·L^-1 NAA，相比于其他增殖培养基均存在显著优势，增长率能达到2.92、1.71和2.45。当培养基中添加0.5mg·L^-1的6-BA和0.1mg·L^-1的IBA时愈伤组织呈浅黄色或浅绿色，质地紧密，愈伤数量很高，增长率最高可达2.92，较其它处理促进效果明显。增殖配方WPM+0.5 6-BA+0.05IBA效果最差，增殖率仅为1.1，且部分愈伤组织呈深棕色。试验表明青钱柳茎段的最佳继代增殖配方为WPM+0.5mg·L^-1 6-BA+0.1mg·L^-1 IBA。

以上实施例中培养基均添加30g·L^-1蔗糖和6.5g·L^-1琼脂粉，pH值调整为5.78～5.82范围内，培养条件为培养室光照时间为12h/天，光照强度为1500Lx，温度为21℃±2℃。

由实施例1、2、3、4可知，青钱柳愈伤组织诱导及继代增殖培养基配方及其培养方法具体为：温室材料取材时间可以延长至9月，最佳消毒方法为75％酒精25s+10％次氯酸钠3.5min，最适宜的抗褐化浓度为200mg·L^-1 PVP，愈伤组织诱导的最佳配方：WPM+0.5mg·L^-1 6-BA+0.1mg·L^-1 IBA，3/4MS+1.0mg·L^-1 6-BA+0.1mg·L^-1 NAA和3/4MS+1.5mg·L^-1 6-BA+0.05mg·L^-1 NAA，添加20gL^-1蔗糖，6.5g·L^-1琼脂粉和200mg·L^-1PVP，愈伤组织增殖的最佳配方：WPM基本培养基，激素组合为6-BA和IBA，浓度分别为0.5mg·L^-1和0.1mg·L^-1。

相比于传统的愈伤增殖方法，本发明克服了现有方法培养出的青钱柳愈伤组织褐化率高、状态不佳的问题。通过本发明有效控制青钱柳组培污染率，青钱柳愈伤组织褐化得到有效抑制，降至16.67％，增长率高达2.92，获得大量生长旺盛，状态良好，质地紧密，生长速度快的愈伤组织。为后期工业化提取青钱柳三萜、黄酮、多糖等次生代谢产物提供大量的组培材料，为实现青钱柳工厂化生产奠定基础。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.青钱柳愈伤组织诱导及继代增殖培养基，其特征是，包括植物愈伤组织诱导培养基和继代增殖培养基；

植物愈伤组织诱导培养基配方分别为：

或改良MS基本培养基中添加6-BA1.0～1.5mg·L^-1、NAA0.05～0.1mg·L^-1、蔗糖30～35g·L^-1、琼脂粉6～6.3g·L^-1、抗褐化剂PVP100～200mg·L^-1，并调节pH至5.78～5.82；所述的改良MS基本培养基为3/4MS基本培养基；

植物愈伤组织继代增殖培养基配方分别为：

基本培养基WPM中添加6-BA0.5mg·L^-1、IBA 0.1mg·L^-1、蔗糖25～30g·L^-1、琼脂粉6.0～6.3g·L^-1、抗褐化剂PVP 100～200mg·L^-1，并调节pH至5.78～5.82；或基本培养基WPM中添加6-BA 1～1.5mg·L^-1、NAA0.05～0.1mg·L^-1、蔗糖25～30g·L^-1、琼脂粉6.0～6.3g·L^-1、抗褐化剂PVP 100～200mg·L^-1，并调节pH至5.78～5.82。

2.基于权利要求1所述的青钱柳愈伤组织诱导及继代增殖培养基的培养方法，其特征是，包括如下步骤：

(3)无菌抗褐化体系建立：将修剪好的茎段平放于灭菌的诱导培养基中，用封口膜密封后放入培养室培养，培养室光照时间为12h/天，光照强度为1500Lx，培养温度为21±2℃；

(4)增殖培养：待愈伤组织诱导培养40天后，切取淡黄色无褐变、质地疏松、生长旺盛的愈伤组织，将其移至继代增殖培养基中进行继代增殖培养，用封口膜密封后放入培养室培养，培养室光照时间为12h/天，光照强度为1500Lx，培养温度为21±2℃，每隔40～45d继代一次。

3.根据权利要求2所述的基于青钱柳愈伤组织诱导及继代增殖培养基的培养方法，其特征是，所述步骤(1)中，外植体选择的具体方法为：在晴好天气下，从2～5年生青钱柳植株上向阳面外围，选取当年生健康、无病害的营养枝，从顶端1、2节处剪取长度为3～4cm的半木质化带芽茎段，保留1个腋芽。

4.根据权利要求2所述的基于青钱柳愈伤组织诱导及继代增殖培养基的培养方法，其特征是，所述步骤(2)中，酒精浓度为75％，浸泡25～30s，次氯酸钠浓度为10％，浸泡3～4min。

5.根据权利要求2所述的基于青钱柳愈伤组织诱导及继代增殖培养基的培养方法，其特征是，所述步骤(2)中，外植体灭菌前，修剪茎段上的叶片，保留叶柄和1/5叶片，自来水冲洗1～2小时，转置超净工作台进行消毒处理。

6.根据权利要求2所述的基于青钱柳愈伤组织诱导及继代增殖培养基的培养方法，其特征是，所述步骤(3)中，将消毒好的青钱柳茎段平铺于已消毒的滤纸上晾干后再进行接种。

7.根据权利要求2所述的基于青钱柳愈伤组织诱导及继代增殖培养基的培养方法，其特征是，所述步骤(3)中，修剪方法为：用已灭菌的剪刀去除茎段首尾两端和部分叶柄；将修剪好的茎段平放于灭菌的培养基中时，平放部位深度占茎段直径的1/4，每瓶培养基平放2～3个茎段。

8.根据权利要求2所述的基于青钱柳愈伤组织诱导及继代增殖培养基的培养方法，其特征是，所述步骤(4)中，愈伤组织的切取方法为：在超净工作台上用组培刀将愈伤分离成小块，剔除愈伤组织上的褐化组织；进行继代增殖培养时，每瓶培养基接入3个愈伤组织材料。