CN106508681A

CN106508681A - 一种越橘脱毒繁育方法及其脱毒培养基

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Publication number: CN106508681A
Application number: CN201610998569.0A
Authority: CN
Inventors: 李艳霞; 李桂君; 刘建明; 刘忠玲; 王洪梅; 田新华
Original assignee: FORESTRY RESEARCH INSTITUTE OF HEILONGJIANG PROVINCE
Current assignee: FORESTRY RESEARCH INSTITUTE OF HEILONGJIANG PROVINCE; Heilongjiang Ke Nuo Technology Co ltd
Priority date: 2016-11-14
Filing date: 2016-11-14
Publication date: 2017-03-22
Anticipated expiration: 2036-11-14
Also published as: CN106508681B

Abstract

本发明提供了一种越橘的脱毒繁育方法，包括以下步骤：将越橘休眠枝条催芽，芽长至1～3cm时剪下灭菌处理；将所述灭菌后的芽切取茎尖0.3～0.8cm接种基础培养基上，在温度为25～28℃、光照强度为1800～2200Lx、光照时间为12～16h/d的条件下进行培养；待所述茎尖长到1.5～2.0cm时，在无菌环境下切取0.03～0.05cm的茎尖接种至脱毒培养基上，在温度为22～25℃的条件下进行暗培养5～9天，在温度23～26℃、光照强度1800～2200Lx、光照时间12～16h/d环境继续培养；将脱毒苗接种到培养基上快速增殖培养，待苗长至2.0～3.0cm之后再进行炼苗生根。

Description

一种越橘脱毒繁育方法及其脱毒培养基

技术领域

本发明涉及植物脱毒培养快繁技术领域，具体涉及一种越橘脱毒苗的繁育方法及其脱毒培养基。

背景技术

在实际生产中，许多无性繁殖的植物会受到病毒的感染，越橘是以母株形成的匍匐根茎繁殖，苗木在生长过程中易感染病毒，病毒对寄生的越桔可造成毁灭性危害，导致大幅度减产，甚至全株死亡，还会导致种性退化、品质变劣。很好地保持品种的优良特性是实际生产和繁育的基本要求，因此，寻求一种既能保持品种优良特性又能摆脱病毒感染的处理方法对越桔生产是至关重要的。

脱毒是多种植物汰除病毒的方法，目前，通过组织培养实现商业化的脱毒试管苗，在果树蔬菜，花卉领域已十分普遍，经脱毒处理的作物产量显著增加，植物组织培养脱毒技术的不断改进和提高以适应大规模的生产已势在必行。但是由于不同植物对同种感染病毒的敏感度和抵抗力也不同，同时不同病毒对感染的寄主植物具有选择性，加之愈伤组织经过多次继代常发生一些变异，导致不同寄主植物和不同病毒之间脱毒方法和脱毒效果不尽相同。尽管马铃薯、甘薯、大蒜、香蕉、柑橘、苹果、葡萄、百合、草莓、矮牵牛、康乃馨、月季、菊花、牡丹、花叶芋、山茶、甘蔗、草莓等经组织培养的脱毒方法已在中国广泛应用，但是越橘脱毒尚未见报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于越橘脱毒繁育的脱毒培养基和越橘脱毒繁育的方法，使所述方法对TomRSV番茄环斑病毒具有较高的脱毒效率同时经脱毒处理的越橘具有较高的成活率。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种用于越橘脱毒繁育的脱毒培养基，以水为溶剂，包括以下含量的组分的改良WPM培养基：0.1～1.0mg/L吲哚丁酸、0.1～0.5mg/L赤霉素、0.1～0.5mg/L 6-苄氨基腺嘌呤、15～25g/L蔗糖和5～7g/L琼脂，所述脱毒培养基pH为5.2～5.8。

优选的，包括以下含量的组分的改良WPM培养基：0.4～0.6mg/L吲哚丁酸、0.2～0.4mg/L赤霉素、0.2～0.4mg/L 6-苄氨基腺嘌呤、18～23g/L蔗糖和5.5～6.0g/L琼脂，所述脱毒培养基的pH为5.4～5.6。

本发明还提供一种越橘的脱毒繁育方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将越橘休眠枝条催芽，芽长至1～3cm时剪下，进行灭菌处理；

2)将所述步骤1)灭菌后的芽切取茎尖0.3～0.8cm接种基础培养基上，在温度为25～28℃、光照强度为1800～2200Lx、光照时间为12～16h/d的条件下进行培养；

3)待所述步骤2)的茎尖长到1.5～2.0cm时，在无菌环境下切取0.03～0.05cm的茎尖接种至权利要求1或2所述的脱毒培养基上，在温度为22～25℃的条件下进行暗培养5～9天，再在温度为23～26℃、光照强度为1800～2200Lx、光照时间为12～16h/d的条件下进行培养，得到脱毒苗；

4)待所述步骤3)得到的脱毒苗长至1.5～2.0cm，接种到快速增殖培养基上进行快速增殖培养；

5)将所述步骤4)得到的脱毒苗长至2.0～3.0cm进行炼苗生根。

优选的，所述步骤1)中的基础培养基为含有0.8～1.2mg/L反式玉米素、18～23g/L蔗糖、5.0～6.0g/L琼脂的改良WPM培养基，所述改良WPM培养基的pH为5.4～5.6；

所述改良的WPM培养基包括以下含量的组分：400mg/L NH₄NO₃、202mg/L KNO₃、198mg/L(NH₄)2SO₄、408mg/L KH₂PO₄、370mg/L MgSO₄.7H₂O，708mg/L Ca(NO₃)₂.4H₂O、6.2mg/LH₃BO₃、22.3mg/L MnSO₄·4H₂O、8.6mg/LZnSO₄·7H₂O、0.25mg/LNa₂MoO₄·2H₂O、0.25mg/LCuSO₄·5H₂O、27.8mg/L FeSO₄·7H₂O、37.3mg/L Na₂-EDTA、100mg/L肌醇、1mg/L盐酸硫胺素、0.5mg/L烟酸、0.5mg/L盐酸吡哆醇和2mg/L甘氨酸。

优选的，所述步骤2)中光照强度为2000Lx；所述步骤2)光照时间为14h/d。

优选的，所述步骤3)中暗培养的时间为7d；所述步骤3)中暗培养的温度为23℃。

优选的，所述步骤4)快速增殖培养基为含有0.5～1.0mg/L吲哚丁酸、0.1～0.3mg/L赤霉素和0.05～0.2mg/L 6-苄氨基腺嘌呤的改良WPM培养基，改良WPM培养基pH为5.4～5.6。

优选的，所述步骤5)炼苗具体为：将增殖培养的脱毒组培瓶苗放到温室，瓶盖打开炼苗2～4d。

优选的，所述步骤5)移栽具体是：将所述炼苗得到的脱毒苗用无菌水冲洗；

将所述冲洗后的脱毒苗在浓度为400～600mg/L的IBA中浸泡5～8min；

将所述浸泡后的脱毒苗用消毒的水苔包裹，移栽到育苗盘中诱导生根，诱导生根的条件为控制相对湿度控制为80％～90％，温度为22～25℃，培养35～50天；

将诱导生根的脱毒苗移栽到培养基质中。

优选的，所述的培养基质为草炭和蛭石按照体积比2～1:1～2形成的混合物。

本发明提供的一种用于越橘脱毒繁育的脱毒培养基，以水为溶剂，包括以下含量的组分的改良WPM培养基：0.1～1.0mg/L吲哚丁酸、0.1～0.5mg/L赤霉素、0.1～0.5mg/L 6-苄氨基腺嘌呤、15～25g/L蔗糖和5～7g/L琼脂。越橘茎尖组织经所述脱毒培养基培养，脱毒率达到92～100％，成苗率达到86％～95％，与对照组相比，脱毒率提高了84％～100％，成苗率也明显优于对照组，能够有效解决TomRSV番茄环斑病毒的脱毒不彻底的问题，并且降低病菌感染子芽的几率，使得子芽能够很好的出苗，并且幼苗长势良好，抗病性增强。

本发明还提供一种越橘的脱毒繁育方法，利用越橘茎尖进行组织培养方法，将不含毒的新芽采用系列培养基上进行培养，达到100％脱毒的效果，同时解决因番茄环斑病毒引起的越橘种质退化问题。适合工厂化育苗，可商品化生产。通过越橘子芽脱毒组培繁殖，加快了繁殖速度了，提高了作物品质，满足市场需求。

具体实施方式

本发明提供了一种用于越橘脱毒繁育的脱毒培养基，以水为溶剂，包括以下含量的组分的改良WPM培养基：0.1～1.0mg/L吲哚丁酸、0.1～0.5mg/L赤霉素、0.1～0.5mg/L 6-苄氨基腺嘌呤、15～25g/L蔗糖和5～7g/L琼脂；优选包括以下含量的组分的改良WPM培养基：0.4～0.6mg/L吲哚丁酸、0.2～0.4mg/L赤霉素、0.2～0.4mg/L 6-苄氨基腺嘌呤、18～23g/L蔗糖和5.5～6.0g/L琼脂；更优选包括以下含量的组分的改良WPM培养基：0.5mg/L吲哚丁酸、0.3mg/L赤霉素、0.3mg/L6-苄氨基腺嘌呤、20g/L蔗糖和5.8g/L琼脂。

3)待所述步骤2)的茎尖长到1.5～2.0cm时，在无菌环境下切取0.03～0.05cm的茎尖接种至脱毒培养基上，在温度为22～25℃的条件下进行暗培养5～9天，再在温度为23～26℃、光照强度为1800～2200Lx、光照时间为12～16h/d的条件下进行培养，得到脱毒苗；

5)将所述步骤4)得到的脱毒苗长至将增殖培养的脱毒组培瓶苗放到温室，瓶盖打开炼苗2～4d进行炼苗。

本发明将越橘休眠枝条催芽，芽长至1～3cm时剪下，进行灭菌处理。

本发明中，所述催芽的方法优选采用水培催芽。所述水培催芽具体是将休眠枝条在清水中培养直至长出新芽。

本发明中，所述灭菌的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员常用的组培中灭菌的技术方案即可。本发明实施例中，所述的灭菌处理优选为用70％～75％的乙醇溶液洗涤50～70s，用无菌水冲洗1～2次，再用体积浓度0.1％～0.15％的升汞浸泡2～3min，无菌水冲洗5～6次，再用无菌滤纸吸干表面水分。

灭菌处理后，本发明将所述灭菌后的芽切取茎尖0.3～0.8cm接种基础培养基上，在温度为25～28℃、光照强度为1800～2200Lx、光照时间为12～16h/d的条件下进行培养；

本发明中，所述茎尖的长度优选为0.5cm。

在本发明中，所述基础培养基优选为含有0.8～1.2mg/L反式玉米素、18～23g/L蔗糖、5.0～6.0g/L琼脂的改良WPM培养基；所述改良的WPM培养基优选包括以下含量的组分：400mg/L NH₄NO₃、202mg/L KNO₃、198mg/L(NH₄)2SO₄、408mg/L KH₂PO₄、370mg/L MgSO₄.7H₂O，708mg/L Ca(NO₃)₂.4H₂O、6.2mg/L H₃BO₃、22.3mg/L MnSO₄·4H₂O、8.6mg/L ZnSO₄·7H₂O、0.25mg/LNa₂MoO₄·2H₂O、0.25mg/L CuSO₄·5H₂O、27.8mg/L FeSO₄·7H₂O、37.3mg/LNa₂-EDTA、100mg/L肌醇、1mg/L盐酸硫胺素、0.5mg/L烟酸、0.5mg/L盐酸吡哆醇和2mg/L甘氨酸。

得到灭菌后的芽，本发明将所述灭菌后的芽切取茎尖0.3～0.8cm接种基础培养基上，在温度为25～28℃、光照强度为1800～2200Lx、光照时间为12～16h/d的条件下进行培养。

本发明中，所述接种的方法没有任何限制，采用本领域技术人员所熟知的接种技术方案即可。

本发明中，所述光照强度优选为2000Lx；所述光照时间优选为14h/d。

待所述茎尖长到1.5～2.0cm时，本发明将茎尖在无菌环境下切取0.03～0.05cm的茎尖接种至上述技术方案所述的脱毒培养基上，在温度为22～25℃的条件下进行暗培养5～9天，再在温度为23～26℃、光照强度为1800～2200Lx、光照时间为12～16h/d的条件下继续培养，得到脱毒苗。

本发明中，所述茎尖的长度优选为0.04cm。

本发明中，所述暗培养后继续培养的温度优选为25℃。

本发明中，所述暗培养后继续培养的光照强度优选为2000Lx。

本发明中，所述暗培养后继续培养的光照时间优选为14h/d。

本发明中，所述暗培养的时间优选为7d；所述暗培养的温度优选为23℃。

待所述脱毒苗长至1.5～2.0cm，本发明将所述脱毒苗接种到快速增殖培养基上进行快速增殖培养。

本发明中，所述快速增殖培养基优选为含有0.5～1.0mg/L吲哚丁酸(IBA)、0.1～0.3mg/L赤霉素(GA3)和0.05～0.2mg/L 6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)的改良WPM培养基，所述改良WPM培养基的pH为5.4～5.6；更优选为含有0.8mg/L吲哚丁酸、0.2mg/L赤霉素和0.1mg/L6-苄氨基腺嘌呤的改良WPM培养基，所述的改良WPM培养基pH为5.5。所述改良的WPM培养基优选与上述方案中改良的WPM培养基相同。

所述脱毒苗长至2.0～3.0cm，本发明将所述脱毒苗进行炼苗。

本发明中，所述炼苗具体为将增殖培养的脱毒组培瓶苗放到温室，瓶盖打开炼苗2～4d。

本发明中，所述炼苗后还优选包括移栽。所述移栽的方法优选包括以下步骤：

A、将所述炼苗得到的脱毒苗用无菌水冲洗；

B、将所述冲洗后的脱毒苗在浓度为400～600mg/L的IBA中浸泡5～8min；

C、将所述浸泡后的脱毒苗用消毒的水苔包裹，移栽到育苗钵中诱导生根，诱导生根的条件为控制相对湿度控制为80％～90％，温度为22～25℃，培养35～50d；

D、将诱导生根的脱毒苗移栽到培养基质中。

炼苗得到脱毒苗后，本发明将所述脱毒苗用无菌水冲洗。在本发明中，所述无菌水的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的无菌水即可。

所述冲洗后，本发明优选将所述冲洗后的脱毒苗在400～600mg/L的IBA中浸泡5～8min。在本发明中，所述IBA的浓度优选为450～550mg/L，更优选为500mg/L；所述浸泡的时间优选为6～7min。

得到IBA浸泡的脱毒苗后，本发明将所述浸泡后的脱毒苗用消毒的水苔包裹，移栽到育苗钵中诱导生根，所述诱导生根的条件为：相对湿度为80％～90％，环境温度为22～25℃，培养35～50天。

本发明中，所述脱毒苗用消毒的水苔包裹优选露出脱毒苗顶部的1/3～1/4。

本发明中，所述营养液为快速增殖培养基。所述的快速增殖培养基与上述进行快速增殖培养过程所用的培养基相同。

本发明中，所述诱导生根的相对湿度优选为85％，所述诱导生根的环境温度优选为23℃；所述诱导生根的培养时间优选为42d。

得到诱导生根的脱毒苗后，本发明优选将诱导生根的脱毒苗移栽到培养基质中。本发明中，所述移栽的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的移栽的技术方案即可。

本发明中，所述的培养基质为草炭和蛭石。所述草炭和蛭石按照体积比2～1:1～2混合。

下面结合实施例对本发明提供的一种越橘脱毒繁育方法及其培养基进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

取越橘休眠枝条水培催芽，待休眠芽长至2cm时剪下，在超净工作台上进行灭菌处理。用70％乙醇洗涤60S，用无菌水冲洗1次，再用0.1％升汞浸泡3min，无菌水冲洗5次，再用无菌滤纸吸干表面水分。切取茎尖0.3-0.8cm接种至附加反式玉米素0.8mg/L，添加蔗糖18g/L、琼脂5.0g/L、pH为5.5的改良WPM培养基上进行无菌培养，所述改良的WPM培养基成份及使用用量为：400mg/LNH₄NO₃、202mg/LKNO₃、198mg/L(NH₄)2SO₄、408mg/LKH₂PO₄、370mg/LMgSO₄.7H₂O，708mg/L Ca(NO₃)₂.4H₂O、6.2mg/L H₃BO₃、22.3mg/L MnSO₄·4H₂O、8.6mg/LZnSO₄·7H₂O、0.25mg/LNa₂MoO₄·2H₂O、0.25mg/L CuSO₄·5H₂O、27.8mg/L FeSO₄·7H₂O、37.3mg/L Na₂-EDTA、100mg/L肌醇、1mg/L盐酸硫胺素、0.5mg/L烟酸、0.5mg/L盐酸吡哆醇和2mg/L甘氨酸；培养条件为：温度25℃，光照强度为1800Lx，光照时间为12h/d。当茎尖长到1.5cm时，在体视显微镜下切取0.03cm的茎尖接种至附加0.5mg/L吲哚丁酸、0.2mg/L赤霉素和0.1mg/L6-苄氨基腺嘌呤，添加蔗糖20g/L、琼脂5.6g/L的改良WPM培养基上进行暗培养，暗培养5天，暗培养温度22℃。暗培养之后，在温度25℃，光照强度2000Lx，光照时间14h/d下进行脱毒苗培养。在脱毒苗长至1.5cm时，将苗接种到改良的WPM培养基添加反式玉米素0.8mg/L、蔗糖20g/L、琼脂5.6g/L的培养基上进行脱毒苗快速增殖培养。进行脱毒试管苗的炼苗和移栽；将增殖培养的试管苗炼苗3天后成簇取出，用清水冲洗基部，去除培养基。在浓度为600ppm的IBA中浸泡5min，用消毒的水苔包裹脱毒苗，仅露出1/3顶部即可，栽到96孔的小营养钵诱导生根，用透光的塑料薄膜覆盖保温保湿，利用加湿器雾化加湿，相对湿度控制在80％，温度控制在22℃，42天生根。脱毒苗生根后连同水苔一起移栽到草炭：蛭石(体积比)＝1:2组成的基质中培养。

实施例2

取越橘休眠枝条水培催芽，待休眠芽长至2cm时剪下，在超净工作台上进行灭菌处理。用70％乙醇洗涤60S，用无菌水冲洗1次，再用0.1％升汞浸泡3min，无菌水冲洗5次，再用无菌滤纸吸干表面水分。切取茎尖0.8cm接种至附加反式玉米素1.2mg/L，添加蔗糖23g/L、琼脂6.0g/L，pH为5.4的改良WPM培养基上进行无菌培养，所述改良的WPM培养基成份及使用用量为：400mg/LNH₄NO₃、202mg/LKNO₃、198mg/L(NH₄)2SO₄、408mg/LKH₂PO₄、370mg/LMgSO₄.7H₂O，708mg/L Ca(NO₃)₂.4H₂O、6.2mg/L H₃BO₃、22.3mg/L MnSO₄·4H₂O、8.6mg/LZnSO₄·7H₂O、0.25mg/LNa₂MoO₄·2H₂O、0.25mg/L CuSO₄·5H₂O、27.8mg/LFeSO₄·7H₂O、37.3mg/LNa₂-EDTA、100mg/L肌醇、1mg/L盐酸硫胺素、0.5mg/L烟酸、0.5mg/L盐酸吡哆醇和2mg/L甘氨酸；培养条件为：温度25℃，光照强度为2200Lx，光照时间为16h/d。当茎尖长到2.0cm时，在体视显微镜下切取0.05cm的茎尖接种至附加0.5mg/L吲哚丁酸(IBA)、0.2mg/L赤霉素(GA3)和0.1mg/L6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)，添加蔗糖20g/L、琼脂5.6g/L的改良WPM培养基上进行暗培养，暗培养5-9天，暗培养温度25℃，暗培养时间优选7天，优选温度23℃。暗培养之后，在温度25℃，光照强度2000Lx，光照时间14h/d下进行脱毒苗培养。在脱毒苗长至2.0cm时，将苗接种到改良的WPM培养基添加反式玉米素0.8mg/L、蔗糖20g/L、琼脂5.6g/L的培养基上进行脱毒苗快速增殖培养。进行脱毒试管苗的炼苗和移栽；将增殖培养的试管苗炼苗5天后成簇取出，用清水冲洗基部，去除培养基。在浓度为400ppm的IBA中浸泡8min，用消毒的水苔包裹脱毒苗，仅露出1/4顶部即可，栽到96孔的小营养钵诱导生根，用透光的塑料薄膜覆盖保温保湿，利用加湿器雾化加湿，相对湿度控制在90％，温度控制在25℃，45天生根。脱毒苗生根后连同水苔一起移栽到草炭：蛭石(体积比)＝2:1组成的基质中培养。

实施例3

取越橘休眠枝条水培催芽，待休眠芽长至2cm时剪下，在超净工作台上进行灭菌处理。用70％乙醇洗涤60S，用无菌水冲洗1次，再用0.1％升汞浸泡3min，无菌水冲洗5次，再用无菌滤纸吸干表面水分。切取茎尖0.5cm接种至附加反式玉米素1.0mg/L，添加蔗糖20g/L、琼脂5.6g/L，pH为5.4的改良WPM培养基上进行无菌培养，所述改良的WPM培养基成份及使用用量为：400mg/LNH₄NO₃、202mg/LKNO₃、198mg/L(NH₄)2SO₄、408mg/LKH₂PO₄、370mg/LMgSO₄.7H₂O，708mg/L Ca(NO₃)₂.4H₂O、6.2mg/L H₃BO₃、22.3mg/L MnSO₄·4H₂O、8.6mg/LZnSO₄·7H₂O、0.25mg/LNa₂MoO₄·2H₂O、0.25mg/L CuSO₄·5H₂O、27.8mg/L FeSO₄·7H₂O、37.3mg/L Na₂-EDTA、100mg/L肌醇、1mg/L盐酸硫胺素、0.5mg/L烟酸、0.5mg/L盐酸吡哆醇和2mg/L甘氨酸；培养条件为：温度25℃，光照强度为2000Lx，光照时间14h/d。当茎尖长到1.8cm时，在体视显微镜下切取0.04cm的茎尖接种至附加0.5mg/L吲哚丁酸(IBA)、0.2mg/L赤霉素(GA3)和0.1mg/L6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)，添加蔗糖20g/L、琼脂5.6g/L的改良WPM培养基上进行暗培养，暗培养7天，暗培养温度23℃。暗培养之后，在温度25℃，光照强度2000Lx，光照时间14h/d下进行脱毒苗培养。在脱毒苗长至1.8cm时，将苗接种到改良的WPM培养基添加反式玉米素0.8mg/L、蔗糖20g/L、琼脂5.6g/L，pH为5.5的培养基上进行脱毒苗快速增殖培养。进行脱毒试管苗的炼苗和移栽；将增殖培养的试管苗炼苗4天后成簇取出，用清水冲洗基部，去除培养基。在浓度为500ppm的IBA中浸泡6min，用消毒的水苔包裹脱毒苗，仅露出1/3顶部即可，栽到96孔的小营养钵诱导生根，用透光的塑料薄膜覆盖保温保湿，利用加湿器雾化加湿，相对湿度控制在85％，温度控制在24℃，40天生根。脱毒苗生根后连同水苔一起移栽到草炭：蛭石(体积比)＝1:1组成的基质中培养。

对比例

取越橘休眠枝条水培催芽，待休眠芽长至2cm时剪下，在超净工作台上进行灭菌处理。用70％乙醇洗涤60S，用无菌水冲洗1次，再用0.1％升汞浸泡3min，无菌水冲洗5次，再用无菌滤纸吸干表面水分。切取茎尖0.5cm接种至附加反式玉米素1.0mg/L，添加蔗糖20g/L、琼脂5.6g/L的改良WPM培养基上进行无菌培养，所述改良的WPM培养基成份及使用用量为：400mg/L NH₄NO₃、202mg/LKNO₃、198mg/L(NH₄)2SO₄、408mg/LKH₂PO₄、370mg/L MgSO₄.7H₂O，708mg/L Ca(NO₃)₂.4H₂O、6.2mg/L H₃BO₃、22.3mg/L MnSO₄·4H₂O、8.6mg/LZnSO₄·7H₂O、0.25mg/LNa₂MoO₄·2H₂O、0.25mg/L CuSO₄·5H₂O、27.8mg/L FeSO₄·7H₂O、37.3mg/L Na₂-EDTA、100mg/L肌醇、1mg/L盐酸硫胺素、0.5mg/L烟酸、0.5mg/L盐酸吡哆醇和2mg/L甘氨酸；培养条件为：温度25℃，光照强度为2000Lx，光照时间14h/d。当茎尖长到1.8cm时，在体视显微镜下切取0.04cm的茎尖接种至普通脱毒培养基上，普通脱毒培养基为添加反式玉米素1.0mg/L，蔗糖20g/L、琼脂5.6g/L的改良WPM培养基上进行暗培养，暗培养7天，暗培养温度23℃。暗培养之后，在温度25℃，光照强度2000Lx，光照时间14h/d下进行脱毒苗培养。在脱毒苗长至1.8cm时，将苗接种到改良的WPM培养基添加反式玉米素0.8mg/L、蔗糖20g/L、琼脂5.6g/L的培养基上进行脱毒苗快速增殖培养。进行脱毒试管苗的炼苗和移栽；将增殖培养的试管苗炼苗4天后成簇取出，用清水冲洗基部，去除培养基。在浓度为500ppm的IBA中浸泡6min，用消毒的水苔包裹脱毒苗，仅露出1/3顶部即可，栽到96孔的小营养钵诱导生根，用透光的塑料薄膜覆盖保温保湿，利用加湿器雾化加湿，相对湿度控制在85％，温度控制在24℃，45天生根。脱毒苗生根后连同水苔一起移栽到草炭：蛭石(体积比)＝1:1组成的基质中培养。

将实施例1～3和对比例脱毒培养得到的越橘植株苗的生长及结果情况进行定期观察，并对越橘植株苗的生长状态、感染TomRSV番茄环斑病毒的情况以及果实产量和质量进行记录，具体实验数据见表1。

表1实施例1～3和对比例脱毒培养得到的越橘植株苗的生长及结果情况

由以上实施例可知，本发明提供的一种越橘脱毒繁育方法及其脱毒培养基，培养植株的脱毒率达到92～100％，成苗率达到86％～95％，与对照组相比，脱毒率提高了84％～100％，成苗率也明显优于对照组，同时脱毒苗发育的植株生长状态良好，与对照组相比脱毒株苗的产量提高50％，且果实色泽鲜艳，形状正常，赢得消费者的喜爱。实验结果表明本发明提供的一种越橘脱毒繁育方法及其脱毒培养基能够有效解决TomRSV番茄环斑病毒的脱毒不彻底的问题，并且降低病菌感染子芽的几率，使得子芽能够很好的出苗，并且幼苗长势良好，抗病性增强；通过越橘子芽脱毒组培繁殖，加快了繁殖速度，提高了作物品质，满足市场需求。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种用于越橘脱毒繁育的脱毒培养基，其特征在于，以水为溶剂，包括以下含量的组分的改良WPM培养基：0.1～1.0mg/L吲哚丁酸、0.1～0.5mg/L赤霉素、0.1～0.5mg/L 6-苄氨基腺嘌呤、15～25g/L蔗糖和5～7g/L琼脂的，所述脱毒培养基pH为5.2～5.8。

2.根据权利要求1所述的脱毒培养基，其特征在于，包括以下含量的组分：0.4～0.6mg/L吲哚丁酸、0.2～0.4mg/L赤霉素、0.2～0.4mg/L 6-苄氨基腺嘌呤、18～23g/L蔗糖和5.5～6.0g/L琼脂，所述脱毒培养基pH为5.2～5.8。

3.一种越橘的脱毒繁育方法，其特征在于，包括以下步骤：

5)将所述步骤4)得到的脱毒苗长至2.0～3.0cm进行生根炼苗。

4.根据权利要求3所述的脱毒繁育方法，其特征在于，所述步骤1)中的基础培养基为含有0.8～1.2mg/L反式玉米素、18～23g/L蔗糖、5.0～6.0g/L琼脂的改良WPM培养基，所述脱毒培养基pH为5.2～5.8；

所述改良的WPM培养基包括以下含量的组分：400mg/L NH₄NO₃、202mg/L KNO₃、198mg/L(NH₄)₂SO₄、408mg/L KH₂PO₄、370mg/L MgSO₄.7H₂O，708mg/L Ca(NO₃)₂.4H₂O、6.2mg/L H₃BO₃、22.3mg/L MnSO₄·4H₂O、8.6mg/L ZnSO₄·7H₂O、0.25mg/L Na₂MoO₄·2H₂O、0.25mg/L CuSO₄·5H₂O、27.8mg/L FeSO₄·7H₂O、37.3mg/LNa₂-EDTA、100mg/L肌醇、1mg/L盐酸硫胺素、0.5mg/L烟酸、0.5mg/L盐酸吡哆醇和2mg/L甘氨酸。

5.根据权利要求3所述的脱毒繁育方法，其特征在于，所述步骤2)中光照强度为2000Lx；所述步骤2)光照时间为14h/d。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中暗培养的时间为7d；所述步骤3)中暗培养的温度为23℃。

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤4)快速增殖培养基为含有0.5～1.0mg/L吲哚丁酸、0.1～0.3mg/L赤霉素和0.05～0.2mg/L 6-苄氨基腺嘌呤的改良WPM培养基pH为5.4～5.6。

8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤5)炼苗具体为：将增殖培养的脱毒组培瓶苗放到温室，瓶盖打开炼苗2～4d。

9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤5)移栽具体是：将所述炼苗得到的脱毒苗用无菌水冲洗；

将诱导生根的脱毒苗连同水苔一起移栽到培养基质中。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的培养基质为草炭和蛭石按照体积比2～1:1～2形成的混合物。