CN107494271A - 一种果蔗脱毒组培快繁的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种果蔗脱毒组培快繁的方法。本发明的方法包括：1）外植体的选择；2）高温减毒处理；3）茎尖脱毒接种和无菌苗获得；4）病原体检测；5）继代增殖；6）生根与炼苗；7）假植移栽及管理。本发明将温水处理和人工气候箱高温催芽有效结合，对蔗芽进行减毒处理，脱毒率高；选取3‑5mm的茎尖启动接种培养，成活率高达90%以上；启动培养过程，通过更换启动培养基、在培养基中添加PVP的方式，有效避免褐化，提高无菌株系获得率；在生根培养基添加MET成分，使生根过程出根快、根多、整齐；组培快繁过程的培养基均使用较低浓度的激素，最大程度地减少激素对组培苗的影响，保持品种原有种性，增殖系数为2‑4倍，达到提纯复壮、快速繁育的目的。

Description

一种果蔗脱毒组培快繁的方法

技术领域

本发明涉及一种植物的脱毒组培快繁的方法，具体是一种果蔗脱毒组培快繁的方法，属于甘蔗脱毒组培技术领域。

背景技术

目前我国种植的果蔗品种单一、种植年代较多，严重感染宿根矮化病、花叶病等种苗病害，种性退化严重，影响果蔗产量及品质。选用脱毒健康种苗可有效去除宿根矮化病、花叶病等种传病害病原菌，恢复果蔗品种的优良种性。

获得脱毒健康种苗的方法很多，例如用热水处理种茎、组培茎尖脱毒、愈伤组织培养等。其中利用热水处理种茎方法简单易行，但工作量比较大，脱毒不彻底；利用组培茎尖脱毒虽然脱毒效果好，但技术要求较高，成活率低；利用愈伤组织培养存在遗传性状不稳定等缺点。因此，生产上需要一种操作简单、脱毒效果好、成活率高、成本较低、遗传性状稳定的方法来满足果蔗脱毒组培快繁的需求。

发明内容

本发明的目的是提供一种果蔗脱毒组培快繁的方法，该方法将温水处理和人工气候箱高温催芽有效结合起来对蔗芽进行减毒处理，利用组培茎尖脱毒技术和组培快繁技术，可短时期内获得大量脱毒果蔗组培苗，解决了脱毒不彻底、操作难度大、遗传性状不稳定等问题，可有效满足生产需要。

本发明的技术方案如下：一种果蔗脱毒组培快繁的方法，包括如下步骤：

1）外植体的选择：选取品种纯正、长势健壮、无病害、蔗芽饱满植株，取中间蔗芽成熟而饱满的果蔗蔗茎将其砍成单芽段，用自来水洗净备用；

2）高温减毒处理：将步骤1）处理后的单芽段放入50℃恒温水箱中进行温热处理2h，捞起晾干，再将其种于预先经压力为1.1-1.2kg/cm²的高压蒸汽灭菌锅在121℃消毒30min的基质中，淋透水，然后置于38-40℃的人工气候箱中连续进行高温恒温催芽8-12天，期间喷水，保持基质湿润，每天换气2-3次，每次1-2min；待蔗芽长到6-10cm高时，取出作为下一步组培接种外植体；所述基质为椰糠与泥炭土按1︰1体积比均匀混合得到；

3）茎尖脱毒接种和无菌苗获得：将步骤2）处理得到的6-10cm高的蔗芽从基部小心切下，去掉外面1-2层叶片和叶鞘，置于超净工作台上，用75%酒精消毒过的接种刀切除多余的叶片，保留5cm大小，放入0.1%氯化汞溶液中浸泡8-12min进行消毒，然后倒掉氯化汞消毒液，加入等量无菌水浸洗3-4次，浸洗时要时不时进行摇晃或搅拌，每次浸洗时间为4-5min，最后一次浸洗完后将水倒出，用消毒过的镊子将蔗芽夹出放在消过毒的接种碟上，在超净工作台上慢慢晾干水分，然后用消过毒的镊子和接种刀小心将蔗芽叶片一层层剥离，直到露出3-5mm的茎尖生长点，用锋利的消过毒的接种刀将茎尖切下接种到启动培养基中，于25℃自然散射光下培养，培养期间，前2-3次每5-7天更换一次新鲜的培养基，之后每10-15天更换一次新鲜的培养基，40-45天后形成丛生芽；

4）病原体检测：取步骤3）获得的丛生芽叶片，采用PCR或RT-PCR技术进行病原菌检测，确定不带宿根矮化病和花叶病后，再将无病菌病毒的丛生芽作为原种进行进一步的继代增殖；

5）继代增殖：将步骤4）检测后确定无病菌病毒的丛生芽在无菌条件下自然分成单株或多株，转接于分化培养基，在温度26±2℃、相对湿度40%-70%、光照度1000~1500lx、光照时间10~12h/天条件下继代培养，15-20天继代1次，继代次数控制在10代以内，增殖系数为2-4；

6）生根与炼苗：将步骤5）继代增殖所获得的5-10cm高的小苗在无菌条件下切除过长叶片，接种到生根培养基中，置于温度25±3℃、相对湿度40%-70%、自然光照条件下的炼苗棚或炼苗室内边促根边炼苗；培育6-10天开始出根，15-20天长出完整根系，获得生根组培苗，苗粗壮，叶色青绿；

7）假植移栽及管理：将步骤6）获得的生根组培苗从培养瓶或培养袋中取出，洗掉培养基，减去1/3~1/2的多余叶片，用0.2%多菌灵消毒后，自然分成3~5株为一丛，按照5cm×5cm株行距移栽到苗床上，淋足定根水，搭小拱棚用薄膜覆盖，外加遮阳网遮盖避免强光暴晒；假植5天后，新根系开始长出，叶片稍展开即喷施0.1%尿素和0.1%磷酸二氢钾混合溶液以促进小苗生长，其后每周施一次水肥，并注意适当剪叶和病虫害防治；待小苗返青后，逐渐揭去遮阳网和薄膜，使小苗进一步适应外界环境；20~30天后当密植苗长到5片真叶时，分单株进行上袋假植，其水肥管理同丛苗密植圃假植；经2-3个月上袋假植，假茎高15-20 cm时出圃到一级圃进行扩繁。

优选的，所述步骤 3）中的启动培养基的配方组成为：MS+6-BA 0.5-1.5mg/L+NAA0.1-0.3mg/L +糖30g/L+琼脂粉0.45%。

优选的，所述步骤 5）中的分化培养基的配方组成为：MS+6-BA 1.0-3.0mg/L +KT0.1-0.5 mg/L+糖30g/L+琼脂粉0.45%。

优选的，所述步骤 6）中的生根培养基的配方组成为：1/2MS+NAA 0.5-1.0mg/L+IBA 1.0-2.0mg/L +MET 0.5-1.0mg/L +糖50g/L+琼脂粉0.45%。

进一步的，所述步骤 3）中，前2-3次每5-7天更换一次新鲜培养基，并在培养基中添加PVP 500mg/L，之后每10-15天更换一次新鲜的培养基，并在更换的新鲜培养基中添加PVP 200mg/L。通过更换启动培养基，并在启动培养的不同阶段，在培养基中添加一定量的PVP，可有效避免其褐化，提高无菌株系的获得率。

本发明方法适用于果蔗脱毒组培苗的快速繁育，在培养过程，可以选择瓶式培养也可以聚丙烯薄膜袋为培养容器，进行袋式培养，节约成本。本发明相对于现有技术的有益效果如下：

（1）本发明将温水处理和人工气候箱高温催芽有效结合起来对蔗芽进行减毒处理，脱毒率高；

（2）本发明在组培启动接种过程中切取3-5mm较大体积的茎尖进行培养，便于操作，成活率高达90%以上；在启动培养时，通过更换新鲜的启动培养基，并根据茎尖在启动培养不同阶段的生长需求特点，在培养基中添加一定量的PVP，可有效避免其褐化，提高无菌株系的获得率；在生根培养基添加了MET成分，可使得生根过程出根快、根多、整齐；

（3）本发明在组培快繁过程中所用的培养基均使用较低浓度的激素，最大程度地减少了激素对组培苗的影响，突变机率极小、繁殖系数高，保持了品种原来的种性，增殖系数为2-4倍，达到提纯复壮，快速繁育的目的。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。

实施例1以粤东8号果蔗为材料，采用以下步骤实现本发明：

1）外植体的选择：选取品种纯正、长势健壮、无病害、蔗芽饱满植株，取中间蔗芽成熟而饱满的蔗茎将其砍成单芽段，用自来水洗净备用；

2）高温减毒处理：将步骤1）处理后的单芽段放入50℃恒温水箱中进行温热处理2h，捞起晾干，再将其种于预先消毒好的椰糠+泥炭土基质中，置于38-40℃的人工气候箱中连续进行高温恒温催芽8天，期间适时喷水，保持基质湿润，每天换气2次，每次2min；待蔗芽长到6cm高，取出作为下一步组培接种外植体；其中，基质为椰糠与泥炭土按1︰1体积比均匀混合得到；基质预先经压力为1.2kg/cm²的高压蒸汽灭菌锅在121℃消毒30min；

3）茎尖脱毒接种和无菌苗获得：将步骤2）处理得到的6cm高的蔗芽从基部小心切下，去掉外面1-2层叶片和叶鞘，置于超净工作台上，用75%酒精消毒过的接种刀切除多余的叶片，保留5cm大小，放入0.1%氯化汞溶液中浸泡8min进行消毒，然后倒掉氯化汞消毒液，加入等量无菌水浸洗4次，浸洗时要时不时进行摇晃或搅拌，每次浸洗时间为4-5min，最后一次浸洗完后将水倒出，用消毒过的镊子将蔗芽夹出放在消过毒的接种碟上，在超净工作台上慢慢晾干水分，然后用消过毒的镊子和接种刀小心将蔗芽叶片一层层剥离，直到露出3-5mm的茎尖生长点，用锋利的消过毒的接种刀将茎尖切下接种到启动培养基（启动培养基的组成配方为：MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+糖30g/L+琼脂粉0.45%）中，于25℃自然散射光下培养，培养期间，前3次每5天更换一次新鲜的培养基，并在培养基中添加PVP 500mg/L，之后每10天更换一次新鲜的培养基，并在更换的新鲜培养基中添加PVP 200mg/L ，培养40-45天后形成丛生芽；

4）病原体检测：取适量步骤3）获得的丛生芽叶片，采用PCR技术进行病原菌检测，确定不带宿根矮化病和花叶病后，再将无毒丛生芽作为原种进行进一步的继代增殖；

5）继代增殖：将步骤4）检测后确定无毒的丛生芽在无菌条件下自然分成3-5株一丛，转接于分化培养基（分化培养基的组成配方为：MS+6-BA1.0mg/L+KT 0.1mg/L+糖30g/L+琼脂粉0.45%），在温度26±2℃、相对湿度50±5%、光照度1000~1500lx、光照时间12h/天条件下继代培养，约15天继代1次，继代次数一般控制在10代以内，增殖系数为4；

6）生根与炼苗：将步骤5）继代增殖所获得的5-10cm高的小苗在无菌条件下切除过长叶片，接种到生根培养基（生根培养基的组成配方为：1/2MS+NAA0.5 mg/L +IBA1.5 mg/L +MET1.0 mg/L +糖50g/L+琼脂粉0.45%）中，置于温度25±3℃、相对湿度40%-70%、自然光照条件下的炼苗棚（室）内边促根边炼苗；培育8天左右开始出根，约15-20天长出完整根系，且苗粗壮，叶色青绿；

7）假植移栽及管理：将步骤6）获得的生根组培苗从培养瓶或培养袋中取出，洗掉培养基，减去1/3~1/2的多余叶片，用0.2%多菌灵消毒后，自然分成3~5株为一丛，按照5cm×5cm株行距移栽到苗床上，淋足定根水，搭小拱棚用薄膜覆盖，外加遮阳网遮盖避免强光暴晒；假植5天后，新根系开始长出，叶片稍展开即喷施0.1%尿素和0.1%磷酸二氢钾混合溶液以促进小苗生长，其后每周施一次水肥，并注意适当剪叶和病虫害防治；待小苗返青后，逐渐揭去遮阳网和薄膜，使小苗进一步适应外界环境；20~30天后当密植苗长到5片真叶时，分单株进行上袋假植，其水肥管理同丛苗密植圃假植；经2-3个月上袋假植，假茎高15-20 cm时，出圃到一级圃进行扩繁。

实施例2 以东选7号果蔗为材料，采用以下步骤实现本发明：

1）外植体的选择：选取品种纯正、长势健壮、无病害、蔗芽饱满植株，取中间蔗芽成熟而饱满的蔗茎将其砍成单芽段，用自来水洗净备用；

2）高温减毒处理：将步骤1）处理后的单芽段放入50℃恒温水箱中进行温热处理2h，捞起晾干，再将其种于预先消毒好的椰糠+泥炭土基质中，置于38-40℃的人工气候箱中连续进行高温恒温催芽10天，期间适时喷水，保持基质湿润，每天换气3次，每次1min；待蔗芽长到8cm高，取出作为下一步组培接种外植体；其中，基质为椰糠与泥炭土按1︰1体积比均匀混合得到；基质预先经压力为1.1kg/cm²的高压蒸汽灭菌锅在121℃消毒30min；

3）茎尖脱毒接种和无菌苗获得：将步骤2）处理得到的8cm高的蔗芽从基部小心切下，去掉外面1-2层叶片和叶鞘，置于超净工作台上，用75%酒精消毒过的接种刀切除多余的叶片，保留5cm大小，放入0.1%氯化汞溶液中浸泡12min进行消毒，然后倒掉氯化汞消毒液，加入等量无菌水浸洗3次，浸洗时要时不时进行摇晃或搅拌，每次浸洗时间为4-5min，最后一次浸洗完后将水倒出，用消毒过的镊子将蔗芽夹出放在消过毒的接种碟上，在超净工作台上慢慢晾干水分，然后用消过毒的镊子和接种刀小心将蔗芽叶片一层层剥离，直到露出3-5mm的茎尖生长点，用锋利的消过毒的接种刀将茎尖切下接种到启动培养基（启动培养基的组成配方为：MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.3mg/L+糖30g/L+琼脂粉0.45%）中，于25℃自然散射光下培养，培养期间，前3次每7天更换一次新鲜的培养基，并在培养基中添加PVP 500mg/L，之后每15天更换一次新鲜的培养基，并在更换的新鲜培养基中添加PVP 200mg/L ，培养40-45天后形成丛生芽；

4）病原体检测：取适量步骤3）获得的丛生芽叶片，采用PCR技术进行病原菌检测，确定不带宿根矮化病和花叶病后，再将无毒丛生芽作为原种进行进一步的继代增殖；

5）继代增殖：将步骤4）检测后确定无毒的丛生芽在无菌条件下自然分成3-5株一丛，转接于分化培养基（分化培养基的组成配方为：MS+6-BA3.0mg/L +KT0.5mg/L+糖30g/L+琼脂粉0.45%），在温度26±2℃、相对湿度50±5%、光照度1000~1500lx、光照时间12h/天条件下继代培养，约15天继代1次，继代次数一般控制在10代以内，增殖系数为4；

6）生根与炼苗：将步骤5）继代增殖所获得的5-10cm高的小苗在无菌条件下切除过长叶片，接种到生根培养基（生根培养基的组成配方为：1/2MS+NAA1.0 mg/L +IBA1.0 mg/L +MET0.5 mg/L +糖50g/L+琼脂粉0.45%）中，置于温度25±3℃、相对湿度50%-70%、自然光照条件下的炼苗棚（室）内边促根边炼苗；培育8天左右开始出根，15-20天长出完整根系，且苗粗壮，叶色青绿；

7）假植移栽及管理：将步骤6）获得的生根组培苗从培养瓶或培养袋中取出，洗掉培养基，减去1/3~1/2的多余叶片，用0.2%多菌灵消毒后，自然分成3~5株为一丛，按照5cm×5cm株行距移栽到苗床上，淋足定根水，搭小拱棚用薄膜覆盖，外加遮阳网遮盖避免强光暴晒；假植5天后，新根系开始长出，叶片稍展开即喷施0.1%尿素和0.1%磷酸二氢钾混合溶液以促进小苗生长，其后每周施一次水肥，并注意适当剪叶和病虫害防治；待小苗返青后，逐渐揭去遮阳网和薄膜，使小苗进一步适应外界环境；20~30天后当密植苗长到5片真叶时，分单株进行上袋假植，其水肥管理同丛苗密植圃假植；经2-3个月上袋假植，假茎高15-20 cm时，出圃到一级圃进行扩繁。

实施例3以粤东8号果蔗为材料，采用以下步骤实现本发明：

1）外植体的选择：选取品种纯正、长势健壮、无病害、蔗芽饱满植株，取中间蔗芽成熟而饱满的蔗茎将其砍成单芽段，用自来水洗净备用；

2）高温减毒处理：将步骤1）处理后的单芽段放入50℃恒温水箱中进行温热处理2h，捞起晾干，再将其种于预先消毒好的椰糠+泥炭土基质中，置于38-40℃的人工气候箱中连续进行高温恒温催芽12天，期间适时喷水，保持基质湿润，每天换气3次，每次2min；待蔗芽长到10cm高，取出作为下一步组培接种外植体；其中，基质为椰糠与泥炭土按1︰1体积比均匀混合得到；基质预先经压力为1.2kg/cm²的高压蒸汽灭菌锅在121℃消毒30min；

3）茎尖脱毒接种和无菌苗获得：将步骤2）处理得到的10cm高的蔗芽从基部小心切下，去掉外面1-2层叶片和叶鞘，置于超净工作台上，用75%酒精消毒过的接种刀切除多余的叶片，保留5cm大小，放入0.1%氯化汞溶液中浸泡10min进行消毒，然后倒掉氯化汞消毒液，加入等量无菌水浸洗4次，浸洗时要时不时进行摇晃或搅拌，每次浸洗时间为4-5min，最后一次浸洗完后将水倒出，用消毒过的镊子将蔗芽夹出放在消过毒的接种碟上，在超净工作台上慢慢晾干水分，然后用消过毒的镊子和接种刀小心将蔗芽叶片一层层剥离，直到露出3-5mm的茎尖生长点，用锋利的消过毒的接种刀将茎尖切下接种到启动培养基（启动培养基的组成配方为：MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+糖30g/L+琼脂粉0.45%）中，于25℃自然散射光下培养，培养期间，前3次每5天更换一次新鲜的培养基，之后每10天更换一次新鲜的培养基，培养40-45天后形成丛生芽；

4）病原体检测：取适量步骤3）获得的丛生芽叶片，采用PCR技术进行病原菌检测，确定不带宿根矮化病和花叶病后，再将无毒丛生芽作为原种进行进一步的继代增殖；

5）继代增殖：将步骤4）检测后确定无毒的丛生芽在无菌条件下自然分成3-5株一丛，转接于分化培养基（分化培养基的组成配方为：MS+6-BA1.0mg/L+KT 0.1mg/L+糖30g/L+琼脂粉0.45%），在温度26±2℃、相对湿度60±5%、光照度1000~1500lx、光照时间12h/天条件下继代培养，约15天继代1次，继代次数一般控制在10代以内，增殖系数为4；

6）生根与炼苗：将步骤5）继代增殖所获得的5-10cm高的小苗在无菌条件下切除过长叶片，接种到生根培养基（生根培养基的组成配方为：1/2MS+NAA0.5 mg/L +IBA2.0 mg/L +MET1.0 mg/L +糖50g/L+琼脂粉0.45%）中，置于温度25±3℃、相对湿度60%-70%、自然光照条件下的炼苗棚（室）内边促根边炼苗；培育8天左右开始出根，约15-20天长出完整根系，且苗粗壮，叶色青绿；

7）假植移栽及管理：将步骤6）获得的生根组培苗从培养瓶或培养袋中取出，洗掉培养基，减去1/3~1/2的多余叶片，用0.2%多菌灵消毒后，自然分成3~5株为一丛，按照5cm×5cm株行距移栽到苗床上，淋足定根水，搭小拱棚用薄膜覆盖，外加遮阳网遮盖避免强光暴晒；假植5天后，新根系开始长出，叶片稍展开即喷施0.1%尿素和0.1%磷酸二氢钾混合溶液以促进小苗生长，其后每周施一次水肥，并注意适当剪叶和病虫害防治；待小苗返青后，逐渐揭去遮阳网和薄膜，使小苗进一步适应外界环境；20~30天后当密植苗长到5片真叶时，分单株进行上袋假植，其水肥管理同丛苗密植圃假植；经2-3个月上袋假植，假茎高15-20 cm时，出圃到一级圃进行扩繁。

Claims (5)

1.一种果蔗脱毒组培快繁的方法，其特征在于：包括如下步骤：

1）外植体的选择：选取品种纯正、长势健壮、无病害、蔗芽饱满植株，取中间蔗芽成熟而饱满的果蔗蔗茎将其砍成单芽段，用自来水洗净备用；

2）高温减毒处理：将步骤1）处理后的单芽段放入50℃恒温水箱中进行温热处理2h，捞起晾干，再将其种于预先经压力为1.1-1.2kg/cm²的高压蒸汽灭菌锅在121℃消毒30min的基质中，淋透水，然后置于38-40℃的人工气候箱中连续进行高温恒温催芽8-12天，期间喷水，保持基质湿润，每天换气2-3次，每次1-2min；待蔗芽长到6-10cm高时，取出作为下一步组培接种外植体；所述基质为椰糠与泥炭土按1︰1体积比均匀混合得到；

3）茎尖脱毒接种和无菌苗获得：将步骤2）处理得到的6-10cm高的蔗芽从基部小心切下，去掉外面1-2层叶片和叶鞘，置于超净工作台上，用75%酒精消毒过的接种刀切除多余的叶片，保留5cm大小，放入0.1%氯化汞溶液中浸泡8-12min进行消毒，然后倒掉氯化汞消毒液，加入等量无菌水浸洗3-4次，浸洗时要时不时进行摇晃或搅拌，每次浸洗时间为4-5min，最后一次浸洗完后将水倒出，用消毒过的镊子将蔗芽夹出放在消过毒的接种碟上，在超净工作台上慢慢晾干水分，然后用消过毒的镊子和接种刀小心将蔗芽叶片一层层剥离，直到露出3-5mm的茎尖生长点，用锋利的消过毒的接种刀将茎尖切下接种到启动培养基中，于25℃自然散射光下培养，培养期间，前2-3次每5-7天更换一次新鲜的培养基，之后每10-15天更换一次新鲜的培养基，40-45天后形成丛生芽；

4）病原体检测：取步骤3）获得的丛生芽叶片，采用PCR或RT-PCR技术进行病原菌检测，确定不带宿根矮化病和花叶病后，再将无病菌病毒的丛生芽作为原种进行进一步的继代增殖；

5）继代增殖：将步骤4）检测后确定无病菌病毒的丛生芽在无菌条件下自然分成单株或多株，转接于分化培养基，在温度26±2℃、相对湿度40%-70%、光照度1000~1500lx、光照时间10~12h/天条件下继代培养，15-20天继代1次，继代次数控制在10代以内，增殖系数为2-4；

6）生根与炼苗：将步骤5）继代增殖所获得的5-10cm高的小苗在无菌条件下切除过长叶片，接种到生根培养基中，置于温度25±3℃、相对湿度40%-70%、自然光照条件下的炼苗棚或炼苗室内边促根边炼苗；培育6-10天开始出根，15-20天长出完整根系，获得生根组培苗；

7）假植移栽及管理：将步骤6）获得的生根组培苗从培养瓶或培养袋中取出，洗掉培养基，减去1/3~1/2的多余叶片，用0.2%多菌灵消毒后，自然分成3~5株为一丛，按照5cm×5cm株行距移栽到苗床上，淋足定根水，搭小拱棚用薄膜覆盖，外加遮阳网遮盖避免强光暴晒；假植5天后，新根系开始长出，叶片稍展开即喷施0.1%尿素和0.1%磷酸二氢钾混合溶液以促进小苗生长，其后每周施一次水肥，并注意适当剪叶和病虫害防治；待小苗返青后，逐渐揭去遮阳网和薄膜，使小苗进一步适应外界环境；20~30天后当密植苗长到5片真叶时，分单株进行上袋假植，其水肥管理同丛苗密植圃假植；经2-3个月上袋假植，假茎高15-20 cm时出圃到一级圃进行扩繁。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤 3）中的启动培养基的配方组成为：MS+6-BA 0.5-1.5mg/L+NAA 0.1-0.3mg/L +糖30g/L+琼脂粉0.45%。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤 3）中，前2-3次每5-7天更换一次新鲜培养基，并在培养基中添加PVP 500mg/L，之后每10-15天更换一次新鲜的培养基，并在更换的新鲜培养基中添加PVP 200mg/L。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤 5）中的分化培养基的配方组成为：MS+6-BA 1.0-3.0mg/L +KT 0.1-0.5 mg/L+糖30g/L+琼脂粉0.45%。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤 6）中的生根培养基的配方组成为：1/2MS+NAA 0.5-1.0 mg/L +IBA 1.0-2.0 mg/L+MET 0.5-1.0 mg/L+糖50g/L+琼脂粉0.45%。