CN113170730A - 一种甘蔗脱毒苗生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种甘蔗脱毒苗生产方法。本发明方法在热水处理蔗种时应用建筑上使用的“防漏胶贴”贴封蔗芽，能很好地保护蔗芽免受热水伤害，蔗芽快速萌发，生势旺盛，又不影响热水对蔗茎中病原微生物的有效杀灭，蔗茎两端及催芽环境的微生物受到抑制或滋生速度大大减慢，容易分离到正常无污染的生长点外植体，微繁殖起动快，能快速形成丛生芽，繁殖系数高，容易操作，实用性强，成本低廉，节省试验材料。本发明对推动健康种苗在生产上的应用，促进甘蔗糖业的持续发展有重要作用。

Description

一种甘蔗脱毒苗生产方法

技术领域

本发明属于植物种苗组织培养快速繁殖技术领域，具体涉及一种甘蔗脱毒苗生产方法。

背景技术

甘蔗是中国最主要的糖料作物。在生产上，通常是收获时保留下的蔗梢做种，以种芽为繁殖体进行无性繁殖，种植多年后，由于多种病原物反复侵染且在植株内积累，使得病害病原物积累越来越严重，如甘蔗宿根矮化病、花叶病、白条病、凤梨病、黑穗病、霜霉病、病毒病等都是通过蔗茎种苗传播的，严重导致质量和产量不断下降，品种退化的现象，给甘蔗生产造成了严重的经济损失。随着对人们对植物病毒、病害的深入认识和植物组织培养技术的不断发展，植物脱毒技术应运而生。

甘蔗是应用脱毒技术最早的作物之一，据研究，种植经过组培脱毒繁殖起来的种苗——脱毒苗(健康种苗)，可使蔗产量增加20％～40％，蔗糖分提高0.5个百分点以上，宿根年限延长2～3年。在巴西、澳大利亚、美国等甘蔗主产国，种植脱毒健康种苗已经相当普遍。我国近二十年来也大力研究推广种植甘蔗脱毒种苗，有明显的提质增效作用，目前发展势头十分迅猛。研究表明，热水处理与组织培养技术相结合可以有效去除蔗茎种苗传播的甘蔗主要病害，达到脱毒效果。芽是甘蔗无性繁殖营养体，其对温度有一定的耐受性，但温度过高或持续时间过长均会导致蔗芽失去萌芽能力，但如果温度不够或时间不足，又达不到杀灭病原菌的效果。经过反复试验，50℃热水中浸泡2h或52℃浸泡30min是较好的工作参数。但由于不同的品种耐热性有所不同，周凌云等采用50℃、2h热水处理黑皮果蔗、黄皮果蔗和粤糖93-159双芽段种茎,结果显示：黑皮果蔗全部丧失出苗能力，黄皮果蔗出苗时间延迟,但最终出苗率与对照无差异；而粤糖93-159出苗率和出苗速度均不受影响。热水处理的再生苗生长早期株高和茎径均显著低于对照,但随着生长时间的增加,这种差异逐渐缩小。目前，甘蔗脱毒种苗微繁殖基本上都是从热水处理后长出的小芽中分离生长点作为外植体起动的，因此，热水处理后蔗芽的活力与脱毒种苗微繁殖成功与否密切相关。如果蔗芽活力低，出芽迟，生长慢，生长点离母茎近，加上催芽过程中母茎两端易长菌，很难分离到无污染的生长点外植体；如果蔗芽受热害严重就会丧失出苗能力，微繁殖起动就无从谈起。目前甘蔗脱毒种苗应用较广的是果蔗，而黑皮果蔗又占了果蔗种植面积的75％以上，但偏偏黑皮果蔗的耐热性较差，制约了脱毒种苗在生产上的推广应用。然而，如何保护蔗芽免受热水伤害，未见研究报道。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种贴封蔗芽避免热水伤害、快速起动微繁殖的甘蔗脱毒苗生产方法；在热水处理蔗种时，采用建筑上使用的“防漏胶贴”贴封蔗芽使其免受热水伤害，通过波尔多液处理抑制微生物的生长，容易分离到正常无污染的生长点外植体，外植体采用液体培养结合滤纸支撑，不易倒伏，能较好地维持生长所需的正常状态，具有出芽快、繁殖系数高、容易操作、成本低廉、节省试验材料的特点。

本发明的甘蔗脱毒苗生产方法，其特征在于，在甘蔗单芽蔗种热水浸泡脱毒前，先在蔗芽的表面上放置3-5层滤纸或草纸，将防漏胶贴贴在遮盖住蔗芽的滤纸或草纸及周边的蔗茎上，压紧边沿；然后再将蔗种用热水浸泡脱毒处理。

优选，所述的甘蔗脱毒苗生产方法，包括以下步骤：

a.将甘蔗茎砍成带单芽的蔗种，用水浸泡10-16h，冲洗干净后捞起晾干；

b.在蔗芽的表面上放置3-5层滤纸或草纸完全遮盖住蔗芽，将防漏胶贴贴在遮盖住蔗芽的滤纸或草纸及周边的蔗茎上，压紧边沿；

c.将贴好防漏胶贴的蔗种于52℃水浴30min，期间每隔3-5min翻动一下，然后取出蔗种；去除蔗芽外的防漏胶贴及滤纸或草纸后，将蔗芽置于波尔多液中浸泡10-20s后取出，晾干；

d.将晾干的蔗种的蔗茎轴向横置、芽点向上稳定放置于铺好的2-3层草纸或旧报纸上，光照培养；

e.当蔗芽长高至10-15cm时，取出蔗种，于无菌条件下，喷撒体积分数75％的乙醇水溶液后，用干净滤纸或草纸把种茎包3-5层并露出蔗芽及其基部，分离出生长点作为外植体；

f.将生长点接种至芽诱导培养基培养，利用支撑部件，使生长点基部浸没在培养基中、生长点其余部分露出培养基液面；每5-7天更换一次新的芽诱导培养基，直至形成丛芽；所述的芽诱导培养基，每升含有：6-BA 0.5-3.0mg、KT 0.5-1.5mg、TDZ 0.1-1.0mg和蔗糖30-40g，余量为MS培养基；

g.将丛芽接种在繁殖培养基中培养，每15-20天继代1次；所述的繁殖培养基，每升含有：6-BA 0.5-3.0mg、NAA 0.01-1.0mg和蔗糖30-40g，余量为MS培养基；

h.继代5-8次后，将丛芽转入促根培养基培养，当根长2-3cm时，炼苗，然后移栽；所述的促根培养基，每升含有：NAA 0.5-2.5mg、IBA 0.5-3.0mg和蔗糖40-80mg，余量为MS培养基。

优选，所述的甘蔗为黑皮果蔗、黄皮果蔗、粤糖93-159或新台糖22品种。

优选，所述的步骤b中放置的滤纸或草纸面积为0.5-0.8×0.8-1.5cm，贴的防漏胶贴面积为2.0-2.5×2.5-3.0cm，面积大于滤纸或草纸，且防漏胶贴每个边超出滤纸或草纸0.5-0.7cm宽。

优选，所述的步骤d的光照培养条件为：光照5000-8000LX，温度35℃-38℃，相对湿度60％-80％。

优选，所述的步骤e分离的生长点，其呈圆锥型，基部3-4mm，顶部直径1-2mm，长5-10mm。

优选，所述的步骤f-h中的组织培养条件为：光照2000-5000LX，温度27±2℃，相对湿度60％-80％。

优选，所述的步骤f的支撑部件是通过如下方式构建的：将滤纸折叠成两边高中间低，稳定放置在培养瓶中，加入灭菌的芽诱导培养基至在培养瓶中形成一定深度液层，将生长点接种在滤纸上的较低点，使生长点基部浸没在培养基中、生长点其余部分露出培养基液面。

本发明中的MS培养基是指没有加琼脂的液体培养基，其配方属于本领域的公知常识。

本发明的有益效果是：

在本发明中，用建筑上常用“防漏胶贴”贴封蔗芽避免热水伤害、快速起动微繁殖的甘蔗脱毒苗生产方法主要有以下几方面优点：

1.能很好地保护蔗芽免受热水伤害，蔗芽能快速萌发，又不影响热水对蔗茎中病原微生物的有效杀灭；

2.降低蔗茎两端及催芽环境的微生物滋生速度，容易分离到正常无污染的生长点外植体；

3.外植体生长快，容易产生丛生芽，繁殖系数高；

4.容易操作，实用性强，成本低廉，节省试验材料。

综上，本发明方法是一种不影响热水对蔗茎中病原微生物的杀灭，又能很好地保护蔗芽免受热水伤害，蔗芽能快速萌发，生势旺盛，容易分离到正常无污染的生长点外植体，微繁殖起动快，能快速形成丛生芽，繁殖系数高，容易操作，实用性强，成本低廉，节省试验材料，快速起动微繁殖的甘蔗脱毒苗生产方法。

附图说明

图1是热水处理、封芽后热水处理、不用热水处理(CK)3种情况，催芽7天后芽长的比较；

图2是Badila(黑皮果蔗)52℃热水处理30min后萌芽情况，受害严重；

图3是黄皮果蔗分离生长点之前芽的生长情况；

图4是分离的生长点放置于液体培养的瓶中滤纸上；

图5是培养分离的生长点形成的丛芽；

图6是甘蔗宿根矮化病PCR检测；其中，图中标号分别代表的样品为：1.Marker、2.阴性对照、3.阳性对照、4.黑皮果蔗CK、5.黄皮果蔗CK、6.粤糖93-159、7.新台糖22CK、8.黑皮果蔗CH、9.黄皮果蔗CH、10.粤糖93-159CH、11新台糖CH、12.黑皮果蔗CH、13.Marker、14.阴性对照、15.黑皮果蔗OH、16.黄皮果蔗OH、17.粤糖93-159OH、18.新台糖OH、19黑皮果蔗OH、20.黑皮果蔗CK、21.黄皮果蔗CK、22.粤糖93-159CK、23.新台糖CK、24.黄皮果蔗CK；注：CK为田间常规种苗，CH为常规种苗贴封芽后热水处理，OH为常规种苗不贴封芽就热水处理。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

以下实施例中所用的防漏胶贴为南京皇涂建材有限公司生产的爱宅牌防水补漏贴(常用于建筑上)，该防水补漏贴一面是防水金属膜，一面是沾胶，沾胶由丁基橡胶与聚异丁烯等为主要原料混合制成，且有粘结性高、防水性强、密封性好等优点。

实施例1：黄皮果蔗脱毒处理

(1)选用没有病虫害、生长旺盛的黄皮果蔗植株，选取上部饱满嫩芽，把蔗茎砍成带单芽的蔗种，用水浸泡12h，冲洗干净后捞起晾干。

(2)在蔗芽的表面上放置3层滤纸，撕去防漏胶贴的防粘膜后，将防漏胶贴贴在遮盖住蔗芽的滤纸及周边的蔗茎上，压紧边沿，防漏胶贴盖住的中心位置是蔗芽；其中，放置的滤纸面积为0.5-0.8×0.8-1.5cm，以能完全遮盖住蔗芽为准；贴的防漏胶贴面积为2.0-2.5×2.5-3.0cm，面积大于滤纸，且防漏胶贴每个边超出滤纸0.5-0.7cm宽，以使防漏胶贴的胶面能与蔗茎有足够的接触从而使防漏胶贴牢固的贴在蔗茎上。

(3)把贴好防漏胶贴的蔗种装入网袋中，当恒温水浴锅水温到达52℃后(然后保温在52℃)，把蔗种放入其中，每隔3-5min翻动一下；30min后把蔗种捞出，把蔗芽外的防漏胶贴及滤纸清除干净，然后置于波尔多液中浸泡20s后取出，晾干。

(4)在干净的塑料盒子内铺上3层草纸，将晾干的蔗种的蔗茎轴向横着紧密摆成一层，芽点向上。用透明保鲜膜封好盒子。把蔗种置于光照培养箱内培养，光照5000-8000LX，温度35℃-38℃，相对湿度60％-80％。

(5)当蔗芽长高至10-15cm时(图3)，选择生长正常、蔗茎无污染或污染较少的蔗种，在超净工作台，小心取出要分离生长点的蔗种，喷撒体积分数75％的乙醇水溶液后，用干净草纸把种茎包3层(防止微生物扩散)并露出嫩芽及其基部，用无菌的手术刀、攝子分离出生长点作为外植体，其呈圆锥型，基部3-4mm，顶部有一“尾巴”，直径1-2mm，长5-10mm。

(6)将滤纸折叠后(两边高中间低)放置在培养瓶中，加入灭菌的芽诱导培养基至在培养瓶中形成约1cm深度液层，使最上层滤纸最低点浸没在培养基液面下，将分离的生长点放置在滤纸上进行培养(图4)，其中生长点基部浸没在培养基中、生长点其余部分露出培养基液面。培养瓶置于培养箱中培养，光照2000-5000LX，温度27±2℃，相对湿度60％-80％。每5-7天更换一次新的芽诱导培养基，直至形成丛芽(图5)，形成丛芽后能够支撑不容易倒，之后可免用滤纸，按常规方式接种在繁殖培养基中进行快速繁殖，15-20天继代1次。继代5-8次后，转入促根培养基，当根长2-3cm时，打开瓶盖进行炼苗1-3天，取出小苗，把培养基冲洗干净，假植于苗床中。其中，所述的芽诱导培养基，每升含有：6-BA 1.5mg、KT 1mg、TDZ 0.5mg和蔗糖35g，余量为MS培养基；所述的繁殖培养基，每升含有：6-BA 1mg、NAA0.5mg和蔗糖35g，余量为MS培养基；所述的促根培养基，每升含有：NAA 1.5mg、IBA 1mg和蔗糖60mg，余量为MS培养基。

液体培养在营养吸收、代谢废物扩散方面效率高，比较适合甘蔗快繁，但容易倒伏，因此，形成丛芽后才能较好解决倒伏问题，而且有时还需适当借助培养瓶的壁来支撑。

实施例2：黑皮果蔗(Badila)脱毒处理

(1)选用没有病虫害、生长旺盛的黑皮果蔗(Badila)植株，选取上部饱满嫩芽，把蔗茎砍成带单芽的蔗种，用水浸泡16h，冲洗干净后捞起晾干。

(2)在蔗芽的表面上放置5层滤纸，撕去防漏胶贴的防粘膜后，将防漏胶贴贴在遮盖住蔗芽的滤纸及周边的蔗茎上，压紧边沿，防漏胶贴盖住的中心位置是蔗芽；其中，放置的滤纸面积为0.5-0.8×0.8-1.5cm，以能完全遮盖住蔗芽为准；贴的防漏胶贴面积为2.0-2.5×2.5-3.0cm，面积大于滤纸，且防漏胶贴每个边超出滤纸0.5-0.7cm宽，以使防漏胶贴的胶面能与蔗茎有足够的接触从而使防漏胶贴牢固的贴在蔗茎上。

(3)把贴好防漏胶贴的蔗种装入网袋中，当恒温水浴锅水温到达52℃后(然后保温在52℃)，把蔗种放入其中，每隔3-5min翻动一下；30min后把蔗种捞出，把蔗芽外的防漏胶贴及滤纸清除干净，然后置于波尔多液中浸泡15s后取出，晾干。

(4)在干净的塑料盒子内铺上3层旧报纸，将晾干的蔗种的蔗茎轴向横着紧密摆成一层，芽点向上。用透明保鲜膜封好盒子。把蔗种置于光照培养箱内培养，光照5000-8000LX，温度35℃-38℃，相对湿度60％-80％。

(5)当蔗芽长高至10-15cm时，选择生长正常、蔗茎无污染或污染较少的蔗种，在超净工作台，小心取出要分离生长点的蔗种，喷撒体积分数75％的乙醇水溶液后，用干净草纸把种茎包5层(防止微生物扩散)并露出嫩芽基部，用无菌的手术刀、攝子分离出生长点作为外植体，其呈圆锥型，基部3-4mm，顶部有一“尾巴”，直径1-2mm，长5-10mm。

(6)将滤纸折叠后(两边高中间低)放置在培养瓶中，加入灭菌的芽诱导培养基至在培养瓶中形成约1cm深度液层，使最上层滤纸最低点浸没在培养基液面下，将分离的生长点放置在滤纸上进行培养，其中生长点基部浸没在培养基中、生长点其余部分露出培养基液面。培养瓶置于培养箱中培养，光照2000-5000LX，温度27±2℃，相对湿度60％-80％。每5-7天更换一次新的芽诱导培养基，直至形成丛芽(能够支撑不容易倒)；之后可免用滤纸，按常规方式接种在繁殖培养基中进行快速繁殖，15-20天继代1次。继代5-8次后，转入促根培养基，当根长2-3cm时，打开瓶盖进行炼苗1-3天，取出小苗，把培养基冲洗干净，假植于苗床中。其中，所述的芽诱导培养基，每升含有：6-BA 1.5mg、KT1 mg、TDZ 0.5mg和蔗糖35g，余量为MS培养基；所述的繁殖培养基，每升含有：6-BA 2mg、NAA 0.5mg和蔗糖35g，余量为MS培养基；所述的促根培养基，每升含有：NAA 1.5mg、IBA 2mg和蔗糖60mg，余量为MS培养基。

实施例3：粤糖93-159脱毒处理

(1)选用没有病虫害、生长旺盛的粤糖93-159植株，选取上部饱满嫩芽，把蔗茎砍成带单芽的蔗种，用水浸泡10h，冲洗干净后捞起晾干。

(2)在蔗芽的表面上放置5层滤纸，撕去防漏胶贴的防粘膜后，将防漏胶贴贴在遮盖住蔗芽的滤纸及周边的蔗茎上，压紧边沿，防漏胶贴盖住的中心位置是蔗芽；其中，放置的滤纸面积为0.5-0.8×0.8-1.5cm，以能完全遮盖住蔗芽为准；贴的防漏胶贴面积为2.0-2.5×2.5-3.0cm，面积大于滤纸，且防漏胶贴每个边超出滤纸0.5-0.7cm宽，以使防漏胶贴的胶面能与蔗茎有足够的接触从而使防漏胶贴牢固的贴在蔗茎上。

(3)把贴好防漏胶贴的蔗种装入网袋中，当恒温水浴锅水温到达52℃后(然后保温在52℃)，把蔗种放入其中，每隔3-5min翻动一下；30min后把蔗种捞出，把蔗芽外的防漏胶贴及滤纸清除干净，然后置于波尔多液中浸泡10s后取出，晾干。

(4)在干净的塑料盒子内铺上2层草纸，将晾干的蔗种的蔗茎轴向横着紧密摆成一层，芽点向上。用透明保鲜膜封好盒子。把蔗种置于光照培养箱内培养，光照5000-8000LX，温度35℃-38℃，相对湿度60％-80％。

(5)当蔗芽长高至10-15cm时，选择生长正常、蔗茎无污染或污染较少的蔗种，在超净工作台，小心取出要分离生长点的蔗种，喷撒体积分数75％的乙醇水溶液后，用干净草纸把种茎包3层(防止微生物扩散)并露出嫩芽基部，用无菌的手术刀、攝子分离出生长点作为外植体，其呈圆锥型，基部3-4mm，顶部有一“尾巴”，直径1-2mm，长5-10mm。

(6)将滤纸折叠后(两边高中间低)放置在培养瓶中，加入灭菌的芽诱导培养基至在培养瓶中形成约1cm深度液层，使最上层滤纸最低点浸没在培养基液面下，将分离的生长点放置在滤纸上进行培养，其中生长点基部浸没在培养基中、生长点其余部分露出培养基液面。培养瓶置于培养箱中培养，光照2000-5000LX，温度27±2℃，相对湿度60％-80％。每5-7天更换一次新的芽诱导培养基，直至形成丛芽(能够支撑不容易倒)；之后可免用滤纸，按常规方式接种在繁殖培养基中进行快速繁殖，15-20天继代1次。继代5-8次后，转入促根培养基，当根长2-3cm时，打开瓶盖进行炼苗1-3天，取出小苗，把培养基冲洗干净，假植于苗床中。其中，所述的芽诱导培养基，每升含有：6-BA 0.5mg、KT 0.5mg、TDZ 0.1mg和蔗糖30g，余量为MS培养基；所述的繁殖培养基，每升含有：6-BA 0.5mg、NAA 0.01mg和蔗糖30g，余量为MS培养基；所述的促根培养基，每升含有：NAA 0.5mg、IBA 0.5mg和蔗糖40mg，余量为MS培养基。

实施例4：新台糖22脱毒处理

(1)选用没有病虫害、生长旺盛的新台糖22植株，选取上部饱满嫩芽，把蔗茎砍成带单芽的蔗种，用水浸泡16h，冲洗干净后捞起晾干。

(2)在蔗芽的表面上放置3层草纸，撕去防漏胶贴的防粘膜后，将防漏胶贴贴在遮盖住蔗芽的草纸及周边的蔗茎上，压紧边沿，防漏胶贴盖住的中心位置是蔗芽；其中，放置的草纸面积为0.5-0.8×0.8-1.5cm，以能完全遮盖住蔗芽为准；贴的防漏胶贴面积为2.0-2.5×2.5-3.0cm，面积大于草纸，且防漏胶贴每个边超出草纸0.5-0.7cm宽，以使防漏胶贴的胶面能与蔗茎有足够的接触从而使防漏胶贴牢固的贴在蔗茎上。

(3)把贴好防漏胶贴的蔗种装入网袋中，当恒温水浴锅水温到达52℃后(然后保温在52℃)，把蔗种放入其中，每隔3-5min翻动一下；30min后把蔗种捞出，把蔗芽外的防漏胶贴及草纸清除干净，然后置于波尔多液中浸泡20s后取出，晾干。

(4)在干净的塑料盒子内铺上3层草纸，将晾干的蔗种的蔗茎轴向横着紧密摆成一层，芽点向上。用透明保鲜膜封好盒子。把蔗种置于光照培养箱内培养，光照5000-8000LX，温度35℃-38℃，相对湿度60％-80％。

(5)当蔗芽长高至10-15cm时，选择生长正常、蔗茎无污染或污染较少的蔗种，在超净工作台，小心取出要分离生长点的蔗种，喷撒体积分数75％的乙醇水溶液后，用干净草纸把种茎包5层(防止微生物扩散)并露出嫩芽基部，用无菌的手术刀、攝子分离出生长点作为外植体，其呈圆锥型，基部3-4mm，顶部有一“尾巴”，直径1-2mm，长5-10mm。

(6)将滤纸折叠后(两边高中间低)放置在培养瓶中，加入灭菌的芽诱导培养基至在培养瓶中形成约1cm深度液层，使最上层滤纸最低点浸没在培养基液面下，将分离的生长点放置在滤纸上进行培养，其中生长点基部浸没在培养基中、生长点其余部分露出培养基液面。培养瓶置于培养室中培养，光照2000-5000LX，温度27±2℃，相对湿度60％-80％。每5-7天更换一次新的芽诱导培养基，直至形成丛芽(能够支撑不容易倒)；之后可免用滤纸，按常规方式接种在繁殖培养基中进行快速繁殖，15-20天继代1次。继代5-8次后，转入促根培养基，当根长2-3cm时，打开瓶盖进行炼苗1-3天，取出小苗，把培养基冲洗干净，假植于苗床中。其中，所述的芽诱导培养基，每升含有：6-BA 3.0mg、KT 1.5mg、TDZ 1.0mg和蔗糖40g，余量为MS培养基；所述的繁殖培养基，每升含有：6-BA 3.0mg、NAA 1.0mg和蔗糖40g，余量为MS培养基；所述的促根培养基，每升含有：NAA 2.5mg、IBA 3.0mg和蔗糖80mg，余量为MS培养基。

热水处理时贴封蔗芽对蔗芽的保护及脱毒效果比较

1.对蔗芽的保护

采用防漏胶贴贴封蔗芽，52℃热水处理30min，然后进行催芽试验(对应为实施例1-实施例4中的处理材料和方法)，通过蔗芽的萌发及生长速度计算出热水处理伤害率，从而得出热水处理对不同甘蔗品种的伤害程度以及贴封蔗芽对保护蔗芽、避免热水伤害的作用。结果如表1所示，蔗芽生长情况如图1所示；其中对照(CK)是不进行任何处理、自然生长(光照5000-8000LX，温度29±1℃，湿度60％-80％)7天后蔗芽长度的平均值，贴封蔗芽后热水处理(52℃30min)即分别对应为实施例1-实施例4的处理材料和方法，不贴封蔗芽直接热水处理即对应于实施例1-实施例4中缺少步骤(2)贴封防漏胶贴步骤，直接将蔗芽置于52℃热水处理30min的方法。

表1热水处理对贴封蔗芽和不贴封蔗芽芽的伤害程度比较

注：1.52℃热水处理30min；2.伤害率＝(对照芽长-处理芽长)/对照芽长×100％；

3.处理和对照蔗芽的长度数值为：活力大致相同的20个芽催芽7天后长度的平

均值。

从表1可以看出，不贴封蔗芽、按常规方法对甘蔗茎芽进行热水处理(52℃30min)，4个品种受伤害程度相差很大，伤害最大的是黑皮果蔗(Badila)达到68.42％(图2)，最小的为新台糖22，只有4.44％，伤害率平均值为31.22％。但采用本发明的方法贴封蔗芽后，再进行热水处理，贴封蔗芽对不同品种都有很好的保护作用，4个品种的伤害率均为0。

2.脱毒效果

上述试验表明，贴封蔗芽可有效避免热水对蔗芽的伤害，对蔗芽有很好的保护作用。但是，贴封蔗芽否会影响到脱毒效果呢？热水处理可以杀灭或钝化甘蔗种茎内多种致病微生物，目前应用最多，研究较为深入的是去除甘蔗宿根矮化病。本发明就以宿根矮化病作为指标，检验贴封蔗芽是否会影响到脱毒效果。图6显示，蔗区大田采集的4个甘蔗品种，种茎没经热水处理长出的植株，提取其蔗汁DNA应用甘蔗宿根矮化病特异引物进行扩增，都出现明显的分子量为265bp特异扩增条带，表明都携带宿根矮化病菌。而种茎经过52℃热水处理30min，不管是不贴封蔗芽或者是贴封蔗芽处理样本长出的植株，其蔗汁DNA都检测不到宿根矮化病菌的存在，这说明热水处理能很好去除宿根矮化病，且贴封蔗芽不会影响热水脱毒效果。

Claims (8)

1.一种甘蔗脱毒苗生产方法，其特征在于，在甘蔗单芽蔗种热水浸泡脱毒前，先在蔗芽的表面上放置3-5层滤纸或草纸，将防漏胶贴贴在遮盖住蔗芽的滤纸或草纸及周边的蔗茎上，压紧边沿；然后再将蔗种用热水浸泡脱毒处理。

2.根据权利要求1所述的甘蔗脱毒苗生产方法，其特征在于，包括以下步骤：

a.将甘蔗茎砍成带单芽的蔗种，用水浸泡10-16h，冲洗干净后捞起晾干；

b.在蔗芽的表面上放置3-5层滤纸或草纸完全遮盖住蔗芽，将防漏胶贴贴在遮盖住蔗芽的滤纸或草纸及周边的蔗茎上，压紧边沿；

c.将贴好防漏胶贴的蔗种于52℃水浴30min，期间每隔3-5min翻动一下，然后取出蔗种；去除蔗芽外的防漏胶贴及滤纸或草纸后，将蔗芽置于波尔多液中浸泡10-20s后取出，晾干；

d.将晾干的蔗种的蔗茎轴向横置、芽点向上稳定放置于铺好的2-3层草纸或旧报纸上，光照培养；

e.当蔗芽长高至10-15cm时，取出蔗种，于无菌条件下，喷撒体积分数75％的乙醇水溶液后，用干净滤纸或草纸把种茎包3-5层并露出蔗芽及其基部，分离出生长点作为外植体；

f.将生长点接种至芽诱导培养基培养，利用支撑部件，使生长点基部浸没在培养基中、生长点其余部分露出培养基液面；每5-7天更换一次新的芽诱导培养基，直至形成丛芽；所述的芽诱导培养基，每升含有：6-BA 0.5-3.0mg、KT 0.5-1.5mg、TDZ 0.1-1.0mg和蔗糖30-40g，余量为MS培养基；

g.将丛芽接种在繁殖培养基中培养，每15-20天继代1次；所述的繁殖培养基，每升含有：6-BA 0.5-3.0mg、NAA 0.01-1.0mg和蔗糖30-40g，余量为MS培养基；

h.继代5-8次后，将丛芽转入促根培养基培养，当根长2-3cm时，炼苗，然后移栽；所述的促根培养基，每升含有：NAA 0.5-2.5mg、IBA 0.5-3.0mg和蔗糖40-80mg，余量为MS培养基。

3.根据权利要求1所述的甘蔗脱毒苗生产方法，其特征在于，所述的甘蔗为黑皮果蔗、黄皮果蔗、粤糖93-159或新台糖22品种。

4.根据权利要求2所述的甘蔗脱毒苗生产方法，其特征在于，所述的步骤b中放置的滤纸或草纸面积为0.5-0.8×0.8-1.5cm，贴的防漏胶贴面积为2.0-2.5×2.5-3.0cm，面积大于滤纸或草纸，且防漏胶贴每个边超出滤纸或草纸0.5-0.7cm宽。

5.根据权利要求1所述的甘蔗脱毒苗生产方法，其特征在于，所述的步骤d的光照培养条件为：光照5000-8000LX，温度35℃-38℃，相对湿度60％-80％。

6.根据权利要求1所述的甘蔗脱毒苗生产方法，其特征在于，所述的步骤e分离的生长点，其呈圆锥型，基部3-4mm，顶部直径1-2mm，长5-10mm。

7.根据权利要求1所述的甘蔗脱毒苗生产方法，其特征在于，所述的步骤f-h中的组织培养条件为：光照2000-5000LX，温度27±2℃，相对湿度60％-80％。

8.根据权利要求1所述的甘蔗脱毒苗生产方法，其特征在于，所述的步骤f的支撑部件是通过如下方式构建的：将滤纸折叠成两边高中间低，稳定放置在培养瓶中，加入灭菌的芽诱导培养基至在培养瓶中形成一定深度液层，将生长点接种在滤纸上的较低点，使生长点基部浸没在培养基中、生长点其余部分露出培养基液面。

Images