CN1930951B - 一种生姜脱毒苗的培育方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属农业高新技术领域的一种生姜脱毒苗的培育方法，其特征在于：将生姜幼芽剥离至1～2个叶原基后，接种于附加KT2.0～2.5mg/L、NAA0.25～0.30mg/L、蔗糖25g/L、pH6.5的MS培养基上，培养30～35d，可获得生姜离体茎尖再生植株试管苗；剪取试管苗茎叶进行病毒检测，对未带毒者重新接种到新的附加KT2.5～3.0mg/L、NAA0.30～0.40mg/L的MS快繁培养基上，培养40～50d后即可获得脱毒试管苗；将快繁的试管苗转接于附加NAA0.50～1.0mg/L的MS生根培养基培养40～50 d后，即可培养成根、茎、叶完整的生姜脱毒苗。
Description
一、技术领域
本技术发明是一种涉及生姜脱毒苗的生产技术方法，专用于生姜脱毒苗的培育与快速繁殖，属农业高新技术领域。
二、背景技术
生姜(Zingiber officiale Roscoe)为我国主要出口创汇蔬菜之，是以根状茎为产品器官和繁殖器官的无性繁殖作物，由于其生长发育未经有性世代，病毒易在体内积累，导致生长势衰退，种性退化，抗逆性降低，病虫害加重，产量品质下降，严重制约了生姜产品在国际市场的竞争力。因此，培育生姜脱毒苗，恢复生姜种性，是提高生姜产量，改善生姜品质的重要技术措施之一。
目前，利用茎尖分生组织培养脱毒种苗，已广泛应用于马铃薯、大蒜等无性繁殖作物。中国专利CN 1031637A“大量生产无类病毒和病毒马铃薯繁殖材料的方法”，介绍了利用马铃薯茎尖组织进行体外培养诱导生根，或诱导微型块茎的生产方法。中国专利CN 1043718C“马铃薯脱毒微型种薯生产技术”介绍了一种马铃薯脱毒种薯的生产方法，该方法包括脱毒试管苗的培养与选择，扦插苗培养及选择，基质选择和药剂处理，田间栽培管理措施等。中国专利CN1090901C“一种大蒜脱毒种苗繁殖的方法”介绍了利用未熟蒜薹为外植体，通过对不同培养基、培养时间的选择以及糖、激素等配比的改变等，获得了大量脱毒大蒜试管苗。但目前关于生姜脱毒苗培育的方法尚未见报道。
三、发明内容
本发明的目的是提供一种可在生产中推广应用的生姜脱毒苗的培育方法。
本发明是这样实现的，方法中具有马铃薯等无性繁殖作物脱毒苗的生产方法，其特征在于：
a、脱毒生姜试管苗的获得：取一般生姜根茎萌发的幼芽，剥离至仅剩1～2个叶原基后，接种于附加KT 2.0～2.5mg/L、NAA 0.25～0.30mg/L、蔗糖25g/L、pH 6.5的MS培养基上，培养30～35d，可获得生姜离体茎尖再生植株试管苗，剪取试管苗茎叶进行病毒检测，对未带毒丛生试管苗基部按单芽分割后，重新转接新的培养瓶进行继代培养，即可获得脱毒的生姜试管苗；
b、脱毒生姜试管苗快繁：将获得的脱毒生姜试管苗剪取茎叶后，对试管苗基部按单芽分割，重新接种到新的附加KT 2.5～3.0mg/L、NAA 0.30～0.40mg/L、蔗糖25g/L、pH 6.5的MS快繁培养基上进行培养，40～50d后即可获得大量脱毒生姜试管苗；
c、脱毒生姜试管苗生根培养：将快繁的脱毒生姜试管苗基部按单芽分割后，转接于附加NAA 0.50～1.0mg/L、蔗糖25g/L、pH 6.5的MS生根培养基培养40～50d后，即可培养成根、茎、叶完整的生姜脱毒苗。
本方法各阶段培养条件为温度20～28℃、光照12h/d、光强2000～4000lx。
由于本发明是一套完整的生姜脱毒苗的培育方法，实践证明可很好的在生产实践中推广应用，所以实施后可产生比较积极的效果。
四、具体实施方式
本发明包含了从生姜试管苗培养、病毒检测、脱毒试管苗快繁到脱毒生姜试管苗生根培养全过程的完整配套技术，可在生产实践中推广应用。具体实施时的基本步骤为：
a、脱毒生姜试管苗的获得：取一般生姜根茎萌发的幼芽，剥离至仅剩1～2个叶原基后，接种于附加KT 2.0～2.5mg/L、NAA 0.25～0.30mg/L、蔗糖25g/L、pH 6.5的MS培养基上，培养30～35d，可获得生姜离体茎尖再生植株试管苗，剪取试管苗茎叶进行病毒检测，对未带毒丛生试管苗基部按单芽分割后，重新转接新的培养瓶进行继代培养，即可获得脱毒的生姜试管苗；
b、脱毒生姜试管苗快繁：将获得的脱毒生姜试管苗剪取茎叶后，对试管苗基部按单芽分割，重新接种到新的附加KT 2.5～3.0mg/L、NAA 0.30～0.40mg/L、蔗糖25g/L、pH 6.5的MS快繁培养基上进行培养，40～50d后即可获得大量脱毒生姜试管苗；
c、脱毒生姜试管苗生根培养：将快繁的脱毒生姜试管苗基部按单芽分割后，转接于附加NAA 0.50～1.0mg/L、蔗糖25g/L、pH 6.5的MS生根培养基培养40～50d后，即可培养成根、茎、叶完整的生姜脱毒苗。
各培养基的卡拉胶含量为4～5g/L，pH 6.5，各阶段培养条件为温度20～28℃、光照12h/d、光强2000～4000lx。
进一步说，在具体实施的过程中还应注意如下几点：
1.生姜幼芽的培养：取一般生姜根茎用清水洗净后，以500倍50％多菌灵溶液浸泡30min，捞出生姜根茎，置散射光条件下晾干，埋于室内用清水淘洗的湿沙内，保持环境温度22～28℃。经过25d左右，生姜根茎幼芽萌发至1cm左右，取下备用。
2.生姜离体茎尖初代培养：将取下的生姜根茎幼芽，以70％乙醇或0.1％升汞消毒后，在立体解剖镜下剥离至仅剩1～2个叶原基，接种于附加KT 2.0～2.5mg/L、NAA 0.25～0.30mg/L、蔗糖25g/L、pH 6.5的MS培养基上进行培养，培养条件为温度20～28℃、光照12h/d、光强2000～4000lx，培养30～35d，即可获得株高5～7cm的离体再生植株试管苗。
3.生姜试管苗病毒检测：取生姜离体茎尖再生植株试管苗，剪下茎叶，将其置于消毒研钵中，加入适量缓冲液(PBS 0.05M、pH 7.0，含0.1％巯基乙醇)研磨，用常规方法接种于栽培在消毒土中的心叶烟(Nicotiana qilutinosa)、曼陀罗(Datura stramonium)、苋色藜(Chenopdium amaranticolor)等寄主上，置于防虫网室或温室内培养，经3～4d后观察记录。若发现有系统花叶、局部枯斑、褪绿斑等病毒侵染症状，表明试管苗带毒，该类生姜试管苗应淘汰；若无异常生长表现，则表明生姜试管苗未被病毒侵染，该类试管苗即为生姜脱毒苗，保存备用。
4.生姜脱毒试管苗的继代培养与快繁：将生姜脱毒试管苗按基部单芽进行分割后，重新接种到新的附加KT 2.5～3.0mg/L、NAA 0.30～0.40mg/L、蔗糖25g/L、pH 6.5的MS快繁培养基上进行继代培养，培养条件为温度20～28℃、光照12h/d、光强2000～4000lx，培养40～50d后即可长出大量丛生脱毒生姜试管苗。将其茎叶剪除后，再次分割基部单芽，进行重新接种。如此往复进行，即可获得大量脱毒生姜试管苗。
5.生姜脱毒试管苗的生根培养：将继代培养获得的生姜丛生试管苗，剪除茎叶，按单芽分割后，转接于附加NAA0.50～1.0mg/L、蔗糖25g/L、pH 6.5的MS生根培养基培养，培养条件为温度20～28℃、光照12h/d、光强2000～4000lx。一般经过40～50d后，即可获得株高7～8cm、且具有良好根系的脱毒生姜试管苗。
下面，通过3个实施例，来进一步说明具体的实施过程。
实施例1
1.生姜离体茎尖培养再生植株的获得：将‘莱芜大姜’姜块用清水洗净，然后在500倍50％多菌灵溶液中浸泡30min，埋于清水洗净的湿沙中，置于温度22～28℃的室内催芽25d后，取长度1.2cm左右的姜芽，以70％乙醇消毒30min后，再用0.1％升汞灭菌4min，用无菌水冲洗5次，然后在立体解剖镜下，将姜芽剥离至仅剩1～2个叶原基，单芽接种于附加KT 2.0mg/L、NAA 0.25mg/L、蔗糖25g/L、pH 6.5的MS培养基上，共接种100瓶。培养条件为温度26±2℃、光照12h/d、光强4000lx。培养35d后，获得株高5～6cm的离体再生植株86瓶，单瓶平均苗茎数5.7个。
2.生姜试管苗病毒检测与脱毒苗的获得：单株剪取离体再生植株试管苗茎叶，将其置于消毒研钵中，加入5ml缓冲液(PBS 0.05M、pH 7.0，含0.1％巯基乙醇)研磨，静置10min后，取上清液接种于栽培在消毒土中的心叶烟(Nicotiana qilutinosa)、曼陀罗(Datura stramonium)植株叶片上，置于防虫网室或温室内培养，经4d后观察，结果发现，获得的86瓶生姜试管苗，有18瓶植株带毒，予以淘汰，68瓶未发现病毒，即为脱毒生姜试管苗。
3.脱毒生姜试管苗继代培养与快繁：利用剪除茎叶的脱毒生姜试管苗基部，按单芽(株)进行分割后，转接于附加KT 2.5mg/L、NAA 0.40mg/L、蔗糖25g/L、pH 6.5的MS快繁培养基上进行培养，每瓶接种4～5芽(株)，培养条件为温度24～28℃、光照12h/d、光强4000lx。45d后有效繁殖系数平均达6.2。之后，按以上方法连续转接3次，植株再生能力基本没有衰退，并获得了10000余株脱毒生姜试管苗。
4.脱毒生姜试管苗生根培养：将快繁的脱毒生姜试管苗剪除茎叶，按单芽(株)分割基部，转接于附加NAA 1.0mg/L、蔗糖25g/L、pH 6.5的MS生根培养基培养生根，每瓶接种4～5芽(株)。培养条件为温度24～28℃、光照12h/d、光强4000lx。生姜试管苗在生根培养基培养45d后，幼苗平均株高达7.6cm，根长达2～3cm。
实施例2
1.生姜离体茎尖初代培养：取生姜根茎萌发的1cm左右的幼芽，以0.1％升汞消毒后，在立体解剖镜下剥离至仅剩1～2个叶原基，接种于附加KT 2.5mg/L、NAA 0.30mg/L、蔗糖25g/L、pH 6.5的MS培养基上进行培养，培养条件为温度20～28℃、光照12h/d、光强2000lx，培养35d，获得株高5～7cm的离体再生植株试管苗。
3.生姜试管苗病毒检测：取生姜离体茎尖再生植株试管苗，剪下茎叶，将其置于消毒研钵中，加入适量缓冲液(PBS 0.05M、pH 7.0，含0.1％巯基乙醇)研磨，用常规方法接种于栽培在消毒土中的心叶烟(Nicotiana qilutinosa)上，置于防虫网室或温室内培养，经4d后观察记录，淘汰导致心叶烟出现系统花叶、局部枯斑、褪绿斑等病毒侵染症状的试管苗，保留无异常生长表现的生姜试管苗。
4.生姜脱毒试管苗的继代培养与快繁：将生姜脱毒试管苗按基部单芽进行分割后，重新接种到新的附加KT 3.0mg/L、NAA 0.40mg/L、蔗糖25g/L、pH 6.5的MS快繁培养基上进行继代培养，培养条件为温度20～28℃、光照12h/d、光强3000lx，培养45d后即可长出大量丛生脱毒生姜试管苗。将其茎叶剪除后，再次分割基部单芽，进行重新接种。如此往复进行，即可获得大量脱毒生姜试管苗。
5.生姜脱毒试管苗的生根培养：将继代培养获得的生姜丛生试管苗，剪除茎叶，按单芽分割后，转接于附加NAA1.0mg/L、蔗糖25g/L、pH 6.5的MS生根培养基培养，培养条件为温度20～28℃、光照12h/d、光强4000lx。经过40d后，即可获得株高7～8cm、且具有良好根系的脱毒生姜试管苗。
实施例3
1.脱毒生姜试管苗的获得：取一般生姜根茎萌发的幼芽，剥离至仅剩1～2个叶原基后，接种于附加KT 2.0mg/L、NAA 0.30mg/L、蔗糖25g/L、pH 6.5的MS培养基上，培养条件为温度22～28℃、光照12h/d、光强4000lx。培养35d，可获得生姜离体茎尖再生植株试管苗，剪取试管苗茎叶进行病毒检测，对未带毒丛生试管苗基部按单芽分割后，重新转接新的培养瓶进行继代培养，即可获得脱毒的生姜试管苗；
2.脱毒生姜试管苗快繁：将获得的脱毒生姜试管苗剪取茎叶后，对试管苗基部按单芽分割，重新接种到新的附加KT 2.5mg/L、NAA 0.35mg/L、蔗糖25g/L、pH 6.5的MS快繁培养基上进行培养，培养条件为温度22～28℃、光照12h/d、光强4000lx，40d后即可获得大量脱毒生姜试管苗；
3.脱毒生姜试管苗生根培养：将快繁的脱毒生姜试管苗基部按单芽分割后，转接于附加NAA 0.50mg/L、蔗糖25g/L、pH 6.5的MS生根培养基上，培养条件为温度22～28℃、光照12h/d、光强4000lx。培养40d后，即可培养成根、茎、叶完整的生姜脱毒苗。
Claims (2)
1.一种生姜脱毒苗的培育方法，其特征在于：
a、脱毒生姜试管苗的获得：取生姜根茎萌发的幼芽，剥离至仅剩1～2个叶原基后，接种于附加KT 2.0～2.5mg/L、NAA 0.25～0.30mg/L、蔗糖25g/L、pH 6.5的MS培养基上，培养30～35d，则获得生姜离体茎尖再生植株试管苗，剪取试管苗茎叶进行病毒检测，对未带毒丛生试管苗基部按单芽分割后，重新转接新的培养瓶进行继代培养，便获得脱毒的生姜试管苗；
b、脱毒生姜试管苗快繁：将获得的脱毒生姜试管苗剪取茎叶后，对试管苗基部按单芽分割，重新接种到新的附加KT 2.5～3.0mg/L、NAA 0.30～0.40mg/L、蔗糖25g/L、pH 6.5的MS快繁培养基上进行培养，40～50d后便获得大量脱毒生姜试管苗；
c、脱毒生姜试管苗生根培养：将快繁的脱毒生姜试管苗基部按单芽分割后，转接于附加NAA 0.50～1.0mg/L、蔗糖25g/L、pH 6.5的MS生根培养基培养40～50d后，便培养成根、茎、叶完整的生姜脱毒苗。
2.根据权利要求1所述的一种生姜脱毒苗的培育方法，其特征在于：各培养基的卡拉胶含量为4～5g/L，各阶段培养条件为温度20～28℃、光照12h/d、光强2000～40001x。
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