CN101347098B - 南京椴组织培养繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
本发明为南京椴(Tilia miquelianaMaxim)组织培养繁殖方法，属于木本植物种苗无性繁殖的技术领域。本发明旨在解决南京椴在种子育苗(种子发芽率低、休眠期长)和扦插繁殖都十分困难的情况下的育苗难题。本发明以不同年龄椴的带腋芽茎段为外植体分别接于诱导培养基上，根据芽诱导结果选择最佳外植体；以不同的消毒方法比较污染率选择最佳消毒方法；以L9(3 3)正交试验设计分别筛选最佳芽诱导、继代增值培养基；以继代培养基为基础调整激素水平设计12种培养基，根据生根情况筛选最佳生根壮苗培养基。通过以上实验，优化得到最佳南京椴组织培养繁殖方法。
Description
一、技术领域
本发明为南京椴组织培养繁殖方法，属于木本植物种苗繁殖的技术领域。
二、背景技术
南京椴(Tilia miqueliana Maxim)属椴树科、椴树属(Tilia)落叶乔木，既是优良的用材树种和重要的蜜源植物，又是集观树形、树姿、树干、叶片、花及花序为一身的优良园林观赏树种，可用作行道树、庭荫树、小区绿化的骨干树种等。目前南京椴野生种群非常少，且自然更新能力差，在群落中处去衰落种群。相关研究表明南京椴的种子繁殖和扦插繁殖十分困难，因此南京椴资源非常缺乏。
木本植物组织培养研究起步于20世纪50年代初，直到70年代后期才得到较大的发展。目前，不完全统计有90多属300多种木本植物经组织培养获得再生植株。关于椴树属植物组织培养的研究，最早的报道是Barker从美洲椴的不同组织中诱导出愈伤组织；Chalupa利用心叶椴幼树腋芽首次获得分化芽；日本人尹阳等先后开展心叶椴和紫椴的组织培养，并获得成功。我国的吕校石等研究了椴树组织培养中污染控制技术，得到较好的控制污染的方法；王彦彬等和张亚量、徐妙珍等筛选出紫椴芽芽分化的最佳培养基；陈罡等研究得到日本椴的组织培养和快速繁殖中最佳芽诱导培养基、增值培养基、壮苗培养基和生根培养基。而关于南京椴的组织培养研究尚未见有报道。
本发明已成功采取组织培养繁殖南京椴，解决了南京椴资源增加的重要途径，对南京椴的保护和经济利用都具有着非常重要的意义。
三、发明内容
1、南京椴外植体选择：分别取一年生实生苗、3-4年生实生苗和多年树大树基部萌蘖当年生枝条上带腋芽的茎段为外植体，将消过毒的三种来源外植体分别接于诱导培养基MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.02mg/L+GA32.0mg/L上，琼脂6.5g/l，蔗糖30g/l，pH为5.8-6.0。每份材料接5瓶，重复三次。观察芽的分化及分化后的生长情况。结果表明最佳外植体为一年生实生苗带腋芽茎段。
2、南京椴外植体消毒：比较多种消毒方法，结果表明最佳的消毒方法为，将带腋芽的当年生枝条用清水冲洗干净，然后用洗衣粉漂洗一次，用84消毒液摇床上振荡消毒15-20min。流水冲洗20-30min后，于无菌操作台上用75％乙醇消毒50-60s，立即倒入0.1％的升汞消毒10min，最后用无菌水洗涤4次，每次振荡3-5min。将枝条切割为1.0-1.5cm长的茎段，每个茎段带一个腋芽。
3、南京椴芽的诱导：通过3因子3水平正交试验法L9(33)设计9个培养基组合。将外植体接于9种培养基上，每瓶2个，每种培养基组合接5瓶，重复3次。外植体接种后，在23-26℃黑暗中培养24h，然后进行正常培养。培养温度20-26℃，光照时间16h/天，光强2000Ix。观察芽诱导情况，30天后统计分化率和新稍高。通过软件正交设计助手IIv3.1分析数据，筛选最佳芽诱导培养基为MS+6-BA0.2mg/L+KT0.05mg/L+IBA0.02mg/L+GA30.1mg/L，添加琼脂6.5g/l，蔗糖30g/l。培养基pH为5.8-6.0。
4、南京椴继代与增值：调整初代培养基激素水平，通过L9(33)正交试验重新设计9个培养基组合。将初代生长30天后的南京椴嫩梢切割后接入9种培养基中，每个茎段带一个新腋芽。每瓶3个茎段，每种培养基接5瓶，重复三次。观察芽增殖情况，30天后统计增殖率。通过软件正交设计助手IIv3.1分析数据，筛选最佳继代增殖基培养基为MS+6-BA0.3mg/L+IBA0.02mg/L+GA30.3mg/L，添加琼脂6.5g/l，蔗糖30g/l。培养基pH为5.8-6.0。
5、南京椴根的诱导：将长至3.0-4.0cm高的南京椴试管苗切为两段接入12种生根培养基：(1)MS+BA0.05mg/L+NAA0.5mg/L；添加琼脂6.5g/l，蔗糖30g/l。培养基pH为5.8-6.0。(2)MS+BA0.05mg/L+NAA1.0mg/L；添加琼脂6.5g/l，蔗糖30g/l。培养基pH为5.8-6.0。
(3)MS+BA0.05mg/L+NAA1.5mg/L；添加琼脂6.5g/l，蔗糖30g/l。培养基pH为5.8-6.0。(4)MS+BA0.05mg/L+NAA2.0mg/L；添加琼脂6.5g/l，蔗糖30g/l。培养基pH为5.8-6.0。(5)MS+BA0.05mg/L+IBA0.5mg/L；添加琼脂6.5g/l，蔗糖30g/l。培养基pH为5.8-6.0。(6)MS+BA0.05mg/L+IBA1.0mg/L；添加琼脂6.5g/l，蔗糖30g/l。培养基pH为5.8-6.0。(7)MS+BA0.05mg/L+IBA1.5mg/L；添加琼脂6.5g/l，蔗糖30g/l。培养基pH为5.8-6.0。(8)MS+BA0.05mg/L+IBA2.0mg/L；添加琼脂6.5g/l，蔗糖30g/l。培养基pH为5.8-6.0。(9)MS+BA0.05mg/L+NAA1.0mg/L+GA30.05mg/L；添加琼脂6.5g/l，蔗糖30g/l。培养基pH为5.8-6.0。(10)MS+BA0.05mg/L+NAA1.0mg/L+GA31.0mg/L；添加琼脂6.5g/l，蔗糖30g/l。培养基pH为5.8-6.0。(11)MS+BA0.05mg/L+NAA0.5mg/L+GA30.05mg/L添加琼脂6.5g/l，蔗糖30g/l。培养基pH为5.8-6.0。(12)MS+BA0.05mg/L+NAA0.5mg/L+GA31.0mg/L，添加琼脂6.5g/l，蔗糖30g/l。培养基pH为5.8-6.0。
观察生根情况，从中筛选诱发根生长的最佳培养基为MS+BA0.05mg/L+IBA1.0mg/L，添加琼脂6.5g/l，蔗糖30g/l。培养基pH为5.8-6.0。
四、具体实施方式
以下以南京椴一年生实生苗为材料，说明本发明的具体实施方式。
实施例一
1、2006年4月15日，选取50株茁壮的南京椴一年生实生苗。剪取地上部分，去除叶片，以茎段为外植体，每茎段带一腋芽，长2cm。将外植体用清水冲洗干净，然后用洗衣粉漂洗一次，用84消毒液摇床上振荡消毒15-20min。流水冲洗20-30min后，于无菌操作台上用75％乙醇消毒50-60s，立即倒入0.1％的升汞消毒10min，最后用无菌水洗涤4次，每次振荡3-5min。将消毒灭菌过的外植体两端分别切除0.5cm，以去除受伤部分。接入诱导培养基MS+6-BA0.2mg/L+KT0.05mg/L+IBA0.02mg/L+GA30.1mg/L，添加琼脂6.5g/l，蔗糖30g/l。培养基pH为5.8-6.0中。每瓶接3株，共接入70瓶。在温度20-26℃，光照时间10h/天，光强16001x的条件下，进行培养。
2、外植体接入培养基5天后，腋芽开始萌动。至30天时(5月15日)，萌发率达60％，共获得126株不带根的初代无菌苗。无菌苗株高约4cm，每株茎上带有已萌动的腋芽3至6个。将叶片去除，与初代苗切为带芽茎段，每段带一个腋芽。接入继代增值培养基MS+6-BA0.3mg/L+IBA0.02mg/L+GA30.3mg/L，添加琼脂6.5g/l，蔗糖30g/l。培养基pH为5.8-6.0中，在温度20-26℃，光照时间10h/天，光强16001x的条件下，进行培养。培养5天后，腋芽开始陆续出梢，30天后(6月15日)，增值率达到11倍，即每株继代苗上平均含有11个已萌动的腋芽。
3、进行第3次继代后，于2006年7月15日，获得继代无菌苗约1386株。将无菌苗切成带2至3个腋芽的小段，接入生根壮苗培养基MS+BA0.05mg/L+IBA1.0mg/L，添加琼脂6.5g/l，蔗糖30g/l。培养基pH为5.8-6.0。培养条件同上。培养10天后，开始生根，30天后生根率达80％。至此，从外植体接种到获得完整的无菌苗，共需120天的时间，获得无菌苗3300余株。
实施例二
1、2007年4月25日，选取30株茁壮的南京椴一年生实生苗。剪取地上部分，去除叶片，以茎段为外植体，每茎段带一腋芽，长2cm。将外植体用清水冲洗干净，然后用洗衣粉漂洗一次，用84消毒液摇床上振荡消毒15-20min。流水冲洗20-30min后，于无菌操作台上用75％乙醇消毒50-60s，立即倒入0.1％的升汞消毒10min，最后用无菌水洗涤4次，每次振荡3-5min。将消毒灭菌过的外植体两端分别切除0.5cm，以去除受伤部分。接入诱导培养基MS+6-BA0.2mg/L+KT0.05mg/L+IBA0.02mg/L+GA30.1mg/L，添加琼脂6.5g/l，蔗糖30g/l。培养基pH为5.8-6.0中。每瓶接3株，共接入50瓶。在温度20-26℃，光照时间10h/天，光强16001x的条件下，进行培养。
2、外植体接入培养基5天后，腋芽开始萌动。至30天时(5月25日)，萌发率达70％，共获得105株不带根的初代无菌苗。无菌苗平均株高4.5cm，每株茎上带有已萌动的腋芽3至6个。将叶片去除，与初代苗切为带芽茎段，每段带一个腋芽。接入继代增值培养基MS+6-BA0.3mg/L+IBA0.02mg/L+GA30.3mg/L，添加琼脂6.5g/l，蔗糖30g/l。培养基pH为5.8-6.0中，在温度20-26℃，光照时间10h/天，光强16001x的条件下，进行培养。培养5天后，腋芽开始陆续出梢，30天后(6月25日)，增值率达到10倍，即每株继代苗上平均含有10个已萌动的腋芽。
3、进行第3次继代后，于2006年7月25日，获得继代无菌苗约1050株。将无菌苗切成带2至3个腋芽的小段，接入生根壮苗培养基MS+BA0.05mg/L+IBA1.0mg/L，添加琼脂6.5g/l，蔗糖30g/l。培养基pH为5.8-6.0。在温度20-26℃，光照时间10h/天，光强16001x的条件下，进行培养。培养10天后，开始生根，30天后生根率达80％。至此，从外植体接种到获得完整的无菌苗的120天内，获得无菌苗2400余株。
Claims (2)
1.一种南京椴组织培养繁殖方法，其特征在于南京椴外植体的选择、消毒与取材时间，诱导培养基，继代增殖培养基和生根壮苗培养基的筛选，其中，以一年生种子苗带腋芽茎段为外植体，以腋芽萌动期为取材时间，所述诱导培养基为MS+6-BA0.2mg/L+KT0.05mg/L+IBA0.02mg/L+GA30.1mg/L；添加琼脂6.5g/l，蔗糖30g/l，培养基pH为5.8-6.0；培养条件为：温度20-26℃，光照时间10h/天，光强16001x；所述继代增殖培养基为MS+6-BA0.3mg/L+IBA0.02mg/L+GA30.3mg/L；添加琼脂6.5g/l，蔗糖30g/l，培养基pH为5.8-6.0；培养条件为：温度20-26℃，光照时间10h/天，光强16001x；所述生根壮苗培养基为MS+BA0.05mg/L+IBA1.0mg/L；添加琼脂6.5g/l，蔗糖30g/l，培养基pH为5.8-6.0；培养条件为：温度20-26℃，光照时间10h/天，光强1600lx。
2.根据权利要求1南京椴组织培养繁殖方法，其特征在于所述外植体消毒方法是将外植体用清水冲洗干净，然后用洗衣粉漂洗一次，用84消毒液摇床上振荡消毒15-20min，流水冲洗20-30min后，于无菌操作台上用75％乙醇消毒50-60s，立即倒入0.1％的升汞消毒10min，最后用无菌水洗涤4次，每次振荡3-5min。
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