CN109302989B - 一种水角的组培方法及其在种质保存中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种水角的组培方法及其在种质保存中的应用，涉及植物组培技术领域。本发明所述方法，包括以下步骤：1)将消毒后的水角种子接种于萌发培养基上进行萌发，得水角萌发苗；2)将步骤1)得到的所述水角萌发苗接种于增殖培养基上进行增殖培养，得增殖苗；3)将步骤2)得到的所述增殖苗接种于生根培养基上进行生根培养，得组培苗。利用本发明所述方法，增殖率达1:5，生根率达95％，移栽成苗率为95％，且还能延长继代周期到1年以上。

Description

一种水角的组培方法及其在种质保存中的应用
技术领域
本发明属于植物组培技术领域，具体涉及一种水角的组培方法及其在种质保存中的应用。
背景技术
水角(Hydrocera triflora)为凤仙花科水角属单种属多年生水生草本植物，其花粉红色或淡黄色，花型漂亮，果实成熟时紫红色，是一种极具开发潜力的水生观赏植物。水角主要分布于东南亚国家，而我国仅在海南地区有分布。由于生境变化，其分布范围十分狭窄，《中国生物多样性红色名录—高等植物卷》(2013)已将水角列为地区灭绝。
另外，水生植物体内通气组织往往很发达，本身就容易带菌，而且其发达的通气组织在灭菌时消毒所用的药品极易残留其中，对植物细胞的存活和组织的生长会造成影响。
在植物分类学上，水角属是凤仙花属的姊妹群，其植株花瓣全部离生，果实为假浆果，适应水生生境。水角的这些原始特征对于研究凤仙花科的起源、花演化式样和适应性分化等具有重要的意义。凤仙花科凤仙花属植物在观赏园艺方面应用广泛，已有很多组培快繁的研究，但水角的组培快繁和离体保存研究仍未见报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种水角的组培方法及其在种质资源保存中的应用，可获得高增殖率和生根率的组培苗，并且延长水角离体保存时间。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种水角的组培方法，包括以下步骤：
1)将消毒后的水角种子接种于萌发培养基上进行萌发，得水角萌发苗；所述萌发培养基为MS培养基为基本培养基，还包括5～6.5g/L的琼脂，所述萌发培养基的pH值为5.5～6.2；
2)将步骤1)得到的所述水角萌发苗接种于增殖培养基上进行增殖培养，得增殖苗；所述增殖培养基以MS为基本培养基，还包括：0.06～0.15mg/L的TDZ，15～25g/L的蔗糖和5～6.5g/L的琼脂，所述增殖培养基的pH值为5.5～6.2；
3)将步骤2)得到的所述增殖苗接种于生根培养基上进行生根培养，得组培苗；所述生根培养基以MS为基本培养基，还包括：0.25～0.7mg/L的IAA，1～2g/L的活性炭，15～25g/L的蔗糖和5～6.5g/L的琼脂，所述生根培养基的pH值为5.5～6.2。
优选的，步骤1)所述消毒，包括：将种子放入已滴加2～3滴洗洁精的流动水中冲洗30～40min；用75％乙醇溶液进行表面消毒20～30s，用无菌水冲洗3～8遍；再用0.1％HgCl2溶液进行消毒8～15min，用无菌水冲洗2～5遍。
优选的，步骤1)所述萌发，步骤2)所述增殖培养和步骤3)所述生根培养的温度独立的为23±2℃；光照强度独立的为20～40μmol/(m2·s)，光照时间独立的为10～14h/d。
优选的，步骤2)所述增殖培养时接种所述萌发苗的带芽茎段和茎尖。
优选的，当步骤3)所述组培苗生根3条以上、根长为2～3cm后，还包括炼苗和移栽。
优选的，所述炼苗的时间为3～5d。
优选的，所述移栽的基质为泥塘土。
本发明还提供了上述组培方法在水角种质资源保存中的应用，将步骤2)得到的所述增殖苗接种于离体保存培养基中进行离体保存；所述离体保存培养基以MS为基本培养基，还包括：0.25～0.7mg/L的NAA，1～2g/L的活性炭，15～25g/L的蔗糖和5～6.5g/L的琼脂，所述生根培养基的pH值为5.5～6.2。
优选的，所述离体保存的温度为23±2℃；光照强度为20～40μmol/(m2·s)，光照时间为10～14h/d。
本发明提供了一种水角的组培方法，以种子为对象，以种子萌发获得的小苗为外植体，经过不定芽诱导、增殖和生根等步骤，建立了水角的组培体系，一个月内的增殖系数高达1：5，生根率可达95％。
本发明还提供了所述组培方法在水角种质保存中的应用，利用增殖得到的增殖苗进行离体保存，离体保存继代周期达1年以上，大大延长了离体保存周期，有利于水角种质资源的保存和开发利用，为今后的资源挖掘奠定基础。
具体实施方式
本发明提供了一种水角的组培方法，包括以下步骤：
1)将消毒后的水角种子接种于萌发培养基上进行萌发，得水角萌发苗；所述萌发培养基为MS培养基为基本培养基，还包括5～6.5g/L的琼脂，所述萌发培养基的pH值为5.5～6.2；
2)将步骤1)得到的所述水角萌发苗接种于增殖培养基上进行增殖培养，得增殖苗；所述增殖培养基以MS为基本培养基，还包括：0.06～0.15mg/L的TDZ，15～25g/L的蔗糖和5～6.5g/L的琼脂，所述增殖培养基的pH值为5.5～6.2；
3)将步骤2)得到的所述增殖苗接种于生根培养基上进行生根培养，得组培苗；所述生根培养基以MS为基本培养基，还包括：0.25～0.7mg/L的IAA，1～2g/L的活性炭，15～25g/L的蔗糖和5～6.5g/L的琼脂，所述生根培养基的pH值为5.5～6.2。
本发明所述水角的组培方法，将消毒后的水角种子接种于萌发培养基上进行萌发，得水角萌发苗；所述萌发培养基为MS培养基为基本培养基，还包括5～6.5g/L的琼脂，所述萌发培养基的pH值为5.5～6.2。本发明所述所述消毒，优选包括：将种子放入已滴加2～3滴洗洁精的流动水中冲洗30～40min；用75％乙醇溶液进行表面消毒20～30s，用无菌水冲洗3～8遍；再用0.1％HgCl2溶液进行消毒8～15min，用无菌水冲洗2～5遍。本发明用75％乙醇溶液进行表面消毒后，优选用无菌水冲洗4～6遍，更优选为5遍。本发明用0.1％HgCl2溶液消毒后，优选用无菌水冲洗3～4遍。本发明在进行0.1％HgCl2溶液消毒后的无菌水冲洗时，优选在无菌条件下进行，更优选在超净台内进行。本发明在所述种子消毒前，优选还包括将种子表面的泥土或杂质等用纱布搽洗干净。
本发明所述萌发培养基中包括琼脂，所述琼脂在所述萌发培养基中的浓度优选为5.2～6.4g/L，更优选为5.5～6g/L，最优选为5.6g/L。本发明对所述萌发培养基中的各成分的来源并没有特殊限定，利用本领域的常规市售产品即可。
本发明所述萌发培养基的pH值优选为5.6～6，更优选为5.8。
本发明所述萌发的温度优选为23±2℃，光照强度优选为20～40μmol/(m2·s)，光照时间优选为10～14h/d，更优选为11～13h/d，最优选为12h/d。在本发明中，萌发30天后在所述萌发培养基上得到萌发的无菌小苗，萌发率65％左右。
得水角萌发苗后，本发明将所述水角萌发苗接种于增殖培养基上进行增殖培养，得增殖苗；所述增殖培养基以MS为基本培养基，还包括：0.06～0.15mg/L的TDZ，15～25g/L的蔗糖和5～6.5g/L的琼脂，所述增殖培养基的pH值为5.5～6.2。本发明所述接种优选为接种所述萌发苗的带芽茎段和茎尖。
本发明所述增殖培养基中包括TDZ，所述TDZ在所述增殖培养基中的浓度优选为0.07～0.13mg/L，更优选为0.09～0.11mg/L，最优选为0.1mg/L。本发明所述TDZ可促进水角茎段腋芽或顶芽的生长。本发明对所述TDZ的来源并没有特殊限定，利用本领域的常规市售产品即可。
本发明所述增殖培养基中包括蔗糖，所述蔗糖在所述增殖培养基中的浓度优选为16～24g/L，更优选为18～22g/L，最优选为20g/L。本发明对所述蔗糖的来源并没有特殊限定，利用本领域的常规市售产品即可。
本发明所述增殖培养基中包括琼脂，所述琼脂在所述增殖培养基中的浓度优选为5.2～6.4g/L，更优选为5.5～6g/L，最优选为5.6g/L。本发明对所述琼脂的来源并没有特殊限定，利用本领域的常规市售产品即可。
本发明所述增殖培养基的pH值优选为5.6～6，更优选为5.8。
本发明所述增殖培养的温度优选为23±2℃，光照强度优选为20～40μmol/(m2·s)，光照时间优选为10～14h/d，更优选为11～13h/d，最优选为12h/d。在本发明中，所述萌发苗的带芽茎段和茎尖在所述增殖培养基上继代培养，30天继代一次，增殖率可达1：5。
得增殖苗后，本发明将所述增殖苗接种于生根培养基上进行生根培养，得组培苗；所述生根培养基以MS为基本培养基，还包括：0.25～0.7mg/L的IAA，1～2g/L的活性炭，15～25g/L的蔗糖和5～6.5g/L的琼脂，所述生根培养基的pH值为5.5～6.2。本发明所述生根培养基中包括IAA，所述IAA在所述生根培养基中的浓度优选为0.3～0.65mg/L，更优选为0.4～0.6mg/L，最优选为0.5mg/L。本发明所述IAA可促进水角根的生长。本发明对所述IAA的来源并没有特殊限定，利用本领域的常规市售产品即可。
本发明所述生根培养基中包括活性炭，所述活性炭的浓度优选为1～3g/L，更优选为2g/L。本发明所述活性炭可营造暗环境，促进水角根的生长。本发明对所述活性炭的来源没有特殊限定，利用本领域的常规市售产品即可。
本发明所述生根培养基中包括蔗糖，所述蔗糖在所述生根培养基中的浓度优选为16～24g/L，更优选为18～22g/L，最优选为20g/L。本发明对所述蔗糖的来源并没有特殊限定，利用本领域的常规市售产品即可。
本发明所述生根培养基中包括琼脂，所述琼脂在所述生根培养基中的浓度优选为5.2～6.4g/L，更优选为5.5～6g/L，最优选为5.6g/L。本发明对所述琼脂的来源并没有特殊限定，利用本领域的常规市售产品即可。
本发明所述生根培养基的pH值优选为5.6～6，更优选为5.8。
本发明所述生根培养的温度优选为23±2℃，光照强度优选为20～40μmol/(m2·s)，光照时间优选为10～14h/d，更优选为11～13h/d，最优选为12h/d。在本发明中，利用所述生根培养基培养14d后，生根率可达95％。
在本发明中，当步骤3)所述组培苗生根3条以上、根长为2～3cm后，还包括炼苗和移栽。本发明所述炼苗，优选为将所述生根的组培苗从瓶内取出，用清水洗去根部附着的培养基，将小苗根部朝下放入育苗盆中，育苗盆预先装有3～4cm深的自来水，在育苗盆中炼苗1～2天后再打开育苗盆的盖炼苗2天，然后进行移栽。本发明所述移栽的基质为普通泥塘土，栽好后浇足水至漫过水角植株茎部2cm以上。本发明在所述移栽后，先期可用塑料薄膜覆盖保湿，待试管苗长出新叶后，可去膜粗放管理，移栽成苗率95％以上。
本发明还提供了上述组培方法在水角种质资源保存中的应用，将步骤2)得到的所述增殖苗接种于离体保存培养基中进行离体保存；所述离体保存培养基以MS为基本培养基，还包括：0.25～0.7mg/L的NAA，1～2g/L的活性炭，15～25g/L的蔗糖和5～6.5g/L的琼脂，所述生根培养基的pH值为5.5～6.2。
本发明所述离体保存培养基中包括NAA，所述NAA在所述离体保存培养基中的浓度优选为0.3～0.6mg/L，更优选为0.4～0.55mg/L，最优选为0.5mg/L。本发明所述NAA可促进水角茎段腋芽或顶芽的生长。本发明对所述NAA的来源并没有特殊限定，利用本领域的常规市售产品即可。
本发明所述离体保存培养基中包括蔗糖，所述蔗糖在所述离体保存培养基中的浓度优选为16～24g/L，更优选为18～22g/L，最优选为20g/L。本发明对所述蔗糖的来源并没有特殊限定，利用本领域的常规市售产品即可。
本发明所述离体保存培养基中包括琼脂，所述琼脂在所述离体保存培养基中的浓度优选为5.2～6.4g/L，更优选为5.5～6g/L，最优选为5.6g/L。本发明对所述琼脂的来源并没有特殊限定，利用本领域的常规市售产品即可。
本发明所述离体保存培养基的pH值优选为5.6～6，更优选为5.8。
本发明所述离体保存培养的温度优选为23±2℃，光照强度优选为20～40μmol/(m2·s)，光照时间优选为10～14h/d，更优选为11～13h/d，最优选为12h/d。在本发明中，将新增殖的茎段转接在离体保存培养基上，每瓶接种3个，培养瓶口用保鲜膜缠绕封严，以减弱后期瓶苗的呼吸作用，继代周期可延长至1年以上。
下面结合实施例对本发明提供的水角的组培方法及其在种质保存中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
收集水角种子为原材料，将种子表面的泥土或杂质等用纱布搽洗干净，然后放入已滴加3滴洗洁精的流动自来水中冲洗35min。将经过初步清洗的外植体用75％乙醇溶液进行表面消毒30s，并用无菌水冲洗5遍，用0.1％HgCl2溶液进行消毒10min，在超净台内用无菌水反复水洗3遍，用滤纸吸干表面水分。将经过消毒处理的外植体接种至培养基(MS+5.6g/L琼脂，pH为5.8)上，每瓶接种5颗种子，30天后在该培养基中获得由种子萌发得到的无菌小苗，萌发率65％。
将小苗转接至培养基(MS+0.1mg/L TDZ+0.01mg/L NAA+20g/L蔗糖+5.6g/L琼脂，pH为5.8)，小苗进一步长大长高，然后通过无菌短枝扦插的方法，将无菌苗的带芽茎段和茎尖扦插在此培养基中继代培养，30天继代一次，增殖率可达1：5。
将新增殖的茎段转接在培养基(MS+0.5mg/L IAA+20g/L蔗糖+1g活性炭+5.6g/L琼脂，pH为5.8)上，每瓶接种5个，培养2周后生根率可达95％。
当水角生根3条左右、根长约为2cm时，即可作移栽准备。首先，将生根瓶苗从瓶内取出，用清水洗去根部附着的培养基，将小苗根部朝下放入育苗盆中，育苗盆预先装有4cm深的自来水，在育苗盆中炼苗2天后再打开育苗盆的盖炼苗2天，然后进行移栽。移栽基质为普通泥塘土，栽好后浇足水至漫过水角植株茎部2cm以上。先期可用塑料薄膜覆盖保湿，待试管苗长出新叶后，可去膜粗放管理，移栽成苗率95％以上。
对比例
分别以水角带芽茎段、茎尖、叶片和果实为外植体，其余步骤均与实施例1相同，经观察后发现，7天后带芽茎段、茎尖和果实等外植体全部被污染，叶片枯死，均不能形成有效的萌发苗。
实施例2
收集水角种子为原材料，将种子表面的泥土或杂质等用纱布搽洗干净，然后放入已滴加3滴洗洁精的流动自来水中冲洗35min。将经过初步清洗的外植体用75％乙醇溶液进行表面消毒30s，并用无菌水冲洗5遍，用0.1％HgCl2溶液进行消毒10min，在超净台内用无菌水反复水洗3遍，用滤纸吸干表面水分。将经过消毒处理的外植体接种至培养基(MS+5.6g/L琼脂，pH为5.8)上，每瓶接种5颗种子，30天后在该培养基中获得由种子萌发得到的无菌小苗，萌发率65％。
将小苗转接至培养基(MS+0.1mg/L TDZ+0.01mg/L NAA+20g/L蔗糖+5.6g/L琼脂，pH为5.8)，小苗进一步长大长高，然后通过无菌短枝扦插的方法，将无菌苗的带芽茎段和茎尖扦插在此培养基中继代培养，30天继代一次，增殖率可达1：5。
将新增殖的茎段转接在培养基(MS+0.5mg/L NAA+20g/L蔗糖+2g/L活性炭+5.6g/L琼脂，pH为5.8)，每瓶接种3个，培养瓶口用保鲜膜缠绕封严，以减弱后期瓶苗的呼吸作用，继代周期可延长至1年以上。
本发明提供了一种水角的组培方法及其在种质保存中的应用，利用本发明所述方法，增殖率达1:5，生根率达95％，移栽成苗率为95％，且还能延长继代周期到1年以上。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种水角的组培方法在水角种质资源保存中的应用，其特征在于，包括以下步骤：1）将消毒后的水角种子接种于萌发培养基上进行萌发，得水角萌发苗；所述萌发培养基由MS基本培养基和5~6.5g/L的琼脂组成，所述萌发培养基的pH值为5.5~6.2；
2）将步骤1）得到的所述水角萌发苗接种于增殖培养基上进行增殖培养，得增殖苗；所述增殖培养基由MS基本培养基、0.06~0.15mg/L的TDZ、15~25g/L的蔗糖和5~6.5g/L的琼脂组成，所述增殖培养基的pH值为5.5~6.2；所述增殖培养时接种所述萌发苗的带芽茎段和茎尖；
3）将步骤2）得到的所述增殖苗接种于离体保存培养基中进行离体保存；所述离体保存培养基由MS基本培养基、0.25~0.7mg/L的NAA、1~2g/L的活性炭、15~25g/L的蔗糖和5~6.5g/L的琼脂组成，所述离体保存培养基的pH值为5.6~6.0；
步骤1）所述萌发，步骤2）所述增殖培养和步骤3）所述离体保存的温度均为23±2℃；光照强度均为20~40μmol /（m2·s），光照时间均为10~14h/d。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，步骤1）所述消毒，包括：将种子放入已滴加2~3滴洗洁精的流动水中冲洗30~40 min；用75%乙醇溶液进行表面消毒20~30s，用无菌水冲洗3~8遍；再用0.1%HgCl2溶液进行消毒8~15 min，用无菌水冲洗2~5遍。
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