CN101061790A - Ot型杂种系百合脱毒组培快繁方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了OT型杂种系百合脱毒组培快繁方法，属于植物组培快繁技术领域。该方法包括：培养基的配制，取百合种源鳞茎茎尖为外植体，经诱导、增殖、鳞茎膨大培养、冷藏、移栽、病毒检测等步骤，快速获得大量脱毒组培苗。本发明通过调节培养基的配方，并采用二次茎尖热处理脱毒与诱导培养等技术，达到不经愈伤组织生长阶段而直接诱导出鳞茎芽和/或无根组培苗，防止了种性变异，缩短了诱导培养周期，具有脱毒彻底，增殖系数高，生产成本较低，实用性强等特点，可在百合等植物脱毒组培生产中推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及植物组培快繁技术领域，尤其涉及一种OT型杂交百合的脱毒组培快繁方法。
背景技术
OT型杂交百合(Oriental×Trumpet Hybrid)系东方百合与喇叭百合/奥列连诺斯杂种系的杂交系列，为百合科多年生观赏植物，主要用于切花栽培。其植株茎杆强度、抗病性、耐热性、耐盐碱性等性状明显优于东方百合，故有很好的市场开发前景。近年我国百合切花生产量年增长20％以上，但百合种球却一直依赖于从国外进口。然而，病毒病侵染造成百合种性的严重退化，给世界各地百合种球生产者带来了巨大的经济损失，因此开发百合组培脱毒快繁技术对实现种球国产化具有重要的意义。百合传统采用简便的鳞片扦插繁育方法，但其一方面繁殖系数较低，新品种通过鳞片扦插繁殖至大面积推往往需要5～8年时间，十分不利于新品种的快速推广；另一方面由于长期无性繁殖导致病毒的感染和积累，使种球产量和质量下降，从而限制了种球生产的发展。
组培与脱毒苗生产的关键是脱毒技术，而脱毒技术有多种，例如热处理脱毒、茎尖培养脱毒和愈伤组织脱毒及相互间的组合脱毒。其中普遍采用较好的是茎尖培养脱毒法，其常规的步骤是：通过植物顶端分生组织切取0.2～0.3mm茎尖，诱导愈伤组织，然后从愈伤组织分化产生鳞茎芽，长成小植株得到脱毒苗或培养试管鳞茎。百合科百合属园艺种应用组培技术快速繁殖试管鳞茎已有成功的例子，并有相关的专利报导，例如，CN1762205A披露了采用茎尖作为外植体，经茎尖培养后得到东方百合脱毒鳞茎的方法；CN1695427A发明名称为“一种培育东方百合试管鳞茎的方法”公开了通过选择无病毒的鳞茎，采用鳞片接种进行无菌条件下培育鳞茎。
但是这两种脱毒组织培养法存在的问题是：前者切取很小的茎尖分生组织，在添加6-BA 1.0～2.0mg/L和NAA0.2～0.5mg/L的MS培养基上培养20～25d，茎尖会同时形成愈伤组织和不定芽，但从愈伤组织分化的不定芽(鳞茎芽)易发生遗传变异；后者选择生长健壮植株的鳞茎，对经检测不带病毒的鳞茎，直接进行鳞片诱导培养，该方法一方面由于受检测病毒种类的限制，存在有未经茎尖脱毒培养的鳞茎仍带有其它种类病毒的可能性；另一方面随着培养代数的增加，容易产生植物体内内生菌大量繁殖而引起的污染，严重影响组培苗正常生产。
OT型杂交百合是近年荷兰新育成的种间杂交品种，其品种特性与东方百合有较大差异，按常规方法进行OT型杂交百合茎尖脱毒培养时易发生玻璃化，而且增殖系数较低，其鳞茎膨大培养对培养基配方和培养条件有严格的要求，故尚未见有关该品种百合组织培养成功的报道，因此，开发此项技术对加快OT型杂交百合新品种的推广有重要价值。
发明内容
本发明目的是克服以上常规茎尖培养脱毒法，所存在的通过愈伤组织分化，产生的鳞茎芽易发生遗传变异、易发生玻璃化、增殖系数较低及脱毒不彻底等缺陷，提出一种适于OT型杂交百合脱毒组织培养的优化培养基配方和应用该配方进行快速、种性好、低成本繁殖试管鳞茎的方法。
本发明目的通过以下技术方案来实现：
一种OT型杂交百合脱毒组培快繁方法，按如下步骤进行：
(1)培养基的配制、备用：包括基本培养基和组培各阶段培养基的组分与各组分在每升培养基内所含重量为：
a)基本培养基：诱导、增殖培养基选用白糖为30～50g/L，琼脂粉为4～5g/L的MS基本培养基，pH为5.6～5.8；试管鳞茎膨大培养基选用白糖为70～90g/L，琼脂粉为4.0g/L的MS基本培养基，另加甘露醇1.0～5.0g/L，AC 1.0～5.0mg/L，pH为6.0；
b)诱导培养基I(种源鳞茎茎尖诱导培养基)：MS+6-BA 1.0～2.0mg/L+IBA 0.1～0.5mg/L+AC 1.0～3.0mg/L；
c)诱导培养基II(组培苗茎尖诱导培养基)：MS+6-BA 0.5～1.0mg/L+IBA 0.1～0.5mg/L；
d)增殖培养基：MS+6-BA0.2～1.0mg/L+IBA 0.1～0.5mg/L；
e)鳞茎膨大培养基：MS+NAA 0.1～0.5mg/L；
(2)外植体热处理和灭菌：取经过5℃低温处理3～4个月，打破休眠后的OT型杂交百合种源鳞茎，用透气塑料薄膜包裹后置在潮湿泥炭中，于50℃培养箱内热处理70～90分钟，剥离外层鳞片，取3～5cm长的鳞茎芽，用水清洗后，进行灭菌处理；
(3)诱导培养：取步骤(2)0.2～0.3mm茎尖作为外植体，植于诱导培养基I，在温度20±1℃，光照12h/d，光照强度1000～3000Lx的环境条件下，经2个月培养，直接诱导成鳞茎芽和/或无根组培苗；切去叶片，将鳞茎纵向切成2块，转接至诱导培养基I，在温度20±1℃，光照12h/d，光照强度1000～3000Lx的环境条件下，诱导出多个鳞茎芽，经2～3个月培养全部形成无根组培苗；将无根组培苗放入光照培养箱内按30、35、38℃的顺序，每3d变换一档，循环热处理50～60d后，取0.2～0.3mm茎尖接种在诱导培养基II上，进行第二次茎尖脱毒培养，在温度20±1℃，光照12h/d，光照强度1000～3000Lx的环境条件下，经2～3个月培养，直接诱导出鳞茎芽和/或无根组培苗，然后将它们直接放入3～5℃低温处理45～60d，以提高组培苗生长活性；
(4)增殖培养：将步骤(3)低温处理后的鳞茎芽或无根组培苗，切去叶片和部分基部组织后的鳞茎，纵切成4～6块，接种在增殖培养基上，在温度20±1℃，光照12h/d，光照强度1000～3000Lx的环境条件下培养2个月，形成健壮的鳞茎芽和/或无根组培苗；
(5)鳞茎膨大培养：将步骤(4)鳞茎芽和/或无根组培苗切去叶片和部分基部组织，接种在鳞茎膨大培养基中，在20±2℃和黑暗条件下培养60～70d，长成直径0.8～1.2cm，根系5～10条/粒，重0.5～1.0g/粒的试管鳞茎；
(6)冷藏：取出步骤(5)试管鳞茎用清水洗去琼脂，包裹于消毒泥炭中，经10～12℃预处理10～20d，再经3～5℃冷藏处理50～60d打破休眠，打破休眠的鳞茎可在2～3℃下延长贮藏2～3个月；
(7)移栽：将步骤(6)鳞茎，选择具夏季冷凉气候的800～1000米海拔地区，在避雨和防虫隔离条件下，4月下旬至5月中旬移栽在消毒过的基质上，定植30～35d后出苗；
(8)病毒检测：采用RT-PCR检测法，对步骤7)脱毒组培苗进行LSV、LMoV病毒检测，检测结果未发现病毒的侵染。
所述的种源鳞茎为OT型杂交百合(Oriental×Trumpet Hybrid)的周茎14～16cm的种球，其收获期为11月下旬，经5℃低温处理3～4个月，打破休眠后用于茎尖脱毒培养。
所述的外植体灭菌处理为75％酒精浸泡0.5～1.0min，无菌水冲洗3～5次，再用0.1％升汞溶液灭菌15～20min，无菌水冲洗3～5次，再用10％的次氯酸钠水溶液灭菌13～15min，无菌水冲洗3～5次。
所述的移栽基质为泥炭∶珍珠岩按体积比7∶3配制而成。
本发明的有益效果是：
(1)本发明利用种源鳞茎茎尖作为脱毒组培的外植体，通过调节培养基6-BA和IBA用量，并添加少量活性碳，达到不经愈伤组织生长阶段而直接诱导出鳞茎芽和/或无根组培苗，避免了从愈伤组织分化鳞茎芽易产生遗传变异的弊病，保持了优良品种的特性，并缩短了诱导培养周期60～70d，接种诱导率达77.0％，而不添加活性炭接种诱导率仅32.5％。
(2)本发明在种源鳞茎茎尖脱毒的基础上，提出了利用组培苗进行第2次热处理茎尖脱毒与诱导培养方法，即通过30、35、38℃三档交替变温处理，既能防止茎尖坏死，又能彻底脱毒；对诱导的鳞茎芽和/或无根组培苗，进行3～5℃低温处理，克服了组培苗因高温处理而导致的活性下降，使鳞茎芽和/或无根组培苗切块培养的增殖系数提高1～2倍。
(3)本发明所生产的试管鳞茎便于冷藏和延长定植期，定植操作容易，定植成活率达98％以上，而一般生根组培苗定植成活率为70％左右。经5℃低温处理打破休眠的试管鳞茎，可在2～3℃条件下延长贮藏2～3个月，在此期间可根据气候条件选择适宜时期集中定植，便于生产管理，克服了传统的生根组培苗出瓶后必须随时定植导致成活率低的难题，特别适合大规模生产。
具体实施方式
通过以下实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明的内容并不局限于此。
种源鳞茎：为OT型杂交百合(Oriental×Trumpet Hybrid)的周茎为14～16cm的种球，其收获期为11月下旬，经5℃低温处理3～4个月，打破休眠后用于茎尖脱毒培养。
灭菌处理：取种源鳞茎3～5cm长的鳞茎芽，用水清洗后，以75％酒精浸泡0.5～1.0min，无菌水冲洗3～5次，再用0.1％升汞溶液灭菌15～20min，无菌水冲洗3～5次，再用10％的次氯酸钠水溶液灭菌13～15min，无菌水冲洗3～5次。
移栽基质：为泥炭∶珍珠岩按体积比7∶3配制而成。
实施例1：(OT型杂种系百合脱毒组培快繁方法1)
具体方法按以下步骤进行：
(1)培养基的制备、备用：包括基本培养基和组培各阶段培养基的组分与各组分在每升培养基内所含重量按下述配方。
(2)外植体选取及灭菌：于3月上旬，取休眠已打破的鳞茎，在50℃下湿热处理70分钟，经75％酒精浸泡0.5min，无菌水冲洗3～5次，再用0.1％升汞溶液灭菌15min，无菌水冲洗3～5次，用10％的次氯酸钠水溶液灭菌15min，最后用无菌水冲洗3～5次，作为脱毒组培用的外植体。
(3)诱导培养：在接物镜下取0.2～0.3mm茎尖接种在白糖30g/L，琼脂粉4.0g/L的MS基本培养基+BA 2.0mg/L+IBA 0.15mg/L+AC3.0mg/L，pH为5.8的诱导培养基I上，在温度20±1℃，光照12h/d，光照强度2000Lx的环境条件下，不经过愈伤组织阶段，直接分化成鳞茎芽和/或无根组培苗；经2个月培养后将鳞茎纵向切成2块，再移植至诱导培养基I上，在温度20±1℃，光照12h/d，光照强度1000Lx的环境条件下，诱导出多个鳞茎芽，经2个月培养全部形成无根组培苗；将无根组培苗放入光照培养箱内按30、35、38℃的顺序，每3d变换一档，循环热处理60d后，取0.2～0.3mm茎尖培养接种在白糖30g/L，琼脂粉4.0g/L的MS基本培养基+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.1mg/L的诱导培养基II上，在温度20±1℃，光照12h/d，光照强度2000Lx的环境条件下，直接诱导出鳞茎芽和/或无根组培苗，然后将组培瓶苗直接放入3℃低温处理45d，以提高组培苗生长活性。
(4)增殖培养：在无菌条件下将鳞茎芽和/或无根组培苗切去叶片和部分基部组织，将带有鳞茎基部组织的鳞茎切成4～6块，接种在白糖30g/L，琼脂粉4.0g/L的MS基本培养基+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.5mg/L的增殖培养基上，在温度为21℃，光照时间12h/d，光照强度1000Lx的环境条件下，诱导出鳞茎芽和/或无根组培苗；
(5)鳞茎膨大培养：将步骤(4)鳞茎芽和/或无根组培苗切去叶片和部分基部组织，接种在白糖为70g/L，琼脂粉为4.0g/L的MS基本培养基+NAA 0.5mg/L+AC 1.0mg/L+甘露醇1.0g/L的鳞茎膨大培养基上，在22℃和黑暗条件下培养70d，直接生成直径0.8～1.2cm，根系5～10条/粒，重0.5～1.0g/粒的试管鳞茎；
(6)冷藏：当步骤(5)鳞茎膨大培养结束后，取出鳞茎用清水洗去琼脂，包裹于消毒过的泥炭中，经12℃预处理20d，再在3℃处理冷藏50d；
(7)移栽：当步骤(6)试管鳞茎打破休眠后，选择具夏季冷凉气候的800～1000米海拔地区，在避雨和防虫隔离条件下，4月下旬至5月中旬移栽在消毒过的基质上，定植后30～35d出苗；
(8)病毒检测：采用RT-PCR检测法，对脱毒组培苗进行LSV、LMoV病毒检测，检测结果未发预期大小的扩增片段，说明经过茎尖脱毒培养的组培苗中不存在这2种病毒的侵染。
实施例2：(OT型杂种系百合脱毒组培快繁方法2)
(1)培养基的制备、备用：包括基本培养基和组培各阶段培养基的组分与各组分在每升培养基内所含重量按下述配方。
(2)外植体选取及灭菌：于3月中旬，取休眠已打破的鳞茎，在50℃下湿热处理90分钟，经75％酒精浸泡1.0min，无菌水冲洗3～5次，再用0.1％升汞溶液灭菌20min，无菌水冲洗3～5次，用10％的次氯酸钠水溶液灭菌13min，最后用无菌水冲洗3～5次，作为脱毒组培用的外植体。
(3)诱导培养：在接物镜下取0.2～0.3mm茎尖接种在白糖40g/L，琼脂粉4.5g/L的MS基本培养基+BA 1.0mg/L+IBA 0.5mg/L，AC1.0mg/L，pH为5.8的诱导培养基I上，在温度20±1℃，光照12h/d，光照强度2000Lx的环境条件下，不经过愈伤组织阶段，直接分化成鳞茎芽和/或无根组培苗；经2个月培养后将鳞茎纵向切成2块，再移植至诱导培养基I上，在温度20±1℃，光照12h/d，光照强度2000Lx的环境条件下，诱导出多个鳞茎芽，经3个月培养全部形成无根组培苗；将无根组培苗放入光照培养箱内按30、35、38℃的顺序，每3d变换一档，循环热处理50d后，取0.2～0.3mm茎尖培养接种在白糖40g/L，琼脂粉4.5g/L的MS基本培养基+6-BA0.75mg/L+IBA 0.5mg/L的诱导培养基II上，在温度20±1℃，光照12h/d，光照强度3000Lx的环境条件下，直接诱导出鳞茎芽和/或无根组培苗，然后将组培瓶苗直接放入5℃低温处理60d，以提高组培苗生长活性。
(4)增殖培养：在无菌条件下将鳞茎芽和/或无根组培苗切去叶片和部分基部组织，将带有鳞茎基部组织的鳞茎切成4～6块，接种在白糖40g/L，琼脂粉4.5g/L的MS基本培养基+6-BA 0.55mg/L+IBA 0.3mg/L的增殖培养基上，在温度为20℃，光照时间12h/d，光照强度2000Lx的环境条件下，诱导出鳞茎芽和/或无根组培苗；
(5)鳞茎膨大培养：将步骤(4)鳞茎芽和/或无根组培苗切去叶片和部分基部组织，接种在白糖为80g/L，琼脂粉为4.0g/L的MS基本培养基+NAA 0.3mg/L+AC 2.5mg/L+甘露醇3.0g/L的鳞茎膨大培养基上，在21℃和黑暗条件下培养60d，直接生成直径0.8～1.2cm，根系5～10条/粒，重0.5～1.0g/粒的试管鳞茎；
(6)冷藏：当步骤(5)鳞茎膨大培养结束后，取出鳞茎用清水洗去琼脂，包裹于消毒过的泥炭中，经10℃预处理10d，再在5℃处理冷藏60d；
(7)移栽：当步骤(6)试管鳞茎打破休眠后，选择具夏季冷凉气候的800～1000米海拔地区，在避雨和防虫隔离条件下，4月下旬至5月中旬移栽在消毒过的基质上，定植后30～35d出苗；
(8)病毒检测：RT-PCR检测法，对脱毒组培苗进行LSV、LMoV病毒检测，检测结果未发预期大小的扩增片段，说明经过茎尖脱毒培养的组培苗中不存在这2种病毒的侵染。
实施例3：(OT型杂种系百合脱毒组培快繁方法3)
(1)培养基的制备、备用：包括基本培养基和组培各阶段培养基的组分与各组分在每升培养基内所含重量按下述配方。
(2)外植体选取及灭菌：于3月上旬，取休眠已打破的鳞茎，在50℃下湿热处理80分钟，经75％酒精浸泡0.75min，无菌水冲洗3～5次，再用0.1％升汞溶液灭菌18min，无菌水冲洗3～5次，用10％的次氯酸钠水溶液灭菌14min，最后用无菌水冲洗3～5次，作为脱毒组培用的外植体。
(3)诱导培养：在接物镜下取0.2～0.3mm茎尖接种在白糖50g/L，琼脂粉5.0g/L的MS基本培养基+BA1.5mg/L+IBA 0.3mg/L+AC2.0mg/L，pH为5.7的诱导培养基I上，在温度20±1℃，光照12h/d，光照强度2000Lx的环境条件下，不经过愈伤组织阶段，直接分化成鳞茎芽和/或无根组培苗；经2个月培养后将鳞茎纵向切成2块，再移植至诱导培养基I上，在温度20±1℃，光照12h/d，光照强度3000Lx的环境条件下，诱导出多个鳞茎芽，经3个月培养全部形成无根组培苗；将无根组培苗放入光照培养箱内按30、35、38℃的顺序，每3d变换一档，循环热处理60d后，取0.2～0.3mm茎尖培养接种在白糖50g/L，琼脂粉5.0g/L的MS基本培养基+6-BA0.5mg/L+IBA 0.1mg/L的诱导培养基II上，在温度20±1℃，光照12h/d，光照强度2000Lx的环境条件下，直接诱导出鳞茎芽和/或无根组培苗，然后将组培瓶苗直接放入4℃低温处理50d，以提高组培苗生长活性。
(4)增殖培养：在无菌条件下将鳞茎芽和/或无根组培苗切去叶片和部分基部组织，将带有鳞茎基部组织的鳞茎切成4～6块，接种在白糖50g/L，琼脂粉5.0g/L的MS基本培养基+6-BA0.25mg/L+IBA 0.1mg/L的增殖培养基上，在温度为19℃，光照时间12h/d，光照强度3000Lx的环境条件下，诱导出鳞茎芽和/或无根组培苗；
(5)鳞茎膨大培养：将步骤(4)鳞茎芽和/或无根组培苗切去叶片和部分基部组织，接种在白糖为90g/L，琼脂粉为4.0g/L的MS基本培养基+NAA 0.15mg/L+AC4.5mg/L+甘露醇1.5g/L的鳞茎膨大培养基上，在19℃和黑暗条件下培养70d，直接生成直径0.8～1.2cm，根系5～10条/粒，重0.5～1.0g/粒的试管鳞茎；
(6)冷藏：当步骤(5)鳞茎膨大培养结束后，取出鳞茎用清水洗去琼脂，包裹于消毒过的泥炭中，经11℃预处理15d，再在4℃处理冷藏55d；
(7)移栽：当步骤(6)试管鳞茎打破休眠后，选择具夏季冷凉气候的800～1000米海拔地区，在避雨和防虫隔离条件下，4月下旬至5月中旬移栽在消毒过的基质上，定植后30～35d出苗；
(8)病毒检测：采用RT-PCR检测法，对脱毒组培苗进行LSV、LMoV病毒检测，检测结果未发预期大小的扩增片段，说明经过茎尖脱毒培养的组培苗中不存在这2种病毒的侵染。
实施例4：(脱毒组培苗的病毒检测)
(1)植物材料
a)对照材料：以带毒的百合鳞茎为材料。
b)处理材料：以实施例1获得的百合脱毒组培苗为材料。
(2)病毒的RNA抽提：
采用RNeasy Plant mini(QIAGEN)试剂盒，分别对每个百合样品进行总RNA的抽提，所用试剂器皿均需作无RNA酶处理，具体操作流程如下：
a)称取约0.1g的百合叶片，在灭菌的研钵中加液氮磨细后转入无菌Eppendorf管中。
b)迅速加入450μL RLT，缓冲液，振荡混匀后56℃温育3min。
c)将裂解液全部转入紫色管，13,000g离心2min。
d)将滤液转入新的无菌Eppendorf管中(注意不要搅动沉淀)，加225μL无水乙醇轻柔颠倒混匀。
e)将所有样品转入粉红色小管，13,000g离心15秒，弃滤液，留收集管。
f)加700μL RW1于粉红色小管，13,000g离心15秒，弃滤液和收集管。
g)将RNA柱移入新的Kit中提供的2mL收集管中。
h)加500μL RPE于粉红色小管，13,000g离心15秒，弃滤液。
i)再次加500μL RPE于粉红色小管，13,000g离心2min，干燥膜，确保柱边无水痕，弃滤液和收集管。
j)将粉红色小管插到无菌的Eppendorf管(Kit中提供)加30μL无RNase水，10,000g离心1min，提取的RNA置-80℃保存。
(3)病毒各基因序列的扩增
a)引物设计
本实验中的引物主要根据已经报道的百合斑驳病毒(Lily mottle virus，LMoV)和百合无症病毒(Lily symptomless virus，LSV)分离物序列设计。
b)cDNA第一链合成
用设计的下游引物进行逆转录，合成cDNA第一链。模板RNA 12.5μL，下游引物(100μmol/L)2μL，10×RT缓冲液2μL，10mmol/L dNTPs2μL，RNasin 0.5μL，鼠源逆转录酶(M-MuLV逆转录酶，Promega)1μL，总体积20μL。37℃1-2h后加入60μL灭菌水，剧烈振荡混匀后贮于-20℃备用。
c)逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)
用病毒提取的RNA合成的cDNA第一链做模板来进行PCR扩增。采用Ex TaqTM PCR System(Life Technology Ltd)扩增目的片段。加入5μL 10×PCR缓冲液，再加入4μL 2.5mmol/L dNTPs，2μL(20μmol/L)上游引物及2μL下游引物，2μL cDNA第一链模板和0.2μL Taq DNAPolymerase(GIBCO)，用无菌去离子水调整到50μL。进入PCR循环：
94℃ 3min
94℃ 30sec
Tm℃ 30sec 30个循环
72℃ 1-2min
72℃ 10min
具体参数可根据引物、模板、PCR片段大小来适量调整。
(4)PCR产物的检测
将PCR扩增产物进行1％Agarose Gel琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色后，在紫外灯下观察，检测扩增的片段和长度。
对带毒的百合鳞茎和茎尖脱毒组培苗分别进行LSV、LMoV病毒检测，带毒的百合鳞茎检测结果发现预期大小的扩增片段，茎尖脱毒组培苗检测结果均未发现预期大小的扩增片段，说明经过茎尖脱毒培养的组培苗中不存在这2种病毒的侵染。
Claims (4)
1、OT型杂种系百合脱毒组培快繁方法，其特征在于按如下步骤进行：
(1)培养基的配制、备用：包括基本培养基和组培各阶段培养基的组分与各组分在每升培养基内所含重量为：
a)基本培养基：诱导、增殖培养基选用白糖为30～50g/L，琼脂粉为4～5g/L的MS基本培养基，pH为5.6～5.8；试管鳞茎膨大培养基选用白糖为70～90g/L，琼脂粉为4.0g/L的MS基本培养基，另加甘露醇1.0～5.0g/L，AC 1.0～5.0mg/L，pH为6.0；
b)诱导培养基I：MS+6-BA 1.0～2.0mg/L+IBA 0.1～0.5mg/L+AC1.0～3.0mg/L；
c)诱导培养基II：MS+6-BA 0.5～1.0mg/L+IBA 0.1～0.5mg/L；
d)增殖培养基：MS+6-BA0.2～1.0mg/L+IBA 0.1～0.5mg/L；
e)鳞茎膨大培养基：MS+NAA 0.1～0.5mg/L；
(2)外植体热处理和灭菌：取经过5℃低温处理3～4个月，打破休眠后的OT型杂交百合种源鳞茎，用透气塑料薄膜包裹后置在潮湿泥炭中，于50℃培养箱内热处理70～90分钟，剥离外层鳞片，取3～5cm长的鳞茎芽，用水清洗后，进行灭菌处理；
(3)诱导培养：取步骤(2)0.2～0.3mm茎尖作为外植体，植于诱导培养基I，在温度20±1℃，光照12h/d，光照强度1000～3000Lx的环境条件下，经2个月培养，直接诱导成鳞茎芽和/或无根组培苗；切去叶片，将鳞茎纵向切成2块，转接至诱导培养基I，在温度20±1℃，光照12h/d，光照强度1000～3000Lx的环境条件下，诱导出多个鳞茎芽，经2～3个月培养全部形成无根组培苗；将无根组培苗放入光照培养箱内按30、35、38℃的顺序，每3d变换一档，循环热处理50～60d后，取0.2～0.3mm茎尖接种在诱导培养基II上，进行第二次茎尖脱毒培养，在温度20±1℃，光照12h/d，光照强度1000～3000Lx的环境条件下，经2～3个月培养，直接诱导出鳞茎芽和/或无根组培苗，然后将它们直接放入3～5℃低温处理45～60d，以提高组培苗生长活性；
(4)增殖培养：将步骤(3)低温处理后的鳞茎芽或无根组培苗，切去叶片和部分基部组织后的鳞茎，纵切成4～6块，接种在增殖培养基上，在温度20±1℃，光照12h/d，光照强度1000～3000Lx的环境条件下培养2个月，形成健壮的鳞茎芽和/或无根组培苗；
(5)鳞茎膨大培养：将步骤(4)鳞茎芽和/或无根组培苗切去叶片和部分基部组织，接种在鳞茎膨大培养基中，在20±2℃和黑暗条件下培养60～70d，长成直径0.8～1.2cm，根系5～10条/粒，重0.5～1.0g/粒的试管鳞茎；
(6)冷藏：取出步骤(5)试管鳞茎用清水洗去琼脂，包裹于消毒泥炭中，经10～12℃预处理10～20d，再经3～5℃冷藏处理50～60d打破休眠，打破休眠的鳞茎可在2～3℃下延长贮藏2～3个月；
(7)移栽：将步骤(6)鳞茎，选择具夏季冷凉气候的800～1000米海拔地区，在避雨和防虫隔离条件下，4月下旬至5月中旬移栽在消毒过的基质上，定植30～35d后出苗；
(8)病毒检测：采用RT-PCR检测法，对步骤7)脱毒组培苗进行LSV、LMoV病毒检测，检测结果未发现病毒的侵染。
2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的种源鳞茎为OT型杂交百合(Oriental×Trumpet Hybrid)的周茎为14～16cm的种球。
3、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的外植体灭菌处理为75％酒精浸泡0.5～1.0min，无菌水冲洗3～5次，再用0.1％升汞溶液灭菌15～20min，无菌水冲洗3～5次，再用10％的次氯酸钠水溶液灭菌13～15min，无菌水冲洗3～5次。
4、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的移栽基质为泥炭∶珍珠岩按体积比7∶3配制而成。
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