CN101796924A

CN101796924A - 提高东方百合试管鳞茎当年抽茎率的方法

Info

Publication number: CN101796924A
Application number: CN201010138968A
Authority: CN
Inventors: 郭方其; 丁渭文; 孙崇波; 向林; 黎侠; 柴金甫; 林森洪; 袁峰; 丁晓瑜; 贾燕娇
Original assignee: Shaoxing Dongfang Baihe Tissue Culture Development Co ltd; Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Shaoxing Dongfang Baihe Tissue Culture Development Co ltd; Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2010-04-02
Filing date: 2010-04-02
Publication date: 2010-08-11
Anticipated expiration: 2030-04-02
Also published as: CN101796924B

Abstract

本发明公开了提高东方百合试管鳞茎当年抽茎率的方法，属于植物组培快繁技术领域。该方法包括：培养基的配制，种源处理与灭菌，鳞茎芽的诱导培养，鳞茎芽的增殖培养，试管鳞茎的膨大培养，试管鳞茎的冷藏，试管鳞茎的定植及栽培管理等步骤。本发明培育成的试管鳞茎出苗快，长势旺，其直径0.8~1.2cm，根系10~20条/粒，鲜重0.8~1.2g/粒，定植成活率达95％以上，当年抽茎率由常规的5％以下提高至60％以上，加快了鳞茎生长膨大速度，使培育合格种球的周期缩短1~2年。本发明可在东方百合种球生产企业中推广应用。

Description

提高东方百合试管鳞茎当年抽茎率的方法

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，尤其涉及一种提高东方百合试管鳞茎当年抽茎率的方法。

背景技术

东方百合为多年生观赏植物，主要用于切花栽培，近年我国东方百合切花生产量的年增长率达20％以上。东方百合植株形态优美、花朵硕大、花色鲜艳、瓶插寿命长，深受我国人民喜爱。利用我国不同纬度和海拔气候差异，结合设施温光调控等措施已可实现周年生产，由于百合切花生产效益高，生产发展快，已成为重要的切花品种之一。但我国目前切花生产应用的东方百合品种主要是从荷兰引进，东方百合种球每年需要从国外进口，这大大增加了东方百合切花的生产成本，因此尽快实现东方百合种球国产化是加快我国东方百合切花生产十分迫切的任务。

东方百合种球繁育的传统方法是：先采用鳞片扦插繁育成小鳞茎，再经田间种植2年培育成商品种球。但由于繁殖用种源鳞茎本身易感染镰刀菌、丝核菌和腐霉菌等真菌性病害和病毒病，而且鳞茎上寄生的螨虫、跳虫和线虫等也容易通过鳞片繁殖而传播。因此，采用组培快繁技术来繁育无病虫害侵染的材料，以达到有效防止病虫害的侵染与传播，目前该项技术已在国内外百合种球生产上得到广泛的应用。一般是通过组培技术培育成试管鳞茎后，将试管鳞茎经过3-5年的田间栽培，使鳞茎周径逐年膨大至14-18公分时，才能成为能开花百合种球的合格产品。其中，该试管鳞茎质量的好与坏跟百合种球的培育周期及成品质量存在有密切的相关性，若试管鳞茎质量好，则田间栽培只需3年即能成14公分以上的合格种球，若试管鳞茎质量差，则田间栽培需4-5年才能育成。而在实践中，一般东方百合试管鳞茎定植后的当年抽茎率很低，一般均在5％以下，这种不抽茎的鳞茎当年仅在顶端长2～3张叶片，生长较瘦弱，当年其地下鳞茎周径只能长至4～6公分，这种植株鳞茎就需4～5年才能达到14公分以上的合格标准。而能正常抽茎的东方百合试管鳞茎植株，一般具6～13张叶片，其营养生长明显大于不抽茎植株，鳞茎膨大速度快，因此培育成合格种球的周期就可缩短1～2年。因此，提高东方百合试管鳞茎的当年抽茎率，这对缩短东方百合种球的培育周期，促进组培技术的产业化应用具有重大的意义。

发明内容

本发明目的是，针对常规东方百合试管鳞茎定植当年抽茎率低于5％，导致鳞茎生长速度慢、田间栽培周期延长、成品率低的难题，提出一种组培成本低、试管鳞茎质量高，定植当年抽茎率达60％以上的提高东方百合试管鳞茎当年抽茎率的方法。

本发明目的通过以下技术方案来实现。

提高东方百合试管鳞茎当年抽茎率的方法，该方法按如下步骤进行：

(1)培养基的配制：包括基本培养基和组培各阶段培养基的组分与各组分每升所含重量为：

a)基本培养基：其中，

诱导培养基为蔗糖30～50g/L，琼脂粉4～5g/L，pH5.6～5.8的MS培养基；

增殖培养基为蔗糖50～60g/L，琼脂粉4～5g/L，pH5.6～5.8的3/5MS培养基；

试管鳞茎膨大培养基为蔗糖60～75g/L，琼脂粉4～5g/L，pH5.6～6.0的1/2MS培养基；

b)诱导培养基I：MS+6-BA 1.0～2.0mg/L+IBA 0.1～0.5mg/L+AC1.0～3.0mg/L；

c)诱导培养基II：MS+6-BA 0.5～1.0mg/L+IBA 0.1～0.5mg/L；

d)增殖培养基：3/5MS+6-BA0.2～1.0mg/L+IBA 0.1～0.5mg/L；

e)试管鳞茎膨大培养基：1/2MS+NAA 0.1～0.5mg/L+PP333 1～10mg/L+甘露醇1.0～5.0g/L+AC 1.0～5.0mg/L；

(2)种源处理与灭菌：将种源鳞茎先5℃低温处理3～4个月打破其休眠；再用透气塑料薄膜包裹该种源鳞茎并置于潮湿泥炭中，置50℃培养箱内热处理70～90min；剥离外层鳞片，取其内4～6cm长的种源鳞茎芽，用1％洗洁精液浸泡10min，经清水冲洗后进行种源鳞茎芽灭菌处理，备用；

(3)鳞茎芽的诱导培养：取灭菌后种源鳞茎芽剥取其内0.2～0.3mm的茎尖作为外植体，接种于诱导培养基I，在温度20±1℃，光照12h/d，光照强度1000～3000Lx的环境条件下培养50～60d至诱导出鳞茎芽；将该鳞茎芽切去顶部叶片后纵向切成2块，转接至诱导培养基I，在同上环境条件下培养60～90d诱导形成丛生状鳞茎芽；放入光照培养箱内按30℃、35℃、38℃的顺序，每3d变换一档进行循环热处理50～60d后，剥取其内0.2～0.3mm的茎尖作为外植体接种于诱导培养基II进行二次诱导培养，在同上环境条件下培养60～90d至诱导形成鳞茎芽后，置3～6℃低温处理45～60d，以恢复该鳞茎芽的生长活性；

(4)鳞茎芽的增殖培养：将低温处理后的鳞茎芽，切去叶片和部分基部组织后纵切成4～6块接种在增殖培养基上，在20±1℃、黑暗条件下培养60～90d至形成鳞茎芽；切除其根系后再纵向切成4～6块转接在增殖培养基上，在同上条件下循环培养，直至满足对鳞茎芽的数量需求；

(5)试管鳞茎的膨大培养：将步骤(4)鳞茎芽切去芽顶部和部分基部组织，接种在膨大培养基上，在22±2℃和黑暗条件下培养50～60d至形成鳞茎膨大、根系生长良好的试管鳞茎；将温度降至15±2℃、黑暗条件下继续培养30～50d促进其茎和叶原基的分化，至试管鳞茎达到直径0.8～1.2cm，根系10～20条/粒，鲜重0.8～1.2g/粒；

(6)试管鳞茎的冷藏：将步骤(5)试管鳞茎用清水洗去琼脂，包裹于经消毒的含水量为60～70％的泥炭中，10～12℃预处理10～20d后，于3～5℃冷藏处理50～60d至打破休眠期；即定植或在1～3℃继续冷藏的20～30d内择时定植；

(7)试管鳞茎的定植：选择夏季气候冷凉，海拔在1800～2000米的地区，在避雨和防虫隔离条件下，于4月下旬至5月中旬将步骤(6)冷藏后的鳞茎，定植至消毒基质里，15～20d后始萌芽出苗；

(8)栽培管理：定植至出苗期要求13～18℃，并用70％遮阳率的遮阳网遮光；出苗后要求15～25℃下，在夏、秋季中午强光时段用同上遮阳网遮光4～5小时，每7～10d浇1次1000～1500倍的GOLDMAY水溶性系列肥料，其中，出苗期选用N∶P∶K为20∶20∶20专用肥；茎叶生长期选用N∶P∶K为14∶0∶14专用肥，鳞茎膨大期选用N∶P∶K为10∶30∶20专用肥；并定期喷施杀菌和杀虫剂防治病虫害。

所述的种源鳞茎芽灭菌处理为75％酒精浸泡0.5～1.0min，无菌水冲洗6次，再用0.1％升汞溶液灭菌15～20min，无菌水冲洗6次，再用10％的次氯酸钠水溶液灭菌13～15min，无菌水冲洗6次。

所述的定植基质为泥炭：珍珠岩按体积比7∶3配制而成。

本发明的有益效果是：

一、本发明步骤(5)以黑暗条件下增殖培养获得的鳞茎芽为外植体，通过调节1/2MS培养基中大量元素、蔗糖、PP333、AC、甘露醇和NAA的用量，在黑暗和前高后低的变温条件下进行试管鳞茎的膨大培养，既促进了试管鳞茎的快速膨大，又诱导了试管鳞茎生长点中茎、叶原基的发育分化；再结合步骤(6)将充分膨大的试管鳞茎进行冷藏处理后，彻底打破了其休眠期，为东方百合试管鳞茎定植后能快速整齐出苗和顺利抽生出地上茎，奠定了生理分化的基础，使当年抽茎率达到60％以上；而按常规方法培育的试管鳞茎，因其个体较小，生长点中茎、叶原基分化较晚或不完善及鳞茎休眠期尚未彻底打破等原因，导致当年抽茎率低于5％。

二、本发明在鳞茎芽增殖培养期和试管鳞茎膨大期全程均采用暗培养，使该二期的出叶率均为0；而在常规的光照培养下，鳞茎芽和试管鳞茎的出叶率分别达到90％和80％以上，由于叶片的生长必然导致养分不能集中供应鳞茎芽的增殖和试管鳞茎的膨大；此外，光照培养明显增加电能消耗，暗培养可降低培育成本，并且便于工作人员操作，如增殖培养时减少了切除叶片的工作量，试管鳞茎出瓶时由于无枯死叶子，使试管鳞茎的清洗和冷藏操作更加方便。

三、本发明培育的试管鳞茎出苗快，长势旺，其直径0.8～1.2cm，根系10～20条/粒，鲜重0.8～1.2g/粒，由于根系发达，定植成活率高达95％；而普通方法培育的试管鳞茎其鲜重0.5g/粒左右，根系只5条/株左右，定植成活率仅为70％左右。

具体实施方式

通过以下实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明的内容并不局限于此。

种源鳞茎：东方百合周茎为14～16cm的鳞茎，其收获期为11月下旬，经5℃低温处理3～4个月，打破休眠后用于茎尖诱导培养。

全矿物营养液肥：为含有氮、磷、钾大量元素及钙、镁、硫、铁、锰、锌、铜、硼、钼等微量元素的GOLDMAY牌水溶性系列肥料，包括N∶P∶K比例分别为20∶20∶20和14∶0∶14及10∶30∶20的三种专用肥，浙江国美园艺有限公司生产。

实施例1：(提高东方百合试管鳞茎当年抽茎率的方法1)

具体方法按以下步骤进行：

(1)培养基的配制：包括基本培养基和组培各时期培养基的组分与各组分每升所含重量为：

a)基本培养基：其中，

诱导培养基为蔗糖40g/L，琼脂粉4g/L，pH5.8的MS培养基；

增殖培养基为蔗糖50g/L，琼脂粉5g/L，pH5.6的3/5MS培养基；

鳞茎膨大培养基为蔗糖60g/L，琼脂粉5.0g/L，pH5.6的1/2MS基本培养基；

b)诱导培养基I：MS+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.1mg/L+AC 2.0mg/L；

c)诱导培养基II：MS+6-BA 1.0mg/L+IBA0.25mg/L；

d)增殖培养基：3/5MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.5mg/L；

e)鳞茎膨大培养基：1/2MS+NAA 0.1mg/L+PP333 1mg/L+甘露醇1.0g/L+AC 1.0mg/L；

(2)种源处理与灭菌：于12月上旬，将选用的种源鳞茎先5℃低温处理3～4个月打破其休眠；再用透气塑料薄膜包裹该鳞茎并置于含水量为60～70％的潮湿泥炭中，置50℃培养箱内热处理70min；剥离外层鳞片，取其内4～6cm长的种源鳞茎芽，用1％洗洁精液浸泡10min，经清水冲洗后进行灭菌处理：75％酒精浸泡0.5min，无菌水冲洗6次，再用0.1％升汞溶液灭菌15min，无菌水冲洗6次，用10％的次氯酸钠水溶液灭菌15min，最后用无菌水冲洗6次，保存；

(3)鳞茎芽的诱导培养：取灭菌后种源鳞茎芽剥取其内0.2～0.3mm的茎尖作为外植体，接种于诱导培养基I，在温度20±1℃，光照12h/d，光照强度2000Lx的环境条件下培养55d，不经过愈伤组织阶段，直接分化成鳞茎芽；将该鳞茎芽切去顶部叶片后纵向切成2块，再转接至诱导培养基I，在同上环境条件下培养60d诱导形成丛生状鳞茎芽；放入光照培养箱内按30℃、35℃、38℃的顺序，每3d变换一档进行循环热处理60d后，剥取其内0.2～0.3mm的茎尖作为外植体接种于诱导培养基II进行二次诱导培养，在同上环境条件下培养80d至诱导形成鳞茎芽，有效脱除由种源鳞茎携带来的病毒和内生菌等微生物，获得更洁净的初始培养物；置3℃低温处理45d，以恢复该鳞茎芽的生长活性；

(4)鳞茎芽的增殖培养：将低温处理后的鳞茎芽，切去叶片和部分基部组织后纵切成4～6块接种在增殖培养基上，在20±1℃、黑暗条件下培养90d至形成鳞茎芽；切除其根系后再纵向切成4～6块接种在增殖培养基上，在同样条件下可循环纵切与培养，直至满足对鳞茎芽的数量需求；

(5)试管鳞茎的膨大培养：将步骤(4)鳞茎芽切去芽顶部和部分基部组织，接种在鳞茎膨大培养基上，在22±2℃和黑暗条件下培养50d至试管鳞茎膨大、根系生长良好；将温度降至15±2℃、黑暗条件下继续培养40d，促进其茎和叶原基的分化，至试管鳞茎达到直径0.8～1.2cm，根系10～20条/粒，鲜重0.8～1.2g/粒；

(6)试管鳞茎的冷藏：将步骤(5)试管鳞茎用清水洗去琼脂，包裹于含水量60～70％的消毒泥炭中，10℃预处理20d后，于5℃冷藏处理50d至打破休眠期；打破休眠后的鳞茎即定植或可在1～3℃下继续贮藏20～30d，以便选择适当时机定植；

(7)试管鳞茎的定植：选择夏季气候冷凉，海拔在1800～2000米的地区，在避雨和防虫隔离条件下，于4月下旬至5月中旬将步骤(6)冷藏后鳞茎，定植至消毒基质里，15～20d后始萌芽出苗；

(8)栽培管理：定植至出苗期要求13～18℃，并用70％遮阳率的遮阳网遮光；出苗后要求15～25℃，在夏、秋季中午强光时段用同上遮阳网遮光4～5小时，每7～10d浇1次1000～1500倍的GOLDMAY牌水溶性系列肥料，其中，出苗期选用N∶P∶K比例为20∶20∶20的专用肥；茎叶生长期选用N∶P∶K比例为14∶0∶14的专用肥，鳞茎膨大期选用N∶P∶K比例为10∶30∶20的专用肥；并定期喷施杀菌和杀虫剂防治枯萎病、根腐病和地种蝇等病虫害。

实施例2：(提高东方百合试管鳞茎当年抽茎率的方法2)

本例中，步骤(1)培养基的配制为：a)基本培养基：其中，诱导培养基为蔗糖30g/L，琼脂粉4.5g/L，pH5.6的MS培养基；增殖培养基为蔗糖55g/L，琼脂粉4.5g/L，pH5.7的3/5MS培养基；鳞茎膨大培养基为蔗糖68g/L，琼脂粉4.5g/L，pH5.8的1/2MS基本培养基；b)诱导培养基I：MS+6-BA 2.0mg/L+IBA 0.5mg/L+AC 1.0mg/L；c)诱导培养基II：MS+6-BA 0.75mg/L+IBA0.1mg/L；d)增殖培养基：3/5MS+6-BA0.2mg/L+IBA0.1mg/L；e)鳞茎膨大培养基：1/2MS+NAA 0.5mg/L+PP333 5mg/L+甘露醇5g/L+AC 5mg/L；

步骤(2)种源鳞茎置50℃培养箱内热处理80min；种源鳞茎芽的灭菌处理为：75％酒精浸泡1.0min，0.1％升汞溶液灭菌20min，10％的次氯酸钠水溶液灭菌13min；

步骤(3)外植体先接种于诱导培养基I，在温度20±1℃，光照12h/d，光照强度1000Lx下培养60d；转接诱导培养基I在同上条件下培养90d诱导形成丛生状鳞茎芽；循环热处理为50d；诱导培养基II的二次诱导在同一条件下培养60d；置5℃低温处理60d，以恢复该鳞茎芽的生长活性；

步骤(4)纵切后的鳞茎芽在增殖培养基上，于20±1℃、黑暗条件下培养75d形成鳞茎芽，并在同样条件下循环培养，直至满足对鳞茎芽的数量需求；

步骤(5)鳞茎芽接种在鳞茎膨大培养基上，在22±2℃和黑暗条件下培养60d形成试管鳞茎；再将温度降至15±2℃、黑暗条件下继续培养50d，以促进其茎和叶原基的分化；

步骤(6)洗去琼脂后的试管鳞茎于11℃预处理15d后，再于4℃冷藏处理55d至打破休眠期；其余步骤工艺同于实施例1。

实施例3：(提高东方百合试管鳞茎当年抽茎率的方法3)

本例中，步骤(1)培养基的配制为：a)基本培养基：其中，诱导培养基为蔗糖50g/L，琼脂粉5.0g/L，pH5.7的MS培养基；增殖培养基为蔗糖60g/L，琼脂粉4.0g/L，pH5.8的3/5MS培养基；鳞茎膨大培养基为蔗糖75g/L，琼脂粉4.0g/L，pH6.0的1/2MS基本培养基；b)诱导培养基I：MS+6-BA 1.5mg/L+IBA 0.3mg/L+AC 3.0mg/L；c)诱导培养基II：MS+6-BA 0.5mg/L+IBA0.5mg/L；d)增殖培养基：3/5MS+6-BA0.5mg/L+IBA0.3mg/L；e)鳞茎膨大培养基：1/2MS+NAA 0.3mg/L+PP333 10mg/L+甘露醇3g/L+AC 3mg/L；

步骤(2)种源鳞茎置50℃培养箱内热处理90min；种源鳞茎芽的灭菌处理为：75％酒精浸泡0.75min，0.1％升汞溶液灭菌18min，10％的次氯酸钠水溶液灭菌14min；

步骤(3)外植体先接种于诱导培养基I，在温度20±1℃，光照12h/d，光照强度3000Lx下培养50d；转接诱导培养基I在同上条件下培养70d诱导形成丛生状鳞茎芽；循环热处理为55d；诱导培养基II的二次诱导在同一条件下培养90d；置4℃低温处理50d，以恢复该鳞茎芽的生长活性；

步骤(4)纵切后的鳞茎芽在增殖培养基上，于20±1℃、黑暗条件下培养60d形成鳞茎芽，并在同样条件下循环培养，直至满足对鳞茎芽的数量需求；

步骤(5)鳞茎芽接种在鳞茎膨大培养基上，在22±2℃和黑暗条件下培养55d形成试管鳞茎；再将温度降至15±2℃、黑暗条件下继续培养30d，以促进其茎和叶原基的分化；

步骤(6)洗去琼脂后的试管鳞茎于12℃预处理10d后，再于3℃冷藏处理60d至打破休眠期；其余步骤工艺同于实施例1。

Claims

1.提高东方百合试管鳞茎当年抽茎率的方法，其特征在于该方法按如下步骤进行：

a)基本培养基：其中，

膨大培养基为蔗糖60～75g/L，琼脂粉4～5g/L，pH5.6～6.0的1/2MS培养基；

b)诱导培养基I：MS+6-BA 1.0～2.0mg/L+IBA 0.1～0.5mg/L+AC1.0～3.0mg/L；

c)诱导培养基II：MS+6-BA 0.5～1.0mg/L+IBA 0.1～0.5mg/L；

d)增殖培养基：3/5MS+6-BA 0.2～1.0mg/L+IBA 0.1～0.5mg/L；

e)膨大培养基：1/2MS+NAA 0.1～0.5mg/L+PP333 1～10mg/L+甘露醇1.0～5.0g/L+AC 1.0～5.0mg/L；

2.按权利要求1所述的方法，其特征在于所述种源鳞茎芽的灭菌处理为75％酒精浸泡0.5～1.0min，无菌水冲洗6次，再用0.1％升汞溶液灭菌15～20min，无菌水冲洗6次，再用10％的次氯酸钠水溶液灭菌13～15min，无菌水冲洗6次。

3.按权利要求1所述的方法，其特征在于所述的定植基质为泥炭∶珍珠岩按体积比7∶3配制而成。