CN102870676A - 一种龙山百合高效脱毒工艺 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种龙山百合高效脱毒工艺，其特征在于：步骤如下：1)预处理；2)第一次脱毒；3)第二次脱毒；4)生根培养。本发明通过多代脱毒结合热处理保证了100％的脱毒效率，而且突破了传统脱毒工艺中组培苗成活率不高。应用抗氧化剂AC有效抑制茎尖培养的褐化现象。在启动培养基中添加一定量的活性炭有效地吸附茎尖呼吸过程中产生的酚类、醛类等有毒物质，减少褐化，提高成活率。在从生芽诱导培养基中用1/2MS和较高浓度的6-BA，是为了更好地促进小鳞茎的发生，抑制叶片的生长；提高活性炭的浓度，一方面是为了减少褐化，提高成活率，另一方面也是为了造成一个黑暗的环境，从而促进小鳞茎的产生。

Description

一种龙山百合高效脱毒工艺

技术领域：

本发明涉及一种龙山百合高效脱毒工艺，特别是针对龙山百合，具有极高脱毒效率的脱毒新技术。

背景技术：

湘西龙山县是中国著名的“百合之乡”，常年种植面积稳定在5万亩以上，占全国种植面积的1/6，是全国种植百合最多的县份。百合在生产上主要以扦插繁殖和分球繁殖等无性繁殖为主。长期以来，龙山百合种苗基本上依靠农民自留，品种退化严重。近年来，百合病毒病已普遍存在于全县各百合产区，侵染率已达100％，产量和品质正逐年下降，严重制约了百合产业的发展。如何减少和消除病毒病，生产优质无毒种苗，是龙山县百合种球商品化生产面临的一个重要问题。目前，国内外尚无有效药剂防治病毒病的条件下，最方便可靠的措施是通过茎尖组织培养，生产脱毒种球(除去病毒，同时也除去真菌、细菌、线虫等其它病原物)。

病毒病主要是通过营养体无性繁殖传播的。无性繁殖方式的优点在于能保持其后代遗传基础的一致，较少发生变异。然而长期的无性繁殖将会使体内逐渐积累大量病毒致使植物发生病毒病，并导致种性退化。自Stewart(1896)描述百合的坏死条纹以来，相继报道了百合的病毒病原14种。其中发生普遍、危害严重的病毒有5种。即百合潜隐病毒(Lily symptomless virus，LSV)；黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)；郁金香碎锦病毒(Tulip breaking virus，TBV)；异名百合斑驳病毒(Lilymottlevirus，LMoV)和百合丛簇病毒(Lilyrosettevirus，LRV)。其余9种病毒在栽培地区少量发生，对百合构不成普遍危害。

目前国际上有几个国家已经获得百合无病毒苗，并在大规模的生产。阻断病毒传播获得脱毒苗的基本方法有：茎尖培养、珠芽培养、化学处理、热处理。

①茎尖培养

茎尖培养脱毒的依据是：病毒在患病的植株上分布不均匀，在幼嫩的或未成熟的组织和器官中病毒含量较低，而茎尖是植株中最年轻，细胞分裂最活跃的部位；病毒一般通过维管束转移，茎尖分生组织没有维管束，病毒只能通过胞间连丝传递，赶不上细胞分裂和生长的速度，所以它几乎不含或很少含病毒。植物茎尖中无毒生长点培养，成了去除植物中病毒使植物复壮的重要方法。

茎尖脱毒培养的2个关键技术环节是茎尖的成活率和脱毒率。茎尖培养成活率低，褐化是降低茎尖培养成活率的首要因素。褐化的发生与许多因素有关，茎尖大小、取材季节、培养方式、激素浓度、基本培养基、培养基添加物都对茎尖褐化有影响，例如茎尖越小，褐化越严重、成活率越低。在茎尖培养时为抑制褐化的发生，需要优化上述各因子。

百合通过茎尖培养，TBV、CMV、LSV等病毒的检出率可降至7％以下，可有效地脱除病毒。云南省农科院花卉所的研究表明，剥取0.2～0.3mm的茎尖成苗率可达到78％，但脱毒率仅为43％。

②珠芽培养

珠芽培养时先剥掉外部鳞片，把带有叶原基的珠芽生长点经消毒，无菌水冲洗数次后，剥掉部分叶原基，最后将带有1～2个叶原基的生长点在解剖镜下切成0.3～1.2mm不同长度小段进行培养。赵样云等实验表明，利用0.3～0.8mm珠芽生长点对淡黄花百合进行离体培养，通过脱分化产生愈伤组织，然后将愈伤组织再分化成芽，最后培育出的幼苗可成功地脱去烟草环斑病毒。

③化学处理

抑制植物病毒的活性化学物质包括代谢拮抗物质、植物生长调节物质等，其中一些已用于植物脱毒研究。病毒唑是广谱性抗病毒药物，国外在20世纪70年代末和80年代初，一些科学家将这种抗动物病毒的药物应用于植物，成功地脱去了马铃薯X病毒、黄瓜花叶病毒和苜蓿花叶病毒等。实验人员将感染了CMV、LSV、TBV的百合鳞片接种于含病毒唑或二硫脲嘧啶的培养基上，随培养时间的延长，病毒浓度降低，约40％再生的小鳞茎可脱除病毒。百合离体培养过程中加入抗病毒抑制剂DHT，可有效地去除CMV和LSV，并且对芽的分化影响很小。在百合生产上，采用矿物油、植物油、杀虫剂和外激素喷洒，可控制百合病毒病蔓延。也可采用矿物油和拟除虫菊酯杀虫剂混合物进行喷洒，控制百合蚜虫传播的百合潜隐病毒和百合斑驳病毒。

④热处理

热处理依据是在高温下病毒出现钝化，其复制明显减弱或不再繁殖。将植物在高温下培养数周至数月，这个期间生长的嫩梢不带病毒。植株的存活率和脱毒率受温度的高低和持续时间长短的影响。大部分百合病毒在50～65℃活性稳定，所以处理温度在65～75℃，才能钝化病毒。但温度过高，会降低植株的成活率。在实践中，利用较高温度处理时，缩短处理时间，温度较低时适当延长处理时间。

上述4种方法是脱毒常用的方法，也有将2个方法结合起来做的，比如茎尖培养和热处理相结合来做，珠芽培养和热处理结合来做，实验人员就比较了化学疗法和热处理配合脱除病毒的效果。将鳞片培养在含病毒唑的培养基上，保持35℃高温4周，脱毒效果比单独使用化学疗法或热处理的效果好。云南省农科院花卉所的研究表明，脱毒率最好的为热处理与茎尖培养相结合方法，大小为0.2～0.3mm的茎尖脱毒率为67％，大小为1mm的茎尖脱毒率可达21％。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种减少褐化、提高成活率同时促进小鳞茎的产生龙山百合高效脱毒工艺。

为解决上述问题，本发明所采用的技术方案是：

一种龙山百合高效脱毒工艺，其特征在于：步骤如下：

1)、预处理：将采集回来的龙山百合珠芽冲洗，洗净泥沙等杂质，再经过35℃恒温热处理后进行消毒；

2)、第一次脱毒：将恒温热处理后的珠芽取出，冲洗表面的杂质，剥取0.4-0.5mm大小的不带叶原基或带1个叶原基的茎尖，接种在启动培养基中；当诱导的小鳞茎达到一定基数的时候再进行下一步骤；

3)、第二次脱毒：先将刚转接有小鳞茎的培养基置于35℃恒温下培养30d，以达到钝化病毒的目的；再用解剖针剥取0.2-0.3mm大小不带叶原基的茎尖，接种在启动培养基中；在光培养温度25℃，光照强度2500Lx，待产生小鳞茎时即可转入丛生芽诱导培养基中。

4)、生根培养：小鳞茎达到一定的基数时即可转入生根培养基中，培养约35-40d，当小鳞茎产生3-5条1cm左右的根系时就可以进行移栽。

进一步地说：

所述的启动培养基：MS+1.5mg/L6-BA+0.2mg/L NAA+0.05％AC。

所述的丛生芽诱导培养基：1/2MS+3.0mg/L6-BA+0.1mg/L NAA+0.1％AC。

所述生根培养基MS+0.5mg/L NAA。

更进一步地说：

所述步骤2)中第一次脱毒的35℃恒温预处理的时间为5d；步骤3)中的第二次脱毒35℃恒温下培养时间为30天。

传统脱毒工艺证明，小于0.2mm的茎尖不容易培养成活，换句话说，茎尖越小，脱毒率越高，但同时成活率也越低，并认为，理论上的高成活、高脱毒的理想组培是两者难能兼得。本发明通过多代脱毒结合热处理保证了100％的脱毒效率，而且突破了传统脱毒工艺中组培苗成活率不高。应用抗氧化剂AC有效抑制茎尖培养的褐化现象。在启动培养基中添加一定量的活性炭有效地吸附茎尖呼吸过程中产生的酚类、醛类等有毒物质，减少褐化，提高成活率。在从生芽诱导培养基中用1/2MS和较高浓度的6-BA，是为了更好地促进小鳞茎的发生，抑制叶片的生长；提高活性炭的浓度，一方面是为了减少褐化，提高成活率，另一方面也是为了造成一个黑暗的环境，从而促进小鳞茎的产生。

具体实施方式

实施例

一种龙山百合高效脱毒工艺步骤如下：

1)、预处理：将采集回来的龙山百合珠芽冲洗，洗净泥沙等杂质，再经过35℃恒温热处理后进行消毒。

2)、第一次脱毒：将恒温热处理后的珠芽取出，冲洗表面的杂质，剥取0.4-0.5mm大小的不带叶原基或带1个叶原基的茎尖，接种在启动培养基中。当诱导的小鳞茎达到一定基数的时候再进行下一步骤。

3)、第二次脱毒：先将刚转接有小鳞茎的培养基置于35℃恒温下培养，以达到钝化病毒的目的；再用解剖针剥取0.2-0.3mm大小不带叶原基的茎尖，接种在启动培养基中；在光培养温度25℃，光照强度2500Lx，待产生小鳞茎时即可转入丛生芽诱导培养基中。

4)、生根培养：小鳞茎达到一定的基数时即可转入生根培养基中，培养约35-40d，当小鳞茎产生3-5条1cm左右的根系时就可以进行移栽。

上述步骤是一个系统化的步骤，适用的范围广。下面提供一个具体的实施步骤，针对的是湘西龙山县当地的百合，步骤如下：

一、预处理

1、将采集回来的百合珠芽放在自来水下冲洗10min，洗净泥沙等杂质。

2、将洗净的珠芽装在烧杯中，上面盖一层纱布保湿，将其放在35℃恒温箱中进行高温钝化处理5d。

二、第一次脱毒

1、将高温钝化后的珠芽取出，先在自来水下冲洗几分钟，洗去表面百合呼吸作用产生的分泌物。

2、将洗净的珠芽先用75％酒精浸泡15s后，用无菌水冲洗一次，再用0.1％升汞处理12min，用无菌水冲洗4次，洗净升汞残液。

3、将珠芽置于体视显微镜下，用解剖针剥取0.4mm大小的不带叶原基或带1个叶原基的茎尖，接种在启动培养基中。

4、培养条件：在光培养温度25℃，光照强度2500Lx，培养60天左右，待产生小鳞茎时即可转入丛生芽诱导培养基中。

5、当诱导的小鳞茎达到一定基数的时候即可进行第二次脱毒。

三、第二次脱毒

1、高温预处理：将刚转接有小鳞茎的培养基置于35℃高温下培养30d，以达到钝化病毒的目的，一般只有10-20％的鳞茎能够存活。

2、将在高温处理过的小鳞茎置于体视显微镜下，用解剖针剥取0.3mm大小不带叶原基的茎尖，接种在启动培养基中。培养条件同第一次脱毒。由于第二次剥取的茎尖更小，所以继代周期会更长，一般要2-3个月，不同个体间有差异。

3、丛生芽诱导：当茎尖生长至产生小鳞茎时转入丛生芽诱导培养基中，促进分化更多的小鳞茎，一个继代周期通常需要35-40d。

四、生根培养：

当小鳞茎达到一定的基数时即可转入生根培养基中，培养约35-40d，当小鳞茎产生3-5条1cm左右的根系时就可以进行移栽了。

经上述操作的茎尖培养成的组培苗经由湖南省蔬菜工程技术中心用分子生物学检测，无毒率达100％，脱毒成功率为82.8％。

本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人应该得知在本发明的启示下做出的结构变化，凡是与本发明具有相同或者相近似的技术方案，均属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种龙山百合高效脱毒工艺，其特征在于：步骤如下：

1)、预处理：将采集回来的龙山百合珠芽冲洗，洗净泥沙等杂质，再经过35℃恒温热处理后进行消毒；

2)、第一次脱毒：将恒温热处理后的珠芽取出，冲洗表面的杂质，剥取0.4-0.5mm大小的不带叶原基或带1个叶原基的茎尖，接种在启动培养基中；当诱导的小鳞茎达到一定基数的时候再进行下一步骤；

3)、第二次脱毒：先将刚转接有小鳞茎的培养基置于35℃恒温下培养，以达到钝化病毒的目的；再用解剖针剥取0.2-0.3mm大小不带叶原基的茎尖，接种在启动培养基中；在光培养温度25℃，光照强度2500Lx，待产生小鳞茎时即可转入丛生芽诱导培养基中；

4)、生根培养：小鳞茎达到一定的基数时即可转入生根培养基中，培养约35-40d，当小鳞茎产生3-5条1cm左右的根系时就可以进行移栽。

2.根据权利要求1所述的龙山百合高效脱毒工艺，其特征在于：所述的启动培养基：MS+1.5mg/L6-BA+0.2mg/L NAA+0.05％AC。

3.根据权利要求1所述的龙山百合高效脱毒工艺，其特征在于：所述的丛生芽诱导培养基：1/2MS+3.0mg/L6-BA+0.1mg/L NAA+0.1％AC。

4.根据权利要求1所述的龙山百合高效脱毒工艺，其特征在于：所述生根培养基MS+0.5mg/L NAA。

5.根据权利要求1所述的龙山百合高效脱毒工艺，其特征在于：所述步骤2)中第一次脱毒的35℃恒温预处理的时间为5d；步骤3)中的第二次脱毒35℃恒温下培养时间为30天。