CN105123525A - 一种百日草脱毒苗的获取方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种百日草脱毒苗的获取方法，该方法步骤如下：1）采集百日草嫩叶，脱分化产生愈伤组织；2）将愈伤组织进行热处理，然后将愈伤组织继续诱导出不定芽，不定芽生根培养成健壮的组培苗；3）进一步剥离组培苗茎尖，脱分化产生愈伤组织；4）再次将愈伤组织进行热处理后诱导成苗；5）随机抽取步骤4）中的组培苗，进行病毒检测，若检测合格即百日草脱毒种苗，若不合格需重复1）到4）步，直到获得合格的百日草脱毒种苗。本发明通过两次脱分化产生愈伤组织后热处理再分化，综合胚性愈伤诱导、茎尖诱导脱毒，最终获得百日草脱毒幼苗，解决了现有脱毒技术的脱毒不彻底、操作繁琐的难题，能够满足工厂化脱毒生产的需要。

Description

一种百日草脱毒苗的获取方法

技术领域

本发明涉及一种百日草脱毒苗的获取方法，具体涉及一种通过两次脱分化产生愈伤组织并将愈伤组织热处理后再分化、最终百日草脱毒苗的获取方法，属于农业科学技术领域。

背景技术

百日草，菊科，百日草属，原产北美、墨西哥及南美等地，因节节升高，花越开越繁茂，获诸多美名，如状元红、火球花、百日菊、步步高等。百日草喜温暖，不耐寒，耐干旱，宜阳光充足，在长日照条件下舌状花增多。百日草花期长，花量大，每株自初花至霜冻开30-40朵。优良品种多为千层瓣，花色极其丰富，为夏秋季花坛常用花卉，百日草花姿十分优美，色彩鲜艳多变，深受人们喜爱，为阿拉伯联合酋长国国花。墨西哥是百日草的原始产地，对百日草的育种研究也居世界之首，不断向各国推出新品种，成为墨西哥花卉出口的支柱产业。百日草在我国南北方也广泛栽培，有“庶民之花”的美称，为绿化主栽品种之一。

目前我国已成为世界上最大的花卉种子潜在消费市场，草花种子每年的销售量都以20%的增幅上升。百日草虽然在我国各大中城市普遍栽培，但百日草种子几乎被美国公司所控制，种子依赖国外进口，且价格昂贵，而进口种子为F1代，后代易出现形、色分离的情况，而采用分株繁殖每株每年仅可分出5-6个新株，无法满足产业化生产的要求，并且一直用分株繁殖，容易使病毒逐代积累，从而造成百日草品种退化严重。

组织培养技术是有效的解决方案，既可在短期内大量生产优良种苗，也可用于生产脱毒苗，防止种质退化。近年来，国内外相继展开了对百日草组织培养和快速繁殖的研究，研究建立一种既能保持品种优良特性和较高的繁殖系数，又能脱除培养材料中的病毒病原的有效方法，对于防止病毒的进一步扩散，减少种植者的风险具有重要的现实意义。目前很多病毒的存在严重影响了百日草组培苗的生产，因此解决百日草组培苗的完全脱毒问题十分重要。

发明内容

本发明的目的是针对现有百日草脱毒技术存在的不足，提供一种可持续化、易操作且能够规模化生产的百日草脱毒苗的获取方法，该方法解决了现有脱毒技术的脱毒不彻底、操作繁琐的难题，能够满足工厂化脱毒生产的需要。

本发明的目的是通过以下技术方案解决的：

一种百日草脱毒苗的获取方法，其特征在于：该方法步骤如下：

1）采集百日草嫩叶，脱分化产生愈伤组织；

2）将愈伤组织进行热处理，然后将愈伤组织继续诱导出不定芽，不定芽生根培养成健壮的组培苗；

3）进一步剥离组培苗茎尖，脱分化产生愈伤组织；

4）再次将愈伤组织进行热处理后诱导成苗；

5）随机抽取步骤4）中的组培苗，进行病毒检测，若检测合格即百日草脱毒种苗，若不合格需重复1）到4）步，直到获得合格的百日草脱毒种苗。

该方法的详细步骤如下：

1）采集百日草嫩叶，脱分化产生愈伤组织：

采集生长至现蕾期的健康无病的百日草的嫩叶，自来水洗净，流水冲洗30min，用70%酒精浸泡15s，0.1%升汞内加数滴吐温-20溶液浸泡15min，并用玻璃棒搅动，用无菌水冲洗4-5次，滤纸吸干，用孔直径4mm的打孔器打孔，将打下的叶片接种到愈伤诱导培养基上26-28℃条件下暗培养，15-20天产生愈伤组织；

2）将愈伤组织进行热处理，然后将愈伤组织继续诱导出不定芽，不定芽生根培养成健壮的组培苗：

将愈伤组织转移到培养箱中热处理，切除褐化块段后将愈伤组织转接到不定芽诱导培养基上光培养，20-30天后愈伤组织分化出不定芽，将再生出来的高度1cm以上的芽转接至生根培养基26-28℃条件下光培养成健壮的组培苗；

3）进一步剥离组培苗茎尖，脱分化产生愈伤组织：

待组培苗生长至5cm-8cm，剥取0.4-0.6cm大小的茎尖生长点接种到茎尖诱导愈伤培养基上，在26-28℃条件下暗培养30-45天，诱导出愈伤组织；

4）再次将愈伤组织进行热处理后诱导成苗：

再次将茎尖愈伤组织进行热处理，切除褐化块段后将愈伤组织转接到不定芽诱导培养基上，26-28℃条件下光培养20-30天后诱导出不定芽，然后转接入生根培养基，40-50天后可得到百日草幼苗；

5）随机抽取步骤4）中的组培苗，进行病毒检测，若检测合格即百日草脱毒种苗，若不合格需重复1）到4）步，直到获得合格的百日草脱毒种苗：

随机抽取8-10只完成了步骤4）的的百日草叶片，进行RT-PCR反转录病毒检测，若检测合格即百日草脱毒种苗。

百日草品种选为芳菲1号、芳菲2号、芳菲3号。

步骤1）中用于诱导百日草叶片产生愈伤组织的愈伤诱导培养基为：MS+2.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+0.3g/LCH+3%蔗糖+6.0g/L琼脂，pH为5.8。

步骤2）中将将愈伤组织继续诱导出不定芽的不定芽诱导培养基为：MS+0.5mg/LKT+1.5mg/LBA+0.5mg/LGA+3%蔗糖+7.0g/L琼脂，pH为5.8；所述的生根培养基配方为：1/2MS+0.1mg/LIBA+1.5%蔗糖+7.0g/L琼脂，pH为5.8；所述的将愈伤组织诱导成苗的培养基的光照条件为：光照强度为1500-2000Lux，光周期为14h光/10h暗。

步骤2）和步骤4）中热处理方法为：在38℃-42℃高温处理6h-8h、然后26℃-28℃低温处理10h-12h交替进行2-3循环。

步骤3）中用于诱导茎尖产生愈伤组织的培养基配方为：MS+2.0mg/L6-BA+1mg/LNAA+0.5mg/LKT+3%蔗糖，pH为5.8。

步骤4）中将愈伤组织诱导出不定芽的不定芽诱导培养基配方为：MS+0.5mg/LKT+1.5mg/LBA+0.5mg/LGA+3%蔗糖+7.0g/L琼脂，pH为5.8；生根培养基配方为：1/2MS+0.1mg/LIBA+1.5%蔗糖+7.0g/L琼脂，pH为5.8。

步骤4）中将茎尖愈伤组织诱导不定芽的光照条件为：光照强度为1500-2000Lux，光周期为12h光/12h暗。

步骤5）病毒检测的病毒种类为烟草花叶病毒和黄瓜花叶病毒。

本发明所述的一种百日草脱毒苗的获取方法，是发明人经过仔细研究、大量实验验证后获得的优选结果，相比现有技术，本发明的创新点为：

本发明通过采用综合脱毒技术，即两次愈伤组织诱导、愈伤组织热处理脱毒、茎尖脱毒相结合的方法，有效的克服了脱毒材料较多、脱毒操作流程繁琐、脱毒效率低下等难题，能够高效获得百日草脱毒幼苗。

本发明创造性的采用了愈伤组织热处理的脱毒方法，采用本发明的愈伤组织热处理后，切割掉褐化部分，培养热处理后褐化程度不明显的愈伤部分，可有效去除掉愈伤组织携带的病毒，大大提高了脱毒效率，而且避免了无菌操作，操作简单。

本发明的百日草脱毒苗的获取方法采用茎尖诱导成愈伤，提高了百日草的种性，又进一步脱除了百日草病毒，该方法流程简单、容易操作，故易于形成规模化生产的脱毒种苗，适宜推广使用。

附图说明

图1是芳菲2号叶片脱分化产生愈伤组织的结果图；

图2是芳菲2号叶片愈伤组织再分化出不定芽的结果图；

图3芳菲2号茎尖脱分化产生愈伤组织的结果图；

图4芳菲2号茎尖愈伤组织再分化出不定芽的结果图；

图5是本技术路线下芳菲2号脱毒后种性提高的结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

一种百日草脱毒苗的获取方法，该方法的详细步骤如下：

1）采集百日草嫩叶，脱分化产生愈伤组织：

采集生长至现蕾期的健康无病的百日草品种芳菲1号、2号或3号的嫩叶，自来水洗净，流水冲洗30min，用70%酒精浸泡15s，0.1%升汞内加数滴吐温-20溶液浸泡15min，并用玻璃棒搅动，用无菌水冲洗4-5次，滤纸吸干，用孔直径4mm的打孔器打孔，将打下的叶片接种到愈伤诱导培养基（培养基配方为：MS+2.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+0.3g/LCH+3%蔗糖+6.0g/L琼脂，pH为5.8）上26-28℃条件下暗培养，15-20天产生愈伤组织；

2）将愈伤组织进行热处理，然后将愈伤组织继续诱导出不定芽，不定芽生根培养成健壮的组培苗：

将愈伤组织转移到培养箱中热处理，先在38℃-42℃高温处理6h-8h、然后26℃-28℃低温处理10h-12h，交替进行2-3循环后切除褐化块段后将愈伤组织转接到不定芽诱导培养基（培养基配方为：MS+0.5mg/LKT+1.5mg/LBA+0.5mg/LGA+3%蔗糖+7.0g/L琼脂，pH为5.8）上光培养，光照条件控制为光照强度为1500-2000Lux、光周期为14h光/10h暗，20-30天后愈伤组织分化出不定芽，将再生出来的高度1cm以上的芽转接至生根培养基（培养基配方为：1/2MS+0.1mg/LIBA+1.5%蔗糖+7.0g/L琼脂，pH为5.8）26-28℃条件下光培养成健壮的组培苗；

3）进一步剥离组培苗茎尖，脱分化产生愈伤组织：

待组培苗生长至5cm-8cm，剥取0.4-0.6cm大小的茎尖生长点接种到茎尖诱导愈伤培养基上（培养基配方为：MS+2.0mg/L6-BA+1mg/LNAA+0.5mg/LKT+3%蔗糖，pH为5.8），在26-28℃条件下暗培养30-45天，诱导出愈伤组织；

4）再次将愈伤组织进行热处理后诱导成苗：

再次将茎尖愈伤组织进行热处理，热处理方法同步骤2），切除褐化块段后将愈伤组织转接到不定芽诱导培养基上（培养基配方为：MS+0.5mg/LKT+1.5mg/LBA+0.5mg/LGA+3%蔗糖+7.0g/L琼脂，pH为5.8），26-28℃条件下光培养，光照条件控制为照强度为1500-2000Lux、光周期为12h光/12h暗，光培养20-30天后诱导出不定芽，然后转接入生根培养基（培养基配方为：1/2MS+0.1mg/LIBA+1.5%蔗糖+7.0g/L琼脂，pH为5.8），40-50天后可得到百日草幼苗；

5）随机抽取步骤4）中的组培苗，进行病毒检测，若检测合格即百日草脱毒种苗，若不合格需重复1）到4）步，直到获得合格的百日草脱毒种苗：

随机抽取8-10只完成了步骤4）的的百日草叶片，进行RT-PCR反转录病毒检测，病毒检测的种类为烟草花叶病毒和黄瓜花叶病毒，若检测合格即百日草脱毒种苗。

实施例一

2012年采集百日草国产品种芳菲2号的嫩叶，按照本发明的技术路线进行脱毒，获得了优良的脱毒苗，其详细步骤和结果如下：

1）采集芳菲2号嫩叶，脱分化产生愈伤组织：

采集生长至现蕾期的健康无病的百日草品种芳菲2号的嫩叶，自来水洗净，流水冲洗30min，用70%酒精浸泡15s，0.1%升汞内加数滴吐温-20溶液浸泡15min，并用玻璃棒搅动，用无菌水冲洗4-5次，滤纸吸干，用孔直径4mm的打孔器打孔，将打下的叶片接种到愈伤诱导培养基（培养基配方为：MS+2.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+0.3g/LCH+3%蔗糖+6.0g/L琼脂，pH为5.8）上27℃条件下暗培养，暗培养15天后产生了愈伤组织，如图1；

2）将愈伤组织进行热处理，然后将愈伤组织继续诱导出不定芽，不定芽生根培养成健壮的组培苗：

继续暗培养5天，待愈伤进一步生长，然后将愈伤组织转移到培养箱中热处理，先在40℃高温处理7h、然后27℃低温处理12h，交替进行3循环后切除褐化块段后将愈伤组织转接到不定芽诱导培养基（培养基配方为：MS+0.5mg/LKT+1.5mg/LBA+0.5mg/LGA+3%蔗糖+7.0g/L琼脂，pH为5.8）上光培养，光照条件控制为光照强度为1800Lux、光周期为14h光/10h暗，20天左右愈伤组织分化出不定芽，如图2。继续培养8天待不定芽生长均匀，然后将再生出来的高度1cm以上的芽转接至生根培养基（培养基配方为：1/2MS+0.1mg/LIBA+1.5%蔗糖+7.0g/L琼脂，pH为5.8）27℃条件下光培养成健壮的组培苗；

3）进一步剥离组培苗茎尖，脱分化产生愈伤组织：

待组培苗生长至5cm-8cm，剥取0.4-0.6cm大小的茎尖生长点接种到茎尖诱导愈伤培养基上（培养基配方为：MS+2.0mg/L6-BA+1mg/LNAA+0.5mg/LKT+3%蔗糖，pH为5.8），在27℃条件下暗培养35天，诱导出愈伤组织，如图3；

4）再次将愈伤组织进行热处理后诱导成苗：

再次将茎尖愈伤组织进行热处理，热处理方法同步骤2），切除褐化块段后将愈伤组织转接到不定芽诱导培养基上（培养基配方为：MS+0.5mg/LKT+1.5mg/LBA+0.5mg/LGA+3%蔗糖+7.0g/L琼脂，pH为5.8），27℃条件下光培养，光照条件控制为照强度为1800Lux、光周期为12h光/12h暗，光培养23天后诱导出不定芽，如图4，然后转接入生根培养基（1/2MS+0.1mg/LIBA+1.5%蔗糖+7.0g/L琼脂，pH为5.8），45天后可得到健壮的百日草幼苗；

5）随机抽取步骤4）中的组培苗，进行病毒检测，若检测合格即百日草脱毒种苗，若不合格需重复1）到4）步，直到获得合格的百日草脱毒种苗：

随机抽取8-10只完成了步骤4）的的百日草叶片，进行RT-PCR反转录病毒检测，病毒检测的种类为烟草花叶病毒和黄瓜花叶病毒，若检测合格即百日草脱毒种苗，大田种植获得种性提高、农艺性状优良的百日草植株，如图5。

本发明通过采用综合脱毒技术，即两次愈伤组织诱导、愈伤组织热处理脱毒、茎尖脱毒相结合的方法，有效的克服了脱毒材料较多、脱毒操作流程繁琐、脱毒效率低下等难题，能够高效获得百日草脱毒幼苗。本发明创造性的采用了愈伤组织热处理的脱毒方法，采用本发明的愈伤组织热处理后，切割掉褐化部分，培养热处理后褐化程度不明显的愈伤部分，可有效除掉愈伤组织携带的病毒，大大提高了脱毒效率，而且减少了无菌操作，操作简单。本发明的百日草脱毒苗的获取方法采用茎尖诱导成愈伤，提高了百日草的种性，又进一步脱除了百日草病毒，该方法流程简单、容易操作，故易于形成规模化生产的脱毒种苗，适宜推广使用。

以上实施例仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明保护范围之内；本发明未涉及的技术均可通过现有技术加以实现。

Claims (10)

1.一种百日草脱毒苗的获取方法，其特征在于：该方法步骤如下：

1）采集百日草嫩叶，脱分化产生愈伤组织；

2）将愈伤组织进行热处理，然后将愈伤组织继续诱导出不定芽，不定芽生根培养成健壮的组培苗；

3）进一步剥离组培苗茎尖，脱分化产生愈伤组织；

4）再次将愈伤组织进行热处理后诱导成苗；

5）随机抽取步骤4）中的组培苗，进行病毒检测，若检测合格即百日草脱毒种苗，若不合格需重复1）到4）步，直到获得合格的百日草脱毒种苗。

2.根据权利要求1所述的百日草脱毒苗的获取方法，其特征在于：该方法的详细步骤如下：

1）采集百日草嫩叶，脱分化产生愈伤组织：

采集生长至现蕾期的健康无病的百日草的嫩叶，自来水洗净，流水冲洗30min，用70%酒精浸泡15s，0.1%升汞内加数滴吐温-20溶液浸泡15min，并用玻璃棒搅动，用无菌水冲洗4-5次，滤纸吸干，用孔直径4mm的打孔器打孔，将打下的叶片接种到愈伤诱导培养基上26-28℃条件下暗培养，15-20天产生愈伤组织；

2）将愈伤组织进行热处理，然后将愈伤组织继续诱导出不定芽，不定芽生根培养成健壮的组培苗：

将愈伤组织转移到培养箱中热处理，切除褐化块段后将愈伤组织转接到不定芽诱导培养基上光培养，20-30天后愈伤组织分化出不定芽，将再生出来的高度1cm以上的芽转接至生根培养基26-28℃条件下光培养成健壮的组培苗；

3）进一步剥离组培苗茎尖，脱分化产生愈伤组织：

待组培苗生长至5cm-8cm，剥取0.4-0.6cm大小的茎尖生长点接种到茎尖诱导愈伤培养基上，在26-28℃条件下暗培养30-45天，诱导出愈伤组织；

4）再次将愈伤组织进行热处理后诱导成苗：

再次将茎尖愈伤组织进行热处理，切除褐化块段后将愈伤组织转接到不定芽诱导培养基上，26-28℃条件下光培养20-30天后诱导出不定芽，然后转接入生根培养基，40-50天后可得到百日草幼苗；

5）随机抽取步骤4）中的组培苗，进行病毒检测，若检测合格即百日草脱毒种苗，若不合格需重复1）到4）步，直到获得合格的百日草脱毒种苗：

随机抽取8-10只完成了步骤4）的的百日草叶片，进行RT-PCR反转录病毒检测，若检测合格即百日草脱毒种苗。

3.根据权利要求1或2所述的百日草脱毒苗的获取方法，其特征在于：百日草品种选为芳菲1号、芳菲2号、芳菲3号。

4.根据权利要求1或2所述的百日草脱毒苗的获取方法，其特征在于：步骤1）中用于诱导百日草叶片产生愈伤组织的愈伤诱导培养基为：MS+2.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+0.3g/LCH+3%蔗糖+6.0g/L琼脂，pH为5.8。

5.根据权利要求1或2所述的百日草脱毒苗的获取方法，其特征在于：步骤2）中将将愈伤组织继续诱导出不定芽的不定芽诱导培养基为：MS+0.5mg/LKT+1.5mg/LBA+0.5mg/LGA+3%蔗糖+7.0g/L琼脂，pH为5.8；所述的生根培养基配方为：1/2MS+0.1mg/LIBA+1.5%蔗糖+7.0g/L琼脂，pH为5.8；所述的将愈伤组织诱导成苗的培养基的光照条件为：光照强度为1500-2000Lux，光周期为14h光/10h暗。

6.根据权利要求1或2所述的百日草脱毒苗的获取方法，其特征在于：步骤2）和步骤4）中热处理方法为：在38℃-42℃高温处理6h-8h、然后26℃-28℃低温处理10h-12h交替进行2-3循环。

7.根据权利要求1或2所述的百日草脱毒苗的获取方法，其特征在于：步骤3）中用于诱导茎尖产生愈伤组织的培养基配方为：MS+2.0mg/L6-BA+1mg/LNAA+0.5mg/LKT+3%蔗糖，pH为5.8。

8.根据权利要求1或2所述的百日草脱毒苗的获取方法，其特征在于：步骤4）中将愈伤组织诱导出不定芽的不定芽诱导培养基配方为：MS+0.5mg/LKT+1.5mg/LBA+0.5mg/LGA+3%蔗糖+7.0g/L琼脂，pH为5.8；生根培养基配方为：1/2MS+0.1mg/LIBA+1.5%蔗糖+7.0g/L琼脂，pH为5.8。

9.根据权利要求1或2所述的百日草脱毒苗的获取方法，其特征在于：步骤4）中将茎尖愈伤组织诱导不定芽的光照条件为：光照强度为1500-2000Lux，光周期为12h光/12h暗。

10.根据权利要求1或2所述的百日草脱毒苗的获取方法，其特征在于：步骤5）病毒检测的病毒种类为烟草花叶病毒和黄瓜花叶病毒。