CN102120981B - 一种牡丹原生质体的提取方法 - Google Patents

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本发明公开了一种牡丹原生质体的提取方法，首先诱导牡丹种子萌发，取5-10天的子叶和/或下胚轴，培养愈伤组织，培养过程中采用变温培养，即每天在0-10℃条件下暗培养8-10小时，在15-30℃条件下光照培养14-16小时；然后用酶液从愈伤组织中游离原生质体，再分离、提纯得到牡丹原生质体。本发明牡丹原生质体的提取方法，对牡丹种子的萌发及愈伤组织的培养采用变温培养，时常变温使组织细胞在冷热交替的刺激下，变得疏松易分散，有利于原生质体在游离过程中保持较高的活力，得到高活力的牡丹原生质体，最终提取得到的牡丹原生质体经染色法鉴别其活力在85%以上，适合采用突变、转基因和细胞融合等遗传操作诱导新品种。

Description

一种牡丹原生质体的提取方法
技术领域
本发明涉及一种牡丹原生质体的提取方法。
背景技术
牡丹为芍药科芍药属多年生落叶亚灌木，是我国传统名花，富丽堂皇，国色天香，自古就有富贵吉祥、繁荣昌盛的寓意，不仅是中国人民喜爱的花卉，而且也受到世界各国人民的珍爱。而且牡丹不仅有观赏价值，还具有很高的药用价值。
牡丹品种作为产业发展的基础，需要不断的推陈出新，培育出具有不同花色、花型、花香、花期的新品种，在提高牡丹观赏性的基础上，延长花期、耐湿热、抗干燥寒冷等特性，适合牡丹的园艺化栽培，适应现代化社会发展的需求。但是在牡丹新品种的培育过程中，传统的育种方法繁殖率低，周期长，品种选育定向性差，育种有效性低。目前，从植物中提取原生质体，以此为材料进行转基因和突变育种，是培育植物新品种的新方法，提取得到的原生质体由于去掉了细胞壁，每个细胞都有可能发育成一个植株，大大提高了其繁殖系数。但目前传统的原生质体提取方法应用在牡丹各类外植体上，提取困难或提取的原生质体活力较差，一般不超过60%，给牡丹转基因和突变育种工作造成了阻碍。
发明内容
本发明的目的是提供一种牡丹原生质体的提取方法，以提高牡丹原生质体的活力。
为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：一种牡丹原生质体的提取方法，其步骤如下：
1）取胚已进入成熟期的牡丹种子，酒精浸泡、灭菌，接种在pH为4.8-6.5的MS培养基中，诱导牡丹成熟胚萌发； 
2）取步骤1）萌发5-10天的子叶和/或下胚轴，切碎，接入pH为4.8-6.5的MS培养基中，变温培养连续继代两次以上，获得愈伤组织，所述变温培养即每天在0-10℃条件下暗培养8-10小时，在15-30℃条件下光照培养14-16小时； 
3）取步骤2）得到的愈伤组织，置于pH为4.8-6.5的酶液中18-28℃震荡12-16小时游离原生质体， 
4）将游离原生质体后的酶液用100-800目滤网过滤，滤液离心弃上清液，加入CaCl2洗液混匀，然后从溶液底部注入蔗糖溶液，离心取得处于中间部分的牡丹原生质体。
步骤1）所述MS培养基中含有6-苄基腺嘌呤（6-BA）0.1~1.0 mg/L，萘乙酸（NAA）0.05~1.0mg/L，蔗糖2-5%和琼脂0.7-0.8%；
步骤2）所述MS培养基中含有6-苄基腺嘌呤（6-BA）0.1~1.5 mg/L，2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）0.5~3 mg/L，蔗糖2-5%和琼脂0.6-0.8%；
步骤3）所述酶液为含有以下组分及含量的水溶液：纤维素酶1% ~ 3%，半纤维素酶0.5%~1%，果胶酶0.5% ~ 2%，甘露醇0.3-0.7 mol/L，2-（N-吗啡啉）乙磺酸（MES）0.05-0.3%，CaCl20.01-0.2 mol/L；
步骤4）所述蔗糖浓度为12-28%。 
本发明牡丹原生质体的提取方法，对牡丹愈伤组织的培养采用变温培养，培养的时常变温使组织细胞在冷热交替的刺激下，变得疏松易分散，有利于原生质体在游离过程中保持较高的活力，得到高活力的牡丹原生质体，最终提取得到的牡丹原生质体经染色法鉴别其活力在85%以上，适合采用突变、转基因和细胞融合等遗传操作诱导新品种；另外配合优选的酶液，在愈伤组织细胞质壁分离过程中，避免其活力损失。 
具体实施方式
实施例1
本实施例的牡丹原生质体提取方法如下步骤：
1）取胚已进入成熟期的牡丹种子，用70%的酒精浸泡30s，0.1%的氯化汞灭菌9分钟，接种在pH为4.8的MS培养基中，诱导牡丹成熟胚萌发，其中MS培养基中含有6-苄基腺嘌呤（6-BA）0.1mg/L，萘乙酸（NAA）0.05mg/L，蔗糖2%和琼脂0.7%；也可以采用常规的MS培养液；
2）取步骤1）萌发5天幼嫩的子叶，切成0.5cm片段，接入pH为4.8的MS培养基中，连续继代两次，获得有利于原生质体游离的松软易分散的愈伤组织，其中MS培养基中含有6-苄基腺嘌呤（6-BA）0.1 mg/L，2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）0.5mg/L，蔗糖2%和琼脂0.6%；也可以采用常规的MS培养液；其中愈伤组织的培养采用变温培养，即在1℃条件下暗培养8小时，在15℃条件下光照培养16小时；
3）取步骤2）得到的愈伤组织，置于pH为4.8的酶液中采用恒温摇床28℃震荡12小时游离原生质体，其中酶液为含有以下组分及含量的水溶液：纤维素酶1%，半纤维素酶0.5%，果胶酶0.5%，甘露醇0.3 mol/L，2-（N-吗啡啉）乙磺酸（MES）0.05%，CaCl2 0.01 mol/L；也可以采用常规的酶液；
4）将游离原生质体后的酶液用100目滤网过滤去除未消化的组织，滤液800rpm离心弃上清液，加入0.16 mol/L CaCl2洗液，轻轻混匀后，从溶液底部注入12%的蔗糖溶液，500 rpm离心，牡丹原生质体处于上部CaCl2洗液与下部蔗糖溶液之间，弃去上下溶液得到牡丹原生质体。
将取得的原生质体用0.1%酚藏花红溶液（在0.4 mol/L甘露醇中）染色法鉴别原生质体活力，获得牡丹原生质体活力达89%。
实施例2
本实施例的牡丹原生质体提取方法如下步骤：
1）取胚已进入成熟期的牡丹种子，用70%的酒精浸泡30s，0.1%的氯化汞灭菌9分钟，接种在pH为5.8的MS培养基中，诱导牡丹成熟胚萌发，其中MS培养基中含有6-苄基腺嘌呤（6-BA）0.5mg/L，萘乙酸（NAA）0.2mg/L，蔗糖3%和琼脂0.8%，也可以采用常规的MS培养液；；
2）取步骤1）萌发8天幼嫩的子叶和下胚轴，切成0.5cm片段，接入pH为5.8的MS培养基中，连续继代三次，获得有利于原生质体游离的松软易分散的愈伤组织，其中MS培养基中含有6-苄基腺嘌呤（6-BA）1.0 mg/L，2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）1.8 mg/L，蔗糖3%和琼脂0.7%，也可以采用常规的MS培养液；其中愈伤组织的培养采用变温培养，即在5℃条件下暗培养9小时，在23℃条件下光照培养14小时；
3）取步骤2）得到的愈伤组织，置于pH为5.8的酶液中采用恒温摇床22℃震荡14小时游离原生质体，其中酶液为含有以下组分及含量的水溶液：纤维素酶2%，半纤维素酶0.7%，果胶酶1.2%，甘露醇0.5 mol/L，2-（N-吗啡啉）乙磺酸（MES）0.2%，CaCl2 0.1 mol/L；也可以采用常规的酶液；
4）将游离原生质体后的酶液用400目滤网过滤去除未消化的组织，滤液800rpm离心弃上清液，加入0.16 mol/L CaCl2洗液，轻轻混匀后，从溶液底部注入22%的蔗糖溶液，500 rpm离心，牡丹原生质体处于上部CaCl2洗液与下部蔗糖溶液之间，弃去上下溶液得到牡丹原生质体。
将取得的原生质体用0.1%酚藏花红溶液（在0.4 mol/L甘露醇中）染色法鉴别原生质体活力，获得牡丹原生质体活力达87%。
实施例3
本实施例的牡丹原生质体提取方法如下步骤：
1）取胚已进入成熟期的牡丹种子，用70%的酒精浸泡30s，0.1%的氯化汞灭菌9分钟，接种在pH为6.5的MS培养基中，诱导牡丹成熟胚萌发，其中MS培养基中含有6-苄基腺嘌呤（6-BA）1.0mg/L，萘乙酸（NAA）1.0mg/L，蔗糖5%和琼脂0.75%；也可以采用常规的MS培养液；
2）取步骤1）萌发10天的下胚轴，切成0.5cm片段，接入pH为6.5的MS培养基中，连续继代两次，获得有利于原生质体游离的松软易分散的愈伤组织，其中MS培养基中含有6-苄基腺嘌呤（6-BA）1.5 mg/L，2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）3mg/L，蔗糖5%和琼脂0.8%；也可以采用常规的MS培养液；其中愈伤组织的培养采用变温培养，即在10℃条件下暗培养10小时，在30℃条件下光照培养15小时；
3）取步骤2）得到的愈伤组织，置于pH为6.5的酶液中采用恒温摇床18℃震荡16小时游离原生质体，其中酶液为含有以下组分及含量的水溶液：纤维素酶3%，半纤维素酶1.0%，果胶酶2%，甘露醇0.7mol/L，2-（N-吗啡啉）乙磺酸（MES）0.3%，CaCl2 0.2 mol/L；也可以采用常规的酶液；
4）将游离原生质体后的酶液用800目滤网过滤去除未消化的组织，滤液800rpm离心弃上清液，加入0.16 mol/L CaCl2洗液，轻轻混匀后，从溶液底部注入28%的蔗糖溶液，500 rpm离心，牡丹原生质体处于上部CaCl2洗液与下部蔗糖溶液之间，弃去上下溶液得到牡丹原生质体。
将取得的原生质体用0.1%酚藏花红溶液（在0.4 mol/L甘露醇中）染色法鉴别原生质体活力，获得牡丹原生质体活力达90%。

Claims (3)

1.一种牡丹原生质体的提取方法，其特征在于：其步骤如下：
1）取胚已进入成熟期的牡丹种子，酒精浸泡、灭菌，接种在pH为4.8-6.5的MS培养基中，诱导牡丹成熟胚萌发；
2）取步骤1）萌发5-10天的子叶和/或下胚轴，切碎，接入pH为4.8-6.5的MS培养基中，变温培养连续继代两次以上，获得愈伤组织，所述变温培养即每天在0-10℃条件下暗培养8-10小时，在15-30℃条件下光照培养14-16小时；本步骤所述MS培养基中含有6-苄基腺嘌呤（6-BA）0.1～1.5 mg/L，2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）0.5～3 mg/L，蔗糖2-5%和琼脂0.6-0.8%；
3）取步骤2）得到的愈伤组织，置于pH为4.8-6.5的酶液中18-28℃震荡12-16小时游离原生质体，所述酶液为含有以下组分及含量的水溶液：纤维素酶1%～3%，半纤维素酶0.5%～1%，果胶酶0.5%～2%，甘露醇0.3-0.7 mol/L，2-（N-吗啡啉）乙磺酸（MES）0.05-0.3%，CaCl20.01-0.2 mol/L；
4）将游离原生质体后的酶液用100-800目滤网过滤，滤液离心弃上清液，加入CaCl2洗液混匀，然后从溶液底部注入蔗糖溶液，离心取得处于中间部分的牡丹原生质体。
2.根据权利要求1所述的牡丹原生质体的提取方法，其特征在于：步骤1）所述MS培养基中含有6-苄基腺嘌呤（6-BA）0.1～1.0 mg/L，萘乙酸（NAA）0.05～1.0mg/L，蔗糖2-5%和琼脂0.7-0.8%。
3.根据权利要求1所述的牡丹原生质体的提取方法，其特征在于：步骤4）所述蔗糖浓度为12-28%。
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