CN108935107A - 一种甘蔗组织培养中外植体防褐化的方法 - Google Patents

一种甘蔗组织培养中外植体防褐化的方法 Download PDF

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杨本鹏
曹峥英
甘仪梅
张树珍
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Abstract

本发明公开了一种甘蔗组织培养中外植体防褐化的方法，将成熟甘蔗茎秆从上至下的9‑15位芽经消毒，用抗氧化剂浸泡后剥取茎尖分生组织得到外植体，将外植体以MS+6‑BA为基础培养基培养，即可有效抑制甘蔗外植体的褐化。本发明方法可有效防止甘蔗外植体褐化现象的产生，且不影响外植体的生长分化，是甘蔗健康种苗组织培养的一种有效方法。

Description

一种甘蔗组织培养中外植体防褐化的方法
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，具体地说，涉及一种甘蔗组织培养中外植体防褐化的方法。
背景技术
甘蔗原产于热带、亚热带地区，是重要的糖料及能源作物，每年世界上总产量80％的蔗糖和40％的乙醇原料均来自于甘蔗。甘蔗系无性繁殖宿根栽培作物，易受甘蔗花叶病，宿根矮化病及黄叶病等的病原物反复侵害，使得品种退化，产量及含糖量下降。为了使优良品种的种性得以恢复，构建了甘蔗综合脱毒技术体系，用此技术体系所示的方法所生产的甘蔗脱毒健康种苗可以完全脱除以上病原菌并使甘蔗增产20-40％，蔗糖含量提高0.5-1.0％。此项技术体系中，甘蔗的组织培养是甘蔗脱毒健康种苗生产成功与否的关键因素之一，但是在甘蔗组织培养的过程中，外植体褐化现象普遍存在，严重影响外植体分化，严重的甚至导致外植体死亡。
目前，甘蔗外植体防褐化技术研究的比较少，且多见于在培养基中添加抗氧化物质，从而降低外植体的褐化率。秦昌鲜等2011年在“防止甘蔗组织培养褐化初探”一文中提出，在培养基中添加生物素和硅酸钠，可推迟甘蔗外植体褐化出现时间，减轻褐化程度。吴转娣等2013年在“甘蔗胚性愈伤组织的诱导和抗褐化研究”中指出，在培养基中加入PVP或活性炭，能够有效减轻甘蔗组织的酚害，进而降低外植体褐化率。
发明内容
有鉴于此，本发明针对现有甘蔗组织培养过程中，外植体存在褐化现象的问题，提供了一种甘蔗组织培养中外植体防褐化的方法。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种甘蔗组织培养中外植体防褐化的方法，将成熟甘蔗茎秆从上至下的9-15位芽经消毒，用抗氧化剂浸泡后剥取茎尖分生组织得到外植体，将外植体以MS+6-BA为基础培养基培养，即可有效抑制甘蔗外植体的褐化。
进一步地，所述外植体的采集步骤包括：选取生长健壮、无病虫害的成熟甘蔗茎秆，剥去外叶鞘，截取从上至下9-15位间的单芽，52℃水浴30min后，38-40℃恒温培养，待腋芽长至8-12cm，将其切下，经消毒及抗氧化处理后，在无菌水或1％的无菌柠檬酸溶液中剥取茎尖1-2mm分生组织，即得到所述甘蔗外植体。
进一步地，所述消毒方法为：先用无菌水清洗1-2次，用滤纸吸干水分后放入体积浓度为70-75％酒精中浸泡0.5-1min，之后放入加有2-3d、0.1％吐温20的0.1％升汞溶液中处理10-15min，期间搅拌3-4次，最后用无菌水清洗3-4次。
进一步地，采用抗氧化剂浸泡时间为15-30min。
进一步地，所述抗氧化剂为聚乙烯吡咯烷酮、抗坏血酸、硫代硫酸钠、亚硫酸钠、柠檬酸或磷酸丁脂中的一种。
进一步地，所述MS+6-BA培养基为：将1mg/L6-BA加入到MS培养基中，调节pH至5.8，121℃下高压蒸汽灭菌20-25min即得。
进一步地，所述MS培养基为：硝酸钾1.9g/L，硝酸铵1.65g/L，七水合硫酸镁0.37g/L，磷酸二氢钾0.17g/L，氯化钙0.332g/L，四水合硫酸锰22.3mg/L，七水合硫酸锌8.6mg/L，硼酸6.2mg/L，碘化钾0.83mg/L，二水合钼酸钠0.25mg/L，五水合硫酸铜0.25mg/L，六水合氯化钴0.025mg/L，乙二胺四乙酸二钠3.73mg/L，七水合硫酸亚铁2.78mg/L，甘氨酸0.2mg/L，维生素B1 0.05mg/L，维生素B6 0.1mg/L，烟酸0.05mg/L，肌醇0.01g/L。
进一步地，所述6-BA为：6-苄基腺嘌呤1mg/L。
进一步地，所述培养的条件为：第1周为暗培养阶段：pH 5.8-6.0，光照强度0μmol/(m2.s)，温度28-30℃，第2周为光培养阶段：pH 5.8-6.0，光照强度100-120μmol/(m2.s)，光照时间12h/天，温度28-30℃。
与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
1)本发明采用MS+6-BA基础培养基，通过选择适宜的外植体，并对外植体进行预处理、常规消毒、抗氧化处理及培养条件优化后，可有效抑制甘蔗外植体褐化的产生，且对外植体的生长分化不会产生影响，是甘蔗脱毒健康种苗组织培养的一种有效方法。
2)本发明外植体在无菌水或1％柠檬酸溶液中进行剥离，可有效减少外植体与空气中氧气的接触，并使水溶性多酚和醌类物质充分渗出外植体，从源头减轻外植体在培养过程中的褐化。
3)本发明常规消毒过程中添加吐温-20，能有效增强消毒效果，避免因消毒不彻底而造成的外植体褐化及实验误差。
4)实验验证，在甘蔗组织培养过程中，经聚乙烯吡咯烷酮、抗坏血酸、硫代硫酸钠抗氧化剂处理后，不仅不影响甘蔗外植体的生长分化，而且还可有效防止甘蔗外植体褐化的产生，且甘蔗外植体褐化率可分别降低至12.2％、10.6％、12.4％。
5)本发明对外植体采用先暗培养后光培养的方式培养，能减弱酚类物质的合成及氧化酶的活性，可有效控制外植体的褐化。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
具体实施方式
以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
本发明所述甘蔗组织培养中外植体防褐化的方法，包括如下步骤：
选取生长健壮、无病虫害的成熟甘蔗茎秆，剥去外叶鞘，截取从上至下的9-15位间的单芽，52℃水浴30min后，放入培养箱中38-40℃恒温培养，待腋芽长至8-12cm，将其切下，先用无菌水清洗1-2次，用滤纸吸干水分后，依次用70-75％酒精处理0.5-1min、含2-3d、0.1％吐温20的0.1％升汞溶液处理10-15min，期间搅拌3-4次，后用无菌水清洗3-4次；然后放入抗氧化剂溶液中浸泡15-30min，取出晾干，在无菌水或1％无菌柠檬酸溶液中剥取茎尖1-2mm分生组织，即得甘蔗外植体；
将甘蔗外植体接种于MS+6-BA培养基中，在培养箱中进行培养，第1周为暗培养阶段，调节pH 5.8-6.0，光照强度0μmol/(m2.s)，温度28-30℃；第2周为光培养阶段：pH 5.8-6.0，光照强度100-120μmol/(m2.s)，光照时间12h/天，温度28-30℃。通过上述处理，可有效抑制甘蔗外植体褐化的产生。
MS培养基为：硝酸钾1.9g/L，硝酸铵1.65g/L，七水合硫酸镁0.37g/L，磷酸二氢钾0.17g/L，氯化钙0.332g/L，四水合硫酸锰22.3mg/L，七水合硫酸锌8.6mg/L，硼酸6.2mg/L，碘化钾0.83mg/L，二水合钼酸钠0.25mg/L，五水合硫酸铜0.25mg/L，六水合氯化钴0.025mg/L，乙二胺四乙酸二钠3.73mg/L，七水合硫酸亚铁2.78mg/L，甘氨酸0.2mg/L，维生素B10.05mg/L，维生素B6 0.1mg/L，烟酸0.05mg/L，肌醇0.01g/L；6-BA为：6-苄基腺嘌呤1mg/L。6-BA配制好后，直接加入到MS培养基中，调节pH至5.8，121℃下高压蒸汽灭菌20-25min，即得MS+6-BA培养基。
抗氧化剂为聚乙烯吡咯烷酮、抗坏血酸、硫代硫酸钠、亚硫酸钠、柠檬酸或磷酸丁脂等具有抗氧化功能物质中的一种。
本发明采用MS+6-BA基础培养基，通过选择适宜的外植体，并对外植体进行预处理、常规消毒、抗氧化处理及培养条件优化后，可有效抑制甘蔗外植体褐化的产生，且对外植体的生长分化不会产生影响，是甘蔗脱毒健康种苗组织培养的一种有效方法。
本发明外植体在无菌水或1％柠檬酸溶液中进行剥离，可有效减少外植体与空气中氧气的接触，并使水溶性多酚和醌类物质充分渗出外植体，从源头减轻外植体在培养过程中的褐化。
本发明常规消毒过程中添加吐温-20，能有效增强消毒效果，避免因消毒不彻底而造成的外植体褐化及实验误差。
本发明在甘蔗组织培养过程中，经聚乙烯吡咯烷酮、抗坏血酸、硫代硫酸钠抗氧化剂处理后，不仅不影响甘蔗外植体的生长分化，而且还可有效防止甘蔗外植体褐化的产生，且甘蔗外植体褐化率可分别降低至12.2％、10.6％、12.4％。
本发明对外植体采用先暗培养后光培养的方式培养，能减弱酚类物质的合成及氧化酶的活性，可有效控制外植体的褐化。
实施例1(以第9位芽为外植体，聚乙烯吡咯烷酮为抗氧化剂，来说明外植体防褐化的步骤)
选取生长健壮、无病虫害的成熟甘蔗茎秆，剥去外叶鞘，截取从上至下的第9位单芽，52℃水浴30min后，放入培养箱中40℃恒温培养。待腋芽长至8cm，将其切下。先用无菌水清洗1次，用滤纸吸干水分后，依次用70％酒精处理0.5min、含3d 0.1％吐温20的0.1％升汞溶液处理外植体10min，期间搅拌4次，后用无菌水清洗3次。之后放入0.35g/L聚乙烯吡咯烷酮溶液中浸泡15min，取出晾干，在无菌水中剥取茎尖1mm分生组织，即得甘蔗外植体；
将甘蔗外植体接种于MS+6-BA培养基中，在培养箱中培养，第1周为暗培养阶段，调节pH 5.8，光照强度0μmol/(m2.s)，温度28℃；第2周为光培养阶段：pH 5.8，光照强度100μmol/(m2.s)，光照时间12h/天，温度28℃。通过上述处理，可有效抑制甘蔗外植体褐化的产生。
MS培养基为：硝酸钾1.9g/L，硝酸铵1.65g/L，七水合硫酸镁0.37g/L，磷酸二氢钾0.17g/L，氯化钙0.332g/L，四水合硫酸锰22.3mg/L，七水合硫酸锌8.6mg/L，硼酸6.2mg/L，碘化钾0.83mg/L，二水合钼酸钠0.25mg/L，五水合硫酸铜0.25mg/L，六水合氯化钴0.025mg/L，乙二胺四乙酸二钠3.73mg/L，七水合硫酸亚铁2.78mg/L，甘氨酸0.2mg/L，维生素B10.05mg/L，维生素B6 0.1mg/L，烟酸0.05mg/L，肌醇0.01g/L；6-BA为：6-苄基腺嘌呤1mg/L。6-BA配制好后，直接加入到MS培养基中，调节pH至5.8，121℃下高压蒸汽灭菌25min，即得MS+6-BA培养基。
实施例2(以第12位芽为外植体，抗坏血酸为抗氧化剂，来说明外植体防褐化的步骤)
选取生长健壮、无病虫害的成熟甘蔗茎秆，剥去外叶鞘，截取从上至下的第12位单芽，52℃水浴30min后，放入培养箱中39℃恒温培养，待腋芽长至10cm，先用无菌水清洗2次，用滤纸吸干水分后，依次用75％酒精处理1min、含2d 0.1％吐温20的0.1％升汞溶液处理12min，期间搅拌3次，后用无菌水清洗4次。之后放入0.50g/L抗坏血酸溶液中浸泡20min，取出晾干，在1％柠檬酸溶液中剥取茎尖1.5mm分生组织，即得甘蔗外植体；
将甘蔗外植体接种于MS+6-BA培养基中，在培养箱中培养，第1周为暗培养阶段，调节pH 5.9，光照强度0μmol/(m2.s)，温度30℃；第2周光培养阶段：pH 5.9，光照强度110μmol/(m2.s)，光照时间12h/天，温度30℃。通过上述处理，可有效抑制甘蔗外植体褐化的产生。
MS培养基为：硝酸钾1.9g/L，硝酸铵1.65g/L，七水合硫酸镁0.37g/L，磷酸二氢钾0.17g/L，氯化钙0.332g/L，四水合硫酸锰22.3mg/L，七水合硫酸锌8.6mg/L，硼酸6.2mg/L，碘化钾0.83mg/L，二水合钼酸钠0.25mg/L，五水合硫酸铜0.25mg/L，六水合氯化钴0.025mg/L，乙二胺四乙酸二钠3.73mg/L，七水合硫酸亚铁2.78mg/L，甘氨酸0.2mg/L，维生素B10.05mg/L，维生素B6 0.1mg/L，烟酸0.05mg/L，肌醇0.01g/L；6-BA为：6-苄基腺嘌呤1mg/L。6-BA配制好后，直接加入到MS培养基中，调节pH至5.8，121℃下高压蒸汽灭菌22min，即得MS+6-BA培养基。
实施例3(以第15位芽为外植体，硫代硫酸钠为抗氧化剂，来说明外植体防褐化的步骤)
从田间选取生长健壮、无病虫害的成熟甘蔗茎秆，剥去外叶鞘，截取从上至下的第15位单芽，52℃水浴30min后，放入培养箱中38℃恒温培养。待腋芽长至12cm，将其切下。先用无菌水清洗2次，用滤纸吸干水分后，依次用72％酒精处理0.8min、含2.5d 0.1％吐温20的0.1％升汞溶液处理15min，期间搅拌3次，后用无菌水清洗3次。之后放入0.15g/L硫代硫酸钠溶液中浸泡30min，取出晾干，在无菌水中剥取茎尖2mm分生组织，即得甘蔗外植体。
将甘蔗外植体接种于MS+6-BA培养基中，在培养箱中培养，第1周为暗培养阶段，调节pH6.0，光照强度0μmol/(m2.s)，温度29℃；第2周为光培养阶段：pH6.0，光照强度120μmol/(m2.s)，光照时间12h/天，温度29℃。通过上述处理，可有效抑制甘蔗外植体褐化的产生。
MS培养基为：硝酸钾1.9g/L，硝酸铵1.65g/L，七水合硫酸镁0.37g/L，磷酸二氢钾0.17g/L，氯化钙0.332g/L，四水合硫酸锰22.3mg/L，七水合硫酸锌8.6mg/L，硼酸6.2mg/L，碘化钾0.83mg/L，二水合钼酸钠0.25mg/L，五水合硫酸铜0.25mg/L，六水合氯化钴0.025mg/L，乙二胺四乙酸二钠3.73mg/L，七水合硫酸亚铁2.78mg/L，甘氨酸0.2mg/L，维生素B10.05mg/L，维生素B6 0.1mg/L，烟酸0.05mg/L，肌醇0.01g/L；6-BA为：6-苄基腺嘌呤1mg/L。6-BA配制好后，直接加入到MS培养基中，调节pH至5.8，121℃下高压蒸汽灭菌20min，即得MS+6-BA培养基。
下面结合具体的实验方案对本发明的技术效果进行说明：
实验设计6个处理，每个处理3个重复，具体如下：
处理1：实施例1
CK1：以无菌水替代抗氧化剂，其余操作同实施例1
处理2：实施例2
CK2：以无菌水替代抗氧化剂，其余操作同实施例2
处理3：实施例3
CK3：以无菌水替代抗氧化剂，其余操作同实施例3
将选取好的甘蔗外植体按实验设计进行不同处理，之后接种于MS+6-BA培养基中，常规培养2周后，观察外植体生长状况，测定外植体褐化率，统计数据见表1。
甘蔗外植体生长状况判断标准：
很好：外植体，即甘蔗生长点转浓绿色，基部显著膨大有明显芽点，心叶萌发并且抽高；
良好：外植体，即甘蔗生长点转绿，基部膨大，芽点不明显，心叶萌发；
一般：外植体，即甘蔗生长点转绿，基部膨大不明显，未见芽眼萌动，心叶萌发。
褐化率＝褐化的芽数×100％/接种芽总数
表1 不同实施例处理后甘蔗外植体生长状况及防褐化情况
由表1可知，经本发明实施例1、2、3处理后，外植体褐化率及生长状况均比对照的好，且实施例外植体褐化率分别为12.2％、10.6％、12.4％。说明一定程度上外植体用本发明实施例处理后，可有效降低外植体褐化率，且对外植体生长无不良影响。
上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。

Claims (9)

1.一种甘蔗组织培养中外植体防褐化的方法，其特征在于，将成熟甘蔗茎秆从上至下的9-15位芽经消毒，用抗氧化剂浸泡后剥取茎尖分生组织得到外植体，将外植体以MS+6-BA为基础培养基培养，即可有效抑制甘蔗外植体的褐化。
2.根据权利要求1所述的甘蔗组织培养中外植体防褐化的方法，其特征在于，所述外植体的采集步骤包括：选取生长健壮、无病虫害的成熟甘蔗茎秆，剥去外叶鞘，截取从上至下9-15位间的单芽，52℃水浴30min后，38-40℃恒温培养，待腋芽长至8-12cm，将其切下，经消毒及抗氧化处理后，在无菌水或1％的无菌柠檬酸溶液中剥取茎尖1-2mm分生组织，即得到所述甘蔗外植体。
3.根据权利要求1或2所述的甘蔗组织培养中外植体防褐化的方法，其特征在于，所述消毒方法为：先用无菌水清洗1-2次，用滤纸吸干水分后放入体积浓度为70-75％酒精中浸泡0.5-1min，之后放入加有2-3d、0.1％吐温20的0.1％升汞溶液中处理10-15min，期间搅拌3-4次，最后用无菌水清洗3-4次。
4.根据权利要求3所述的甘蔗组织培养中外植体防褐化的方法，其特征在于，采用抗氧化剂浸泡时间为15-30min。
5.根据权利要求3所述的甘蔗组织培养中外植体防褐化的方法，其特征在于，所述抗氧化剂为聚乙烯吡咯烷酮、抗坏血酸、硫代硫酸钠、亚硫酸钠、柠檬酸或磷酸丁脂中的一种。
6.根据权利要求1所述的甘蔗组织培养中外植体防褐化的方法，其特征在于，所述MS+6-BA培养基为：将1mg/L 6-BA加入到MS培养基中，调节pH至5.8，121℃下高压蒸汽灭菌20-25min即得。
7.根据权利要求1或6所述的甘蔗组织培养中外植体防褐化的方法，其特征在于，所述MS培养基为：硝酸钾1.9g/L，硝酸铵1.65g/L，七水合硫酸镁0.37g/L，磷酸二氢钾0.17g/L，氯化钙0.332g/L，四水合硫酸锰22.3mg/L，七水合硫酸锌8.6mg/L，硼酸6.2mg/L，碘化钾0.83mg/L，二水合钼酸钠0.25mg/L，五水合硫酸铜0.25mg/L，六水合氯化钴0.025mg/L，乙二胺四乙酸二钠3.73mg/L，七水合硫酸亚铁2.78mg/L，甘氨酸0.2mg/L，维生素B1 0.05mg/L，维生素B6 0.1mg/L，烟酸0.05mg/L，肌醇0.01g/L。
8.根据权利要求7所述的甘蔗组织培养中外植体防褐化的方法，其特征在于，所述6-BA为：6-苄基腺嘌呤1mg/L。
9.根据权利要求8所述的甘蔗组织培养中外植体防褐化的方法，其特征在于，所述培养的条件为：第1周为暗培养阶段：pH 5.8-6.0，光照强度0μmol/(m2.s)，温度28-30℃，第2周为光培养阶段：pH5.8-6.0，光照强度100-120μmol/(m2.s)，光照时间12h/天，温度28-30℃。
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