CN103782911A - 一种蝴蝶兰体细胞胚发生同步化调控方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种把抗氧化剂应用在蝴蝶兰体细胞胚发生同步化调控方法。以蝴蝶兰组培类原球茎切块为外植体，(1)诱导初始，在常规培养基附加细胞分裂素、高浓度高渗物质。(2)在外植体出现胚性母细胞阶段，转入含细胞分裂素、高浓度高渗物质及抗氧化剂的培养基。(3)培养得到胚性愈伤组织块时，转入无细胞分裂素、较低浓度高渗物质、附加抗氧化剂培养基培养。(4)培养得到幼嫩类原球茎时，转入无细胞分裂素、不附加高渗物质、仍附加抗氧化剂培养基培养。(5)继续培养可得到大小、成熟度较一致的类原球茎，同步化约80％。本发明具有操作简便，成本低，对植物材料没有副作用的优点。

Description

一种蝴蝶兰体细胞胚发生同步化调控方法

技术领域

本发明属于农林领域的园艺植物种苗繁殖生物技术，具体涉及一种蝴蝶兰体细胞胚发育同步化的调控方法。

背景技术

植物体细胞胚胎发生是研究植物细胞全能性和胚胎发生机制的重要系统，同步化的体细胞胚发生体系，是研究其生理、生物化学和分子生物学等问题所必需的。在生产实践中，要利用体细胞胚胎发生这种有效的离体繁殖方式，真正实现工厂化和标准化生产，也需实现体细胞胚发生的同步化，在人工种子研制方面，获得形态上、成熟度相似的同步体细胞胚，是人工种子自动化生产，机械化播种，发芽整齐的重要前提。此外，体细胞胚是许多植物优良的遗传转化受体系统，是优良品系获得和大量扩繁的较好方式。目前已从多种植物中成功诱导出体细胞胚并获得大量再生植株，但体细胞胚发生的不同步化仍是需要解决难题之一。蝴蝶兰组培类原球茎是体细胞胚的表现形式已经得到普遍认同，类原球茎在生产实践中具有相当大的应用潜力，采用类原球茎继代扩繁，繁殖系数比目前广泛采用丛生芽扩繁方式高得多，适合新品种迅速占领市场和工厂化大规模生产。类原球茎是蝴蝶兰人工种子制作的理想材料，类原球茎本身富含营养物质，免去人工胚乳，简化制作工艺，类原球茎表皮厚有蜡质层，较好抵御病菌感染，有望提高成活率。常规蝴蝶兰类原球茎发育同步化约60％，无法满足其在基础理论研究和生产实践的要求。

为了能够获得大量发育阶段一致的体胚，研究人员们采用了一系列的方法对同一发育阶段的体细胞胚进行机械分离和体胚发生的同步化控制。在取得的少量成果中，实用性成果较少，国内专利“一种霍山石斛体细胞胚发生的方法”(公开号：CN102246697A)，采用过筛法或饥饿法(用无铁盐的MS培养基)同步化增殖培养，得同步化的霍山石斛体细胞胚。“一种同步化调控针叶树体细胞胚发生方法及其培养基”(公开公告号：CN101633903)，将继代后的胚性细胞系接种于优化增殖培养基中，控制摇床转速为110±30转／分钟，在23±5℃温度、暗培养条件下，增殖获得同步化的胚性细胞系。“一种提高水曲柳体细胞胚发育同步化的方法”(公开号CN101503671A)，将球形体细胞胚接种于同步化调控培养基(1／2MS为基本培养基，包含20000～50000mg的蔗糖和6000～7000mg的琼脂，pH值为5.8)中，在温度为22～30℃、湿度为60％～70％、每20～30天更换新鲜培养基，无光照条件下培养40～60天，成熟体细胞胚发育的一致性达80％以上。专利“杂交鹅掌楸体胚发生同步化控制方法”(公开号：CN102037896A)，用过筛法将各级胚状体分级培养，半固体成熟培养基配方为：MS培养基，2～10mg·L-1ABA，2g·L-1AC，100mg·L-1CH，40g·L-1蔗糖，5g·L-1琼脂；或液体培养基(MS培养基，2～10mg·L-1ABA，100mg·L-1CH，40g·L-1蔗糖)培养，得到同步的成熟胚，在球形胚发育同步率达90％左右，心形及鱼雷形胚阶段同步化率为40％左右。关于蝴蝶兰体胚发生同步化控制方法尚未见报道和专利。

上述体细胞同步发生调控方法，机械过筛法操作繁琐、污染率高，适用于液体悬浮培养体细胞胚，细胞营养饥饿对细胞伤害较大，从资料上来看优化增殖培养基或改进培养条件不是体胚发生同步化控制的主要方法。

发明内容

目前已知植物体细胞同步发生调控方法有物理、化学的多种方法，但都无一例外的同时或交叉使用两种或两种以上方法进行同步发生调控才能取得较满意的效果。本发明的调控原理是根据(1)蝴蝶兰外植体在较高浓度细胞分裂素才能诱导出幼嫩类原球茎(团)，随后可在较低浓度或无细胞分裂素的培养基继续发育至成熟。(2)蝴蝶兰外植体诱导前期需要较高的氧化胁迫水平，外植体分化出胚性母细胞(培养第11-18天)后的进一步发育需要较低的氧化胁迫水平。(3)植物诱导胚性母细胞到其发育成球形胚、梨形胚到最后成熟胚整个过程，所需培养环境的渗透压相应逐渐降低。所以本发明在蝴蝶兰体细胞胚诱导、生长、成熟过程的不同阶段，在培养基添加抗氧化剂，高渗物质(甘露醇等)来调控体细胞胚同步发生节奏，达到同步调控蝴蝶兰体胚发生发育的目的。

本发明提供的技术方案如下：

一种蝴蝶兰体细胞胚发育同步化的调控方法，

步骤1：以蝴蝶兰组培类原球茎切块为外植体，初始培养基添加细胞分裂素、高浓度高渗物质。

步骤2：培养约第18天(出现胚性母细胞)，转入含细胞分裂素、维持较高浓度高渗物质、添加抗氧化剂的培养基。

步骤3：在第30天得到愈伤组织块，显微观察到表面有幼嫩球形胚，愈伤组织转入无细胞分裂素、低浓度高渗物质，仍添加抗氧化剂培养基。

步骤4：第60天得到幼嫩类原球茎，显微观察为梨形胚，幼嫩类原球茎转入无高渗物质，无细胞分裂素，仍含抗氧化剂培养基，

步骤5：再培养约一个月得到成熟的类原球茎，可较理想实现类原球茎大小和成熟的同步化(约80％)。

本发明采用的高渗物质、抗氧化剂对植物材料没有毒副作用，无须特别仪器，成本低廉，操作简便，适合固体培养基，仅进行常规组培操作就能达到同步化目的。

附图说明

图1：步骤2得到胚性母细胞解剖图(培养第18天)

图2：步骤3得到胚性愈伤组织，表面有幼嫩球形胚(培养第30天)

图3：步骤4得到幼嫩类原球茎，显微观察为梨形胚(培养第60天)

图4：步骤5得到单个成熟胚解剖图(培养第90天)

图5.步骤5得到同步发育成熟的类原球茎(培养第90天)。

具体实施方式

1.蝴蝶兰类原球茎切块外植体的初始诱导：培养基为1／2MS(大量元素)+5mg/L6-BA+12g／L甘露醇+20％椰子汁+2％蔗糖，pH5.8，常规高压灭菌。蝴蝶兰成熟类原球茎在超净台切为3-5块，接入培养基，培养温度24～26℃，光照强度1500lx左右，光照12h·d-1。

2.培养第11-18天，显微观察可看见培养物出现大量胚性母细胞，在第18天转接，培养基为1／2MS(大量元素)+5.0mg/L6-BA+12g/L甘露醇+20％椰子汁+2％蔗糖，高压灭菌，按每升培养基附加100mg维生素C和100mg半胱氨酸的量配成水溶液，在超净工作台过滤除菌，在培养基冷凝前加入，调pH至5.6。接种培养物，培养温度24～26℃，光照强度1500lx左右，光照12h·d-1。

3.在第30天得到愈伤组织块，显微观察可看见幼嫩球形胚，转接培养，培养基为1／2MS(大量元素)+6g/L甘露醇+20％椰子汁+2％蔗糖，高压灭菌，按每升培养基附加100mg维生素C和100mg半胱氨酸的量配成水溶液，在超净工作台过滤除菌，在培养基冷凝前加入，调pH至5.6。接种愈伤组织，培养温度24～26℃，光照强度1500lx左右，光照12h·d-1。

4.愈伤组织块培养30天可见幼嫩类原球茎团，转接培养基1／2MS(大量元素)+20％椰子汁+2％蔗糖培养基，高压灭菌，按每升培养基附加100mg维生素C和100mg半胱氨酸的量配成水溶液，在超净工作台过滤除菌，在培养基冷凝前加入，调pH至5.6。接种幼嫩类原球茎团，培养温度24～26℃，光照强度1500lx左右，光照12h·d-1。

5.培养30天，得到成熟的类原球茎团，大小与成熟度较为一致，同步率80％以上。

Claims (5)

1.本发明公开了一种将抗氧化剂应用于蝴蝶兰体细胞胚发生同步化调控方法。

2.如权利要求1所述的蝴蝶兰体细胞胚发生同步化调控方法，其步骤为，(1)以蝴蝶兰类原球茎切块为外植体，初始诱导在常规培养基添加5mg/L6-BA、甘露醇12g／L。(2)培养18天左右外植体出现胚性母细胞，将培养物转接到附加甘露醇12g／L，添加抗氧化剂的培养基。(3)第30天得到胚性愈伤组织块时，转入附加5mg/L6-BA、甘露醇6g/L及抗氧化剂的培养基培养。(4)约第60天得到幼嫩类原球茎，转入无激素(6-BA)、无附加甘露醇，仍附加抗氧化剂培养基。(5)继续培养可得到大小、成熟度较一致的类原球茎，同步化约80％。

3.如权利要求2所述的一种蝴蝶兰体细胞胚发生同步化调控方法，其特征在于：培养基添加的抗氧化剂不与培养基成分化学反应，至少包括以下合成或天然物质：亚硫酸钠、亚硒酸钠、维生素C(抗坏血酸)、半胱氨酸、谷胱甘肽、维生素E、丁基羟基茴香醚(BHA)、二丁基羟基甲苯(BHT)、类胡萝卜素，应用时可选一种或数种组合。

4.如权利要求3所述的一种蝴蝶兰体细胞胚发生同步化调控方法，其特征在于培养基添加抗氧化剂，固体抗氧化剂亚硫酸钠、亚硒酸钠、维生素C(抗坏血酸)、半胱氨酸、谷胱甘肽、丁基羟基茴香醚(BHA)、二丁基羟基甲苯(BHT)、类胡萝卜素的一种或数种组合用量合计为100-300mg／L培养基，液体维生素E用量为1-3ml／L培养基。

5.如权利要求3所述的一种蝴蝶兰蝴蝶兰体细胞胚发生同步化调控方法，其特征在于抗氧化剂亚硫酸钠、亚硒酸钠溶入培养基一起高压灭菌。维生素C(抗坏血酸)、半胱氨酸、谷胱甘肽配成水溶液在超净工作台过滤除菌，加入未冷凝的已高压灭菌培养基。维生素E、丁基羟基茴香醚(BHA)、二丁基羟基甲苯(BHT)、类胡萝卜素融入吐温20，维生素E与吐温20体积比为1∶1，丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯、类胡萝卜索与吐温20重量体积比为1∶2(g：ml)，再加入培养基一起高压灭菌。

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