CN111528091A - 一种富贵竹茎尖脱毒快繁的方法 - Google Patents

一种富贵竹茎尖脱毒快繁的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种富贵竹茎尖脱毒快繁的方法。本发明具体包括如下步骤：（1）减毒苗的准备；（2）材料消毒；（3）材料暗处理；（4）丛生芽诱导；（5）脱毒苗（Badnavirus）病毒的检测；（6）丛生芽的继代增殖；（7）生根培养；（8）炼苗；（9）材料移栽。本发明提出了富贵竹的茎尖的脱毒快繁技术，具有操作简单，成本低，在短时间内高效获得大量优质脱毒苗，避免无性扦插繁殖所带来品种退化，为大规模工厂化育苗提供一种有效途径。

Description

一种富贵竹茎尖脱毒快繁的方法
技术领域
本发明涉及观赏花卉快繁育种领域，具体是一种富贵竹茎尖脱毒快繁的方法。
背景技术
富贵竹为龙舌兰科龙血树属常绿灌木状植物，又称“万年竹”“转运竹”、“开运竹”、“幸运竹（lucky bamboo）”等，原产非洲刚果，因其形态似竹，造型独特，形式多样，富有竹韵，高贵典雅，观赏价值高，寓意吉祥、平安、富贵和奋发向上，深受人们喜爱。
现有的富贵竹品种已种植20多年，遗传多样性贫乏，没有进行提纯复壮，种性退化严重，品种单一；加之连作严重，且随着这几年常见的叶斑病、炭疽病、根腐病等真菌性病害，使得富贵竹产业发展形势严峻。曾几何时，茎干粗壮、叶片肥厚、油光浓绿、生机勃勃的富贵竹已不复存在，随处可见的是七零八落的衰败景象和条纹、枯斑、白化、霉变、腐烂等加工产品的各种瑕疵。
近年来更是出现了一种对富贵竹种植产业产生致命病害的Badnavirus病毒。例如陈秀等(2009)报道了我国湖北地区的富贵竹中发现了一种属于Badnavirus病毒的杆状DNA病毒富贵竹斑驳病毒。富贵竹感染了该病毒的症状主要表现为富贵竹叶片早期呈不规则退绿斑驳，叶尖稍有卷曲，后期发展为叶片脉明、叶色不均匀形成绿岛、叶片发黄及植株生长缓慢等，严重影响了富贵竹的产业发展。研究表明，Badnavirus病毒的远距离传播主要是通过无性繁殖材料经人类生产活动进行扩散传播，自然界中由媒介昆虫等以半持久的方式传播，有些还可经过种传或经花粉传播（Phillis et all.，1999）。
随着富贵竹产业的发展，在种植大田和加工车间都检测到Badnavirus病毒，这种病毒危害正在逐年加剧，应引起大家高度重视。在现有报道中，未见涉及富贵竹茎尖脱毒快繁的相关技术。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种富贵竹茎尖脱毒快繁的方法。
本发明的技术方案如下：一种富贵竹茎尖脱毒快繁的方法，包括如下步骤：
（1）减毒苗的准备：取健康富贵竹竹茎，剪取10-20cm，在45-58℃恒温培养，形成侧芽；
（2）材料消毒：将步骤（1）培养的侧芽切下，去掉叶片和叶鞘，洗净，依次用75%的酒精、次氯酸钠溶液振荡消毒，然后用无菌水冲洗干净；
（3）材料暗处理：将步骤（2）洗净的材料中接触到酒精、次氯酸钠溶液的部分切除，并去除老叶，纵切两半，将横截面接种于暗处理培养基MS+2,4-D 0.5-2.0 mg/L，进行暗处理；
（4）丛生芽诱导：将经过暗处理的材料接种到MS+BA 1.0-5.0mg/L+NAA 0.1-0.5mg/L培养基中进行诱导培养，形成丛生芽；
（5）脱毒苗病毒的检测：取丛生芽组织体进行Badnavirus病毒的检测，选择无毒丛生芽，准备进行继代增殖；
（6）丛生芽的继代增殖：在无菌条件下，将步骤（5）获得的无毒丛生芽自然分开成单株或多株，接种于含MS+BA 1.0-5.0mg/L+NAA 0.1-0.5mg/L的培养基中，待长成丛芽后再次继代；
（7）生根培养：将步骤（6）得到的采用固体培养基1/2MS+ NAA 0.5 mg/L+活性炭0.5 g/L进行生根培养；
（8）炼苗：当步骤（7）获得的组培苗假茎高4~5cm，并且发达根系后，移出培养室，在过渡室内将瓶盖除去炼苗，于假植前2～3d进行，得到丛苗；
（9）材料移栽：假植前，把丛苗取出，用清水冲洗净培养基，然后移到育苗盘，马上淋足定根水，然后用遮阳网遮盖。
优选的，步骤（1）所述恒温培养条件为：先以恒温箱温度50±2℃，处理30±5min，然后再恒温培养5-6周。
进一步优选的，所述恒温培养的条件是：恒温箱温度38±1℃，光照强度3000lux。
优选的，步骤（2）所述材料消毒的方式是：将侧芽切下，去掉叶片和叶鞘，用无菌水冲洗干净，接着用75%的酒精浸泡处理30 s，然后放到2%的次氯酸钠溶液振荡20 min，最后用无菌水冲洗3~5次至无泡沫产生。
优选的，步骤（3）所述暗处理时间为3-4d。
优选的，步骤（4）所述接种后培养40～45d。
优选的，步骤（5）所述病毒的检测采用PCR检测方法。
优选的，步骤（6）所述丛生芽的继代增殖，具体是：在无菌条件下将丛生芽自然分开成单株或多株，接种于含MS+BA 1.0-5.0mg/L+NAA 0.1-0.5mg/L的培养基中，待长成丛芽后再次继代，20～25d继代1次。
优选的，步骤（7）中，生根培养条件是：光照强度3000lux，25~28℃温度下培养15~20d。
进一步的，假植前把丛苗从培养瓶中取出，用清水冲洗净培养基，然后移到进口芬兰诺万播基质NOVARBO培养土32孔育苗盘（规格：上口5.8 cm×高5.0 cm×底部3.0 cm），马上淋足定根水，然后用遮阳网遮盖，以防止太阳曝晒。
本发明相对于现有技术的有益效果在于：现有富贵竹种植是采用无性扦插方法，长期使用这种方法，未进行脱毒处理，一旦感染病毒会造成富贵竹积累大量病毒，品种退化严重，会阻碍富贵竹产业可持续发展。本发明提出了富贵竹的茎尖的脱毒快繁技术，通过特定条件下的预处理、诱导、增殖、生根培养等步骤，同其他植物脱毒技术相比，本发明取不含病毒或病毒含量很少的茎尖作为外植体，采用热处理，能够钝化病毒活性使其失去侵染能力，辅以后续的处理步骤，可有效去除富贵竹病毒；本发明采用恒温光照培养之后再进行暗处理的方式，通过预处理可以加速富贵竹细胞分生组织细胞分裂，能够较易诱导出富贵竹愈伤组织，加快丛生芽生长，实现在短时间内高效获得大量优质脱毒苗。本发明具有操作简单，成本低的特点。同时，也可以采用本发明方法大量繁殖新品种，为大规模工厂化育苗提供一种有效途径。
附图说明
图1 是富贵竹茎尖外植体准备。
图2 是富贵竹茎尖外植体暗处理。
图3 是诱导丛生芽情况。
图4 是丛生芽病毒检测情况，其中，图片泳道M：DL 2000 marker；泳道1：病毒株扩增产物；泳道2~11：丛生芽扩增产物；扩增病毒序列：6-FP：5′ ACTCGTTCGGGTACATGCTC 3′；6-RP：5′CGTGAGGTTTCCCACGATAGT 3′。图5是无毒丛生芽继代情况。
图6是材料移栽前和生长情况，其中，图a是移栽前清洗后丛苗图片；图b是移栽后生长图片。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。
实施例1 采用如下步骤实现本发明：
（1）减毒苗的准备：从种植大田取回健康富贵竹，将富贵竹茎剪成10-15 cm茎段，用52℃恒温箱处理30 min，在38℃恒温、光照培养箱条件下培养5-6周形成侧芽；如图1所示；
（2）材料消毒：将侧芽切下，去掉叶片和叶鞘，用无菌水冲洗干净，接着用75%的酒精浸泡处理30 s，然后放到2%的次氯酸钠溶液振荡20 min，最后用无菌水冲洗3~5次至无泡沫产生；
（3）材料暗处理：将接触到消毒液的部分切掉，切至距离生长点1 cm处，把外面的老叶轻轻剥掉，纵切两半，将横截面接种于暗处理培养基MS+2,4-D 0.5-2.0 mg/L，进行3d暗处理，如图2所示；
（4）丛生芽诱导：经暗处理，接种到MS+BA1.0-5.0mg/L+NAA 0.1-0.5mg/L培养基中， 40～45d后形成丛生芽（图3）；
（5）脱毒苗（Badnavirus）病毒的检测：取丛芽组织体进行病毒检测，经PCR检测后，选择无毒丛生芽进行继代增殖；丛生芽病毒检测情况如图4所示，其中，图片泳道M：DL 2000marker；泳道1：病毒株扩增产物；泳道2~11：丛生芽扩增产物；扩增病毒序列：6-FP：5′ACTCGTTCGGGTACATGCTC 3′；6-RP：5′CGTGAGGTTTCCCACGATAGT 3′；
（6）丛生芽的继代增殖：在无菌条件下将丛生芽自然分开成单株或多株，接种于含MS+BA 1.0-5.0mg/L+NAA 0.1-0.5mg/L的培养基中，待长成丛芽后再次继代，20～25d继代1次；无毒丛生芽继代情况如图5所示；
（7）生根培养：采用固体培养基1/2MS+ NAA 0.5 mg/L+活性炭0.5 g/L进行生根培养，在光照充足，25~28℃温度下培养15~20d；
（8）炼苗：当组培苗假茎高4~5cm，并且发达根系后，将培养瓶移出培养室，在过渡室内将瓶盖除去炼苗，于假植前2～3d进行；
（9）材料移栽：假植前把丛苗从培养瓶中取出，用清水冲洗净培养基，然后移到进口芬兰诺万播基质NOVARBO培养土32孔育苗盘（规格：上口5.8 cm×高5.0 cm×底部3.0 cm），马上淋足定根水，然后用遮阳网遮盖，以防止太阳曝晒；材料移栽前和生长情况如图6所示。
实施例2 采用如下步骤实现本发明：
（1）减毒苗的准备：取健康富贵竹竹茎，剪取15-20cm，先以恒温箱温度50±2℃，处理35min，然后再恒温培养6周，形成侧芽；恒温箱培养温度38±1℃，光照强度3000lux；
（2）材料消毒：将步骤（1）培养的侧芽切下，去掉叶片和叶鞘，用无菌水冲洗干净，接着用75%的酒精浸泡处理30 s，然后放到2%的次氯酸钠溶液振荡20 min，最后用无菌水冲洗3~5次至无泡沫产生；
（3）材料暗处理：将步骤（2）洗净的材料中接触到酒精、次氯酸钠溶液的部分切除，并去除老叶，纵切两半，将横截面接种于暗处理培养基MS+2,4-D 0.5-2.0 mg/L，进行暗处理3-4d；
（4）丛生芽诱导：将经过暗处理的材料接种到MS+BA 1.0-5.0mg/L+NAA 0.1-0.5mg/L培养基中进行诱导培养42d，形成丛生芽；
（5）脱毒苗病毒的检测：取丛生芽组织体进行Badnavirus病毒的PCR检测，选择无毒丛生芽，准备进行继代增殖；
（6）丛生芽的继代增殖：在无菌条件下，将步骤（5）获得的无毒丛生芽自然分开成单株或多株，接种于含MS+BA 1.0-5.0mg/L+NAA 0.1-0.5mg/L的培养基中，待长成丛芽后再次继代，20d继代1次；
（7）生根培养：将步骤（6）得到的采用固体培养基1/2MS+ NAA 0.5 mg/L+活性炭0.5 g/L进行生根培养，生根培养条件是：光照强度3000lux，25~28℃温度下培养20d；
（8）炼苗：当步骤（7）获得的组培苗假茎高4~5cm，并且发达根系后，移出培养室，在过渡室内将瓶盖除去炼苗，于假植前3d进行，得到丛苗；
（9）材料移栽：假植前，把丛苗取出，用清水冲洗净培养基，然后移到育苗盘，马上淋足定根水，然后用遮阳网遮盖。
实施例3 采用如下步骤实现本发明：
（1）减毒苗的准备：取健康富贵竹竹茎，剪取15-20cm，先以恒温箱温度55℃，处理30±5min，然后再恒温培养5周，形成侧芽；恒温箱培养温度38±1℃，光照强度3000lux；
（2）材料消毒：将步骤（1）培养的侧芽切下，去掉叶片和叶鞘，用无菌水冲洗干净，接着用75%的酒精浸泡处理30 s，然后放到2%的次氯酸钠溶液振荡20 min，最后用无菌水冲洗3~5次至无泡沫产生；
（3）材料暗处理：将步骤（2）洗净的材料中接触到酒精、次氯酸钠溶液的部分切除，并去除老叶，纵切两半，将横截面接种于暗处理培养基MS+2,4-D 0.5-2.0 mg/L，进行暗处理3-4d；
（4）丛生芽诱导：将经过暗处理的材料接种到MS+BA 1.0-5.0mg/L+NAA 0.1-0.5mg/L培养基中进行诱导培养45d，形成丛生芽；
（5）脱毒苗病毒的检测：取丛生芽组织体进行Badnavirus病毒的PCR检测，选择无毒丛生芽，准备进行继代增殖；
（6）丛生芽的继代增殖：在无菌条件下，将步骤（5）获得的无毒丛生芽自然分开成单株或多株，接种于含MS+BA 1.0-5.0mg/L+NAA 0.1-0.5mg/L的培养基中，待长成丛芽后再次继代，21d继代1次；
（7）生根培养：将步骤（6）得到的采用固体培养基1/2MS+ NAA 0.5 mg/L+活性炭0.5 g/L进行生根培养，生根培养条件是：光照强度3000lux，25~28℃温度下培养18d；
（8）炼苗：当步骤（7）获得的组培苗假茎高4~5cm，并且发达根系后，移出培养室，在过渡室内将瓶盖除去炼苗，于假植前2d进行，得到丛苗；
（9）材料移栽：假植前，把丛苗取出，用清水冲洗净培养基，然后移到育苗盘，马上淋足定根水，然后用遮阳网遮盖。
实施例3 采用如下步骤实现本发明：
（1）减毒苗的准备：取健康富贵竹竹茎，剪取15-20cm，先以恒温箱温度48℃，处理25min，然后再恒温培养5周，形成侧芽；恒温箱培养温度38±1℃，光照强度3000lux；
（2）材料消毒：将步骤（1）培养的侧芽切下，去掉叶片和叶鞘，用无菌水冲洗干净，接着用75%的酒精浸泡处理30 s，然后放到2%的次氯酸钠溶液振荡20 min，最后用无菌水冲洗3~5次至无泡沫产生；
（3）材料暗处理：将步骤（2）洗净的材料中接触到酒精、次氯酸钠溶液的部分切除，并去除老叶，纵切两半，将横截面接种于暗处理培养基MS+2,4-D 0.5-2.0 mg/L，进行暗处理3-4d；
（4）丛生芽诱导：将经过暗处理的材料接种到MS+BA 1.0-5.0mg/L+NAA 0.1-0.5mg/L培养基中进行诱导培养40d，形成丛生芽；
（5）脱毒苗病毒的检测：取丛生芽组织体进行Badnavirus病毒的PCR检测，选择无毒丛生芽，准备进行继代增殖；
（6）丛生芽的继代增殖：在无菌条件下，将步骤（5）获得的无毒丛生芽自然分开成单株或多株，接种于含MS+BA 1.0-5.0mg/L+NAA 0.1-0.5mg/L的培养基中，待长成丛芽后再次继代， 25d继代1次；
（7）生根培养：将步骤（6）得到的采用固体培养基1/2MS+ NAA 0.5 mg/L+活性炭0.5 g/L进行生根培养，生根培养条件是：光照强度3000lux，25~28℃温度下培养15d；
（8）炼苗：当步骤（7）获得的组培苗假茎高4~5cm，并且发达根系后，移出培养室，在过渡室内将瓶盖除去炼苗，于假植前3d进行，得到丛苗；
（9）材料移栽：假植前把丛苗从培养瓶中取出，用清水冲洗净培养基，然后移到进口芬兰诺万播基质NOVARBO培养土32孔育苗盘（规格：上口5.8 cm×高5.0 cm×底部3.0 cm），马上淋足定根水，然后用遮阳网遮盖，以防止太阳曝晒。

Claims (9)

1.一种富贵竹茎尖脱毒快繁的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）减毒苗的准备：取健康富贵竹竹茎，剪取10-20cm，在45-58℃恒温培养，形成侧芽；
（2）材料消毒：将步骤（1）培养的侧芽切下，去掉叶片和叶鞘，洗净，依次用75%的酒精、次氯酸钠溶液振荡消毒，然后用无菌水冲洗干净；
（3）材料暗处理：将步骤（2）洗净的材料中接触到酒精、次氯酸钠溶液的部分切除，并去除老叶，纵切两半，将横截面接种于暗处理培养基MS+2,4-D 0.5-2.0 mg/L，进行暗处理；
（4）丛生芽诱导：将经过暗处理的材料接种到MS+BA 1.0-5.0mg/L+NAA 0.1-0.5mg/L培养基中进行诱导培养，形成丛生芽；
（5）脱毒苗病毒的检测：取丛生芽组织体进行Badnavirus病毒的检测，选择无毒丛生芽，准备进行继代增殖；
（6）丛生芽的继代增殖：在无菌条件下，将步骤（5）获得的无毒丛生芽自然分开成单株或多株，接种于含MS+BA 1.0-5.0mg/L+NAA 0.1-0.5mg/L的培养基中，待长成丛芽后再次继代；
（7）生根培养：将步骤（6）得到的采用固体培养基1/2MS+ NAA 0.5 mg/L+活性炭0.5 g/L进行生根培养；
（8）炼苗：当步骤（7）获得的组培苗假茎高4~5cm，并且发达根系后，移出培养室，在过渡室内将瓶盖除去炼苗，于假植前2～3d进行，得到丛苗；
（9）材料移栽：假植前，把丛苗取出，用清水冲洗净培养基，然后移到育苗盘，马上淋足定根水，然后用遮阳网遮盖。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述恒温培养条件为：先以恒温箱温度50±2℃，处理30±5min，然后再恒温培养5-6周。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述恒温培养的条件是：恒温箱温度38±1℃，光照强度3000lux。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述材料消毒的方式是：将侧芽切下，去掉叶片和叶鞘，用无菌水冲洗干净，接着用75%的酒精浸泡处理30 s，然后放到2%的次氯酸钠溶液振荡20 min，最后用无菌水冲洗3~5次至无泡沫产生。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）所述暗处理时间为3-4d。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）所述接种后培养40～45d。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（5）所述病毒的检测采用PCR检测。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（6）所述丛生芽的继代增殖，具体是：在无菌条件下将丛生芽自然分开成单株或多株，接种于含MS+BA 1.0-5.0mg/L+NAA 0.1-0.5mg/L的培养基中，待长成丛芽后再次继代，20～25d继代1次。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（7）中，生根培养条件是：光照强度3000lux，25~28℃温度下培养15~20d。
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