CN110432155A - 一种蝴蝶兰无糖组织培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种蝴蝶兰无糖组织培养方法，包括花梗培养、母瓶培养、中母瓶培养、定瓶培养；操作方法为：将花梗瓶苗在光培室中培养30‑45d，然后转入母瓶进行增殖操作；母瓶在光培室中培养30d后，再转接一次母瓶，达到预定数量的苗后，在光培室中培养30‑60d，当叶子长到1‑2cm后转入中母瓶中培养；中母瓶培养45‑60d，待叶子长到2‑4cm且有1‑2条1‑2cm的小根时，转入定瓶培养；整个培养过程保持光照时间12h/d，光照强度1000‑2500Lx，温度23‑25℃。利用本发明组织培养方法，生根率可达到35%以上，且操作简单，适用于观赏性蝴蝶兰的大规模繁殖。

Description

一种蝴蝶兰无糖组织培养方法

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种蝴蝶兰无糖组织培养方法。

背景技术

蝴蝶兰的学名按希腊文的原意为“好似蝴蝶般的兰花”。它能吸收空气中的养分而生存，归入气生兰范畴，可说是热带兰花中的一个大族。中国台湾原生种白花蝴蝶兰闻名世界，南洋诸岛菲律宾、婆罗洲、印尼、马来西亚各地约有五、六十种原生种。蝴蝶兰色彩多种，从纯白、粉红、黄花着斑、线都有。育种家们利用各地搜取到珍贵的原种进行人工交配，改良出各种花色、花型，在花的尺寸上也有惊人的成就，当今达六寸的大白花，近五寸的粉红花，各种黄花红斑、红点、红线、纯黄、白花红心等色彩在各处兰花展都可看到。

碳源是植物组织生长过程中必须的营养成分之一，因此组织培养中都需要添加糖类以提供植物生长所必须的碳源物质，但糖类物质促进了微生物的生长，在湿度大的条件下容易染菌，使得组培不得不在小瓶容器内进行培养，导致植株生理活性紊乱。目前蝴蝶兰无糖组织培养方法存在生根率低，容易染菌及操作繁琐等问题，限制了其大规模应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种蝴蝶无糖兰组织培养方法，为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种蝴蝶兰组无糖织培养方法，包括花梗培养、母瓶培养、中母瓶培养、定瓶培养；操作方法为：将花梗瓶苗在光培室中培养30-45d，然后转入母瓶进行增殖操作；母瓶在光培室中培养30d后，再转接一次母瓶，达到预定数量的苗后，在光培室中培养30-60d，当叶子长到1-2cm后转入中母瓶中培养；中母瓶培养45-60d，待叶子长到2-4cm且有1-2条1-2cm的小根时，转入定瓶培养；整个培养过程保持光照时间12h/d，光照强度1000-2500Lx，温度23-25℃。

所述花梗培养的操作方法为：

（1）花梗的选取：选取带有花梗的、花朵和叶面健康壮硕的苗，将花梗从基部用一次性刀片剪取，每剪一次苗更换一次刀片；将剪取的花梗用报纸隔开，包好，避免汁液交叉接触，防止蝴蝶兰病毒传染；

（2）摘花苞：将剪取的蝴蝶兰花梗上的花苞花朵，留下休眠芽和顶芽，用75%的酒精擦拭消毒，消毒过程中不要损伤芽眼；

（3）花梗切段：将消毒后的花梗用无菌一次性刀片切段，每段花梗的芽眼位置在中心偏上，下段留1.5cm，上段留0.5cm；

（4）二氧化氯消毒：切段的花梗用二氧化氯溶液消毒10min，之后倒出二氧化氯溶液，再用无菌水清洗一遍；

（5）剥除苞片：把花梗上的芽眼外的苞片用一次性刀片切除剥离，不要伤到芽；要剥除顶芽部分时，留下顶芽，切除其他小芽；

（6）酒精消毒：将剥除苞片的花梗，用75%的酒精擦拭后，接着放入装有75%酒精的干净瓶子中，浸没消毒4min后，倒出花梗晾干；

（7）次氯酸钠消毒：先将中老芽放入14%次氯酸钠中消毒5min，再放入顶芽，继续消毒3min；

（8）花梗接种入培养基中：将步骤（7）次氯酸钠消毒后的花梗放入无菌瓶中，用无菌水清洗三遍，然后将花梗头尾各斜切1-2cm，斜切的方向要使花梗接入F培养基后，芽眼位置向上；将老芽与老芽接种在同一瓶，一瓶2根，新芽和新芽接种在同一瓶，每瓶5-7根，芽眼向光。

所述母瓶培养的操作方法为：

（1）用镊子从花梗瓶中取出材料，放入无菌铁盘中；

（2）用镊子固定成团的芽，用一次性刀片对成团的芽进行切分，切分位置为芽与芽的连接处，大棵芽单独切为一棵，小棵芽以两个为一组进行切割，切割后的芽要在叶子分叉处进行横切，去除叶子和苞片；

（3）将处理后的芽，用镊子夹取，将切除的叶子位置向上，轻轻接入F培养基表面；以大芽单棵为一株，小芽两棵一组为一株，每瓶母瓶中种植25株；

（4）母瓶在光培室中培育30d，再转接一次母瓶，重复切接直到达到预定数量的苗。

所述中母瓶培养培养方法为：

（1）用镊子从母瓶中取出材料，放入无菌铁盘中；

（2）用镊子固定成团的芽，用一次性刀片对成团的芽进行切分，切分位置为芽与芽的连接处，大棵芽单独切为一棵，小棵芽以两个为一组进行切割；

（3）将处理后的芽，用镊子夹取，叶面向上，轻轻接入T培养基表面；以大芽单棵为一株，小芽两棵一组为一株，每瓶中母瓶种植25-30株。

所述定瓶培养培养方法为：

（1）用镊子从中母瓶中取出材料，放入无菌铁盘中；

（2）将叶片长度达到2cm的材料进行定瓶培养，大棵单株的切除底部小芽，小棵两个芽为一组，从相接处切开，切除底部小芽；

（3）将处理后的芽，叶面向上朝外，接入L培养基底部，每瓶定瓶中种植11棵。

所述二氧化氯溶液的制备方法为：将二氧化氯A液和二氧化氯B液按质量比1:1量取，加入无菌水，按二氧化氯A液：二氧化氯B液：无菌水的质量比为1:1:500进行稀释，所述二氧化氯A液为稳定态二氧化氯原液，二氧化氯B液为专用活化剂。

所述F培养基的配制方法为：

（1）按200L的量称取MS培养基配方各组分，不添加蔗糖，加水溶解；

（2）加入40L椰子汁，搅拌均匀；

（3）加入980g琼脂粉，搅拌均匀；

（4）将3kg土豆加水煮沸后，搅拌成土豆汁，过滤除渣后，将土豆汁倒入培养基中；

（5）将10kg香蕉加水搅拌成香蕉汁，过滤除渣后，将香蕉汁倒入培养基中，继续加水至200L；

（6）培养基配制过程中持续加热，将温度维持在50-85℃。

所述T培养基的配方为：

（1）按200L的量称取MS培养基配方各组分，不添加蔗糖，加水溶解；

（2）加入20L椰子汁，搅拌均匀；

（3）加入995g琼脂粉，搅拌均匀；

（4）将3kg土豆加水煮沸后，搅拌成土豆汁，过滤除渣后，将土豆汁倒入培养基中；

（5）将10kg香蕉加水搅拌成香蕉汁，过滤除渣后，将香蕉汁倒入培养基中，继续加水至200L；

（6）加入200g活性炭，搅拌均匀；

（7）培养基配制过程中持续加热，将温度维持在50-85℃。

所述L培养基的配方为：

（1）按200L的量称取2/3 MS培养基配方各组分，不添加蔗糖，加水溶解；

（2）加入20L椰子汁，搅拌均匀；

（3）加入1000g琼脂粉，搅拌均匀；

（4）将3kg土豆加水煮沸后，搅拌成土豆汁，过滤除渣后，将土豆汁倒入培养基中；

（5）将10kg香蕉加水搅拌成香蕉汁，过滤除渣后，将香蕉汁倒入培养基中，继续加水至200L；

（6）加入200g活性炭，搅拌均匀；

（7）培养基配制过程中持续加热，将温度维持在50-85℃。

本发明的优点在于：利用本发明组织培养方法培育蝴蝶兰，生根率可达到35%以上，成活率可达99%，且操作简单，适用于观赏性蝴蝶兰的大规模繁殖。传统含糖培养基容易在光照强度高或湿度大时，造成培养基发霉染菌，使植物成活率降低，而蝴蝶兰喜欢高温高湿的环境，本发明采用无糖培养基，有效避免了组织培养过程中杂菌感染。

附图说明

图1为蝴蝶兰花梗培养。

图2为母瓶培养。

图3为母瓶转接母瓶。

图4为定瓶培养。

具体实施方式

培养基配制：

1、F培养基的配制方法为：

（1）按200L的量称取MS培养基配方各组分，不添加蔗糖，加水溶解；

（2）加入40L椰子汁，搅拌均匀；

（3）加入980g琼脂粉，搅拌均匀；

（4）将3kg土豆加水煮沸后，搅拌成土豆汁，过滤除渣后，将土豆汁倒入培养基中；

（5）将10kg香蕉加水搅拌成香蕉汁，过滤除渣后，将香蕉汁倒入培养基中，继续加水至200L；

（6）培养基配制过程中持续加热，将温度维持在50-85℃。

2、T培养基的配方为：

（1）按200L的量称取MS培养基配方各组分，不添加蔗糖，加水溶解；

（2）加入20L椰子汁，搅拌均匀；

（3）加入995g琼脂粉，搅拌均匀；

（4）将3kg土豆加水煮沸后，搅拌成土豆汁，过滤除渣后，将土豆汁倒入培养基中；

（5）将10kg香蕉加水搅拌成香蕉汁，过滤除渣后，将香蕉汁倒入培养基中，继续加水至200L；

（6）加入200g活性炭，搅拌均匀；

（7）培养基配制过程中持续加热，将温度维持在50-85℃。

3、L培养基的配方为：

（1）按200L的量称取2/3 MS培养基配方各组分，不添加蔗糖，加水溶解；

（2）加入20L椰子汁，搅拌均匀；

（3）加入1000g琼脂粉，搅拌均匀；

（4）将3kg土豆加水煮沸后，搅拌成土豆汁，过滤除渣后，将土豆汁倒入培养基中；

（5）将10kg香蕉加水搅拌成香蕉汁，过滤除渣后，将香蕉汁倒入培养基中，继续加水至200L；

（6）加入200g活性炭，搅拌均匀；

（7）培养基配制过程中持续加热，将温度维持在50-85℃。

实施例1

1、花梗培养

（1）花梗的选取：选取带有花梗的、花朵和叶面健康壮硕的苗，将花梗从基部用一次性刀片剪取，每剪一次苗更换一次刀片；将剪取的花梗用报纸隔开，包好，避免汁液交叉接触，防止蝴蝶兰病毒传染；

（2）摘花苞：将剪取的蝴蝶兰花梗上的花苞花朵，留下休眠芽和顶芽，用75%的酒精擦拭消毒，消毒过程中不要损伤芽眼；

（3）花梗切段：将消毒后的花梗用无菌一次性刀片切段，每段花梗的芽眼位置在中心偏上，下段留1.5cm，上段留0.5cm；

（4）二氧化氯消毒：切段的花梗用二氧化氯溶液消毒10min，之后倒出二氧化氯溶液，再用无菌水清洗一遍；所述二氧化氯溶液的制备方法为：将二氧化氯A液和二氧化氯B液按质量比1:1量取，加入无菌水，按二氧化氯A液：二氧化氯B液：无菌水的质量比为1:1:500进行稀释，所述二氧化氯A液为稳定态二氧化氯原液，二氧化氯B液为专用活化剂；

（5）剥除苞片：把花梗上的芽眼外的苞片用一次性刀片切除剥离，不要伤到芽；要剥除顶芽部分时，留下顶芽，切除其他小芽；

（6）酒精消毒：将剥除苞片的花梗，用75%的酒精擦拭后，接着放入装有75%酒精的干净瓶子中，浸没消毒4min后，倒出花梗晾干；

（7）次氯酸钠消毒：先将中老芽放入14%次氯酸钠中消毒5min，再放入顶芽，继续消毒3min；

（8）花梗接种入培养基中：将步骤（7）次氯酸钠消毒后的花梗放入无菌瓶中，用无菌水清洗三遍，然后将花梗头尾各斜切1-2cm，斜切的方向要使花梗接入F培养基后，芽眼位置向上；将老芽与老芽接种在同一瓶，一瓶2根（图1a），新芽和新芽接种在同一瓶，每瓶5-7根（图1b），芽眼向光。

将花梗瓶苗在光培室中培养30d，然后转入母瓶进行增殖操作，培养过程保持光照时间12h/d，光照强度1000Lx，温度23℃。

2、母瓶培养

（1）用镊子从花梗瓶中取出材料，放入无菌铁盘中；

（2）用镊子固定成团的芽，用一次性刀片对成团的芽进行切分，切分位置为芽与芽的连接处，大棵芽单独切为一棵，小棵芽以两个为一组进行切割，切割后的芽要在叶子分叉处进行横切，去除叶子和苞片；

（3）将处理后的芽，用镊子夹取，将切除的叶子位置向上，轻轻接入F培养基表面；以大芽单棵为一株，小芽两棵一组为一株，每瓶母瓶中种植25株（图2）；

（4）母瓶在光培室中培育30d，再转接一次母瓶，重复切接直到达到预定数量的苗（图3）。

母瓶在光培室中培养30d后，再转接一次母瓶，达到预定数量的苗后，在光培室中培养30-60d，当叶子长到1-2cm后转入中母瓶中培养，培养过程保持光照时间12h/d，光照强度1000Lx，温度23℃。

3、中母瓶培养

（2）用镊子固定成团的芽，用一次性刀片对成团的芽进行切分，切分位置为芽与芽的连接处，大棵芽单独切为一棵，小棵芽以两个为一组进行切割；

（3）将处理后的芽，用镊子夹取，叶面向上，轻轻接入T培养基表面；以大芽单棵为一株，小芽两棵一组为一株，每瓶中母瓶种植25-30株。

中母瓶培养45d，待叶子长到2-4cm且有1-2条1-2cm的小根时，转入定瓶培养；培养过程保持光照时间12h/d，光照强度1000Lx，温度23℃。

4、定瓶培养培养

（1）用镊子从中母瓶中取出材料，放入无菌铁盘中；

（2）将叶片长度达到2cm的材料进行定瓶培养，大棵单株的切除底部小芽，小棵两个芽为一组，从相接处切开，切除底部小芽；

（3）将处理后的芽，叶面向上朝外，接入L培养基底部，每瓶定瓶中种植11棵（图4）。

培养过程保持光照时间12h/d，光照强度1000Lx，温度23℃，定瓶培养45d。

实施例2

1、花梗培养

（1）花梗的选取：选取带有花梗的、花朵和叶面健康壮硕的苗，将花梗从基部用一次性刀片剪取，每剪一次苗更换一次刀片；将剪取的花梗用报纸隔开，包好，避免汁液交叉接触，防止蝴蝶兰病毒传染；

（2）摘花苞：将剪取的蝴蝶兰花梗上的花苞花朵，留下休眠芽和顶芽，用75%的酒精擦拭消毒，消毒过程中不要损伤芽眼；

（3）花梗切段：将消毒后的花梗用无菌一次性刀片切段，每段花梗的芽眼位置在中心偏上，下段留1.5cm，上段留0.5cm；

（4）二氧化氯消毒：切段的花梗用二氧化氯溶液消毒10min，之后倒出二氧化氯溶液，再用无菌水清洗一遍；所述二氧化氯溶液的制备方法为：将二氧化氯A液和二氧化氯B液按质量比1:1量取，加入无菌水，按二氧化氯A液：二氧化氯B液：无菌水的质量比为1:1:500进行稀释，所述二氧化氯A液为稳定态二氧化氯原液，二氧化氯B液为专用活化剂；

（5）剥除苞片：把花梗上的芽眼外的苞片用一次性刀片切除剥离，不要伤到芽；要剥除顶芽部分时，留下顶芽，切除其他小芽；

（6）酒精消毒：将剥除苞片的花梗，用75%的酒精擦拭后，接着放入装有75%酒精的干净瓶子中，浸没消毒4min后，倒出花梗晾干；

（7）次氯酸钠消毒：先将中老芽放入14%次氯酸钠中消毒5min，再放入顶芽，继续消毒3min；

（8）花梗接种入培养基中：将步骤（7）次氯酸钠消毒后的花梗放入无菌瓶中，用无菌水清洗三遍，然后将花梗头尾各斜切1-2cm，斜切的方向要使花梗接入F培养基后，芽眼位置向上；将老芽与老芽接种在同一瓶，一瓶2根（图1a），新芽和新芽接种在同一瓶，每瓶5-7根（图1b），芽眼向光。

将花梗瓶苗在光培室中培养30d，然后转入母瓶进行增殖操作，培养过程保持光照时间12h/d，光照强度2500Lx，温度25℃。

2、母瓶培养

（1）用镊子从花梗瓶中取出材料，放入无菌铁盘中；

（2）用镊子固定成团的芽，用一次性刀片对成团的芽进行切分，切分位置为芽与芽的连接处，大棵芽单独切为一棵，小棵芽以两个为一组进行切割，切割后的芽要在叶子分叉处进行横切，去除叶子和苞片；

（3）将处理后的芽，用镊子夹取，将切除的叶子位置向上，轻轻接入F培养基表面；以大芽单棵为一株，小芽两棵一组为一株，每瓶母瓶中种植25株（图2）；

（4）母瓶在光培室中培育30d，再转接一次母瓶，重复切接直到达到预定数量的苗（图3）。

母瓶在光培室中培养30d后，再转接一次母瓶，达到预定数量的苗后，在光培室中培养60d，当叶子长到1-2cm后转入中母瓶中培养，培养过程保持光照时间12h/d，光照强度2500Lx，温度23℃。

3、中母瓶培养

（2）用镊子固定成团的芽，用一次性刀片对成团的芽进行切分，切分位置为芽与芽的连接处，大棵芽单独切为一棵，小棵芽以两个为一组进行切割；

（3）将处理后的芽，用镊子夹取，叶面向上，轻轻接入T培养基表面；以大芽单棵为一株，小芽两棵一组为一株，每瓶中母瓶种植25-30株（图4）。

中母瓶培养60d，待叶子长到2-4cm且有1-2条1-2cm的小根时，转入定瓶培养；培养过程保持光照时间12h/d，光照强度2500Lx，温度25℃。

4、定瓶培养培养

（1）用镊子从中母瓶中取出材料，放入无菌铁盘中；

（2）将叶片长度达到2cm的材料进行定瓶培养，大棵单株的切除底部小芽，小棵两个芽为一组，从相接处切开，切除底部小芽；

（3）将处理后的芽，叶面向上朝外，接入L培养基底部，每瓶定瓶中种植11棵（图5）。

培养过程保持光照时间12h/d，光照强度2500Lx，温度25℃，定瓶培养45d。

计算实施例组培方法的生根率成活率，结果如表1所示：

表1

计算实施例组培方法的微生物染菌率，

结果如表2所示。由表2可知，无组织培养基染菌率相对于含糖培养基，染菌率有显著性降低。

染菌率=（染菌瓶数/总培养瓶数）×100%；

表2

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (9)

1.一种蝴蝶兰组无糖织培养方法，其特征在于，包括花梗培养、母瓶培养、中母瓶培养、定瓶培养；操作方法为：将花梗瓶苗在光培室中培养30-45d，然后转入母瓶进行增殖操作；母瓶在光培室中培养30d后，再转接一次母瓶，达到预定数量的苗后，在光培室中培养30-60d，当叶子长到1-2cm后转入中母瓶中培养；中母瓶培养45-60d，待叶子长到2-4cm且有1-2条1-2cm的小根时，转入定瓶培养；整个培养过程保持光照时间12h/d，光照强度1000-2500Lx，温度23-25℃。

2.根据权利要求1所述一种蝴蝶兰无糖组织培养方法，其特征在于，所述花梗培养的操作方法为：

（1）花梗的选取：选取带有花梗的、花朵和叶面健康壮硕的苗，将花梗从基部用一次性刀片剪取，每剪一次苗更换一次刀片；将剪取的花梗用报纸隔开，包好，避免汁液交叉接触，防止蝴蝶兰病毒传染；

（2）摘花苞：将剪取的蝴蝶兰花梗上的花苞花朵，留下休眠芽和顶芽，用75%的酒精擦拭消毒，消毒过程中不要损伤芽眼；

（3）花梗切段：将消毒后的花梗用无菌一次性刀片切段，每段花梗的芽眼位置在中心偏上，下段留1.5cm，上段留0.5cm；

（4）二氧化氯消毒：切段的花梗用二氧化氯溶液消毒10min，之后倒出二氧化氯溶液，再用无菌水清洗一遍；

（5）剥除苞片：把花梗上的芽眼外的苞片用一次性刀片切除剥离，不要伤到芽；要剥除顶芽部分时，留下顶芽，切除其他小芽；

（6）酒精消毒：将剥除苞片的花梗，用75%的酒精擦拭后，接着放入装有75%酒精的干净瓶子中，浸没消毒4min后，倒出花梗晾干；

（7）次氯酸钠消毒：先将中老芽放入14%次氯酸钠中消毒5min，再放入顶芽，继续消毒3min；

（8）花梗接种入培养基中：将步骤（7）次氯酸钠消毒后的花梗放入无菌瓶中，用无菌水清洗三遍，然后将花梗头尾各斜切1-2cm，斜切的方向要使花梗接入F培养基后，芽眼位置向上；将老芽与老芽接种在同一瓶，一瓶2根，新芽和新芽接种在同一瓶，每瓶5-7根，芽眼向光。

3.根据权利要求1所述一种蝴蝶兰无糖组织培养方法，其特征在于，所述母瓶培养的操作方法为：

（1）用镊子从花梗瓶中取出材料，放入无菌铁盘中；

（2）用镊子固定成团的芽，用一次性刀片对成团的芽进行切分，切分位置为芽与芽的连接处，大棵芽单独切为一棵，小棵芽以两个为一组进行切割，切割后的芽要在叶子分叉处进行横切，去除叶子和苞片；

（3）将处理后的芽，用镊子夹取，将切除的叶子位置向上，轻轻接入F培养基表面；以大芽单棵为一株，小芽两棵一组为一株，每瓶母瓶中种植25株；

（4）母瓶在光培室中培育30d，再转接一次母瓶，重复切接直到达到预定数量的苗。

4.根据权利要求1所述一种蝴蝶兰无糖组织培养方法，其特征在于，所述中母瓶培养培养方法为：

（1）用镊子从母瓶中取出材料，放入无菌铁盘中；

（2）用镊子固定成团的芽，用一次性刀片对成团的芽进行切分，切分位置为芽与芽的连接处，大棵芽单独切为一棵，小棵芽以两个为一组进行切割；

（3）将处理后的芽，用镊子夹取，叶面向上，轻轻接入T培养基表面；以大芽单棵为一株，小芽两棵一组为一株，每瓶中母瓶种植25-30株。

5.根据权利要求1所述一种蝴蝶无糖兰组织培养方法，其特征在于，所述定瓶培养培养方法为：

（1）用镊子从中母瓶中取出材料，放入无菌铁盘中；

（2）将叶片长度达到2cm的材料进行定瓶培养，大棵单株的切除底部小芽，小棵两个芽为一组，从相接处切开，切除底部小芽；

（3）将处理后的芽，叶面向上朝外，接入L培养基底部，每瓶定瓶中种植11棵。

6.根据权利要求2所述一种蝴蝶兰组无糖织培养方法，其特征在于，将二氧化氯A液和二氧化氯B液按质量比1:1量取，加入无菌水，按二氧化氯A液：二氧化氯B液：无菌水的质量比为1:1:500进行稀释，所述二氧化氯A液为稳定态二氧化氯原液，二氧化氯B液为专用活化剂。

7.根据权利要求2或3所述的一种蝴蝶兰无糖组织培养方法，其特征在于，所述F培养基的配制方法为：

（1）按200L的量称取MS培养基配方各组分，不添加蔗糖，加水溶解；

（2）加入40L椰子汁，搅拌均匀；

（3）加入980g琼脂粉，搅拌均匀；

（4）将3kg土豆加水煮沸后，搅拌成土豆汁，过滤除渣后，将土豆汁倒入培养基中；

（5）将10kg香蕉加水搅拌成香蕉汁，过滤除渣后，将香蕉汁倒入培养基中，继续加水至200L；

（6）培养基配制过程中持续加热，将温度维持在50-85℃。

8.根据权利要求4所述的一种蝴蝶兰无糖组织培养方法，其特征在于，所述T培养基的配方为：

（1）按200L的量称取MS培养基配方各组分，不添加蔗糖，加水溶解；

（2）加入20L椰子汁，搅拌均匀；

（3）加入995g琼脂粉，搅拌均匀；

（4）将3kg土豆加水煮沸后，搅拌成土豆汁，过滤除渣后，将土豆汁倒入培养基中；

（5）将10kg香蕉加水搅拌成香蕉汁，过滤除渣后，将香蕉汁倒入培养基中，继续加水至200L；

（6）加入200g活性炭，搅拌均匀；

（7）培养基配制过程中持续加热，将温度维持在50-85℃。

9.根据权利要求5所述的一种蝴蝶兰无糖组织培养方法，其特征在于，所述L培养基的配方为：

（1）按200L的量称取2/3 MS培养基配方各组分，不添加蔗糖，加水溶解；

（2）加入20L椰子汁，搅拌均匀；

（3）加入1000g琼脂粉，搅拌均匀；

（4）将3kg土豆加水煮沸后，搅拌成土豆汁，过滤除渣后，将土豆汁倒入培养基中；

（5）将10kg香蕉加水搅拌成香蕉汁，过滤除渣后，将香蕉汁倒入培养基中，继续加水至200L；

（6）加入200g活性炭，搅拌均匀；

（7）培养基配制过程中持续加热，将温度维持在50-85℃。