CN106171987A - 一种墨兰培养繁殖方法 - Google Patents

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宋林贵
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    • A01H4/008—Methods for regeneration to complete plants

Abstract

本发明涉及植物培养繁殖技术领域，具体涉及一种墨兰培养繁殖方法，包括以下步骤：材料选取、材料消毒、诱导培养、增殖培养、生根培养、移栽；通过本发明能使培养后的苗株成苗率高，栽培后适应性强，苗株长势良好，通过生物技术手段在短时间内，满足了商业化生产的需求，为企业规模化、产业化提供了技术支持。本发明的成本低，以1/2MS培养基为基础母液，并且采用其他营养物来代替价格昂贵的椰子汁作为营养液，其大量元素的用量为标准MS培养基的大量元素用量的一半，在对平均叶长、芽平均伸长高度以及大芽百分比不受影响的前提下，显著降低了培养基的制备成本。

Description

一种墨兰培养繁殖方法
技术领域
本发明涉及植物培养繁殖技术领域，具体涉及一种墨兰培养繁殖方法。
背景技术
墨兰又名报岁兰，是兰科兰属地生植物。假鳞茎卵球形，包藏于叶基之内。叶带形，近薄革质，暗绿色。花葶从假鳞茎基部发出，直立，较粗壮，一般略长于叶；花的色泽变化较大，较常为暗紫色或紫褐色而具浅色唇瓣，也有黄绿色、桃红色或白色的，一般有较浓的香气；萼片狭长圆形或狭椭圆形；花瓣近狭卵形；唇瓣近卵状长圆形；蕊柱稍向前弯曲，两侧有狭翅；花粉团4个，成2对，宽卵形。蒴果狭椭圆形，花期10月至次年3月。生于林下、灌木林中或溪谷旁湿润但排水良好的荫蔽处，海拔300-2000米。分布于中国、印度、缅甸、越南、泰国、日本琉球群岛等。
然而，传统的墨兰培育往往存在繁殖速度慢等缺陷，难以满足商业化生产的需求。因此，人们多数采用组织培养的方法对墨兰进行快速繁殖。但现有的组织培养往往成苗率低、长势不好。
发明内容
本发明的目的在于提供一种成苗率高、长势良好、成本低的墨兰培养繁殖方法。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：一种墨兰培养繁殖方法，包括以下步骤：
(1)材料选取：选取当天挖取的无病虫害长势良好的墨兰，采用假鳞茎为外植体，去除多余的叶片；
(2)材料消毒：用软刷毛将选取的墨兰假鳞茎在水池中进行初步清洗，去除表面的泥沙，然后用洗洁精清洗干净，置于流水下冲洗60min，将墨兰假鳞茎置于超净工作台上用体积分数为75％的酒精消毒30s，再用无菌水冲洗5次，然后用质量分数为0.2％的氯化汞溶液分2～3次共消毒6～7min，每次用氯化汞溶液消毒后将墨兰假鳞茎用无菌水漂洗5次，并用消毒滤纸吸干表面水分，最后在放入质量分数为4％的次氯酸钠溶液中消毒5～7min，消毒后用无菌水冲洗6～8次，用消毒滤纸吸干表面水分后放置于培养皿中备用；
(3)诱导培养：将消毒后的墨兰假鳞茎，接种在芽诱导培养基中进行培养，所述芽诱导培养基为：1/2MS+0.4～0.8mg/L 6-BA+0.05～0.08mg/L NAA+25～35g/L蔗糖+6～8g/L琼脂+1～3g/L蛋白胨+30～40mg/L赤霉素，pH值为5.8；培养条件：培养温度23～25℃，光照时间为13h/d，光照强度为1300～1500lx；
(4)增殖培养：将诱导培养后的墨兰假鳞茎用无菌手术刀切成2～3cm茎段，然后转移至芽增殖培养基中，所述芽增殖培养基为：1/2MS+1～2mg/L 6-BA+0.1～0.2mg/L NAA+25～35g/L蔗糖+6～8g/L琼脂+3～6g/L蛋白胨+50～60mg/L赤霉素，pH值为5.8；培养条件：培养温度23～25℃，光照时间为13h/d，光照强度为1500～1800lx；
(5)生根培养：将增殖培养出来的带有小叶片的假鳞茎无根幼苗单株切下，转移到生根培养基中，所述生根培养基为：1/2MS+1.4～1.6mg/L 6-BA+0.05～0.08mg/L NAA+25～35g/L蔗糖+6～8g/L琼脂+1～3g/L蛋白胨，pH值为5.8；培养条件：培养温度23～25℃，光照时间为13h/d，光照强度为1700～2000lx；
(6)移栽：当生根培养试管苗生长至2～3cm高，根2～4条，叶1～2片时，将试管苗放在自然光下炼苗5～7天，打开瓶盖炼苗1～2天；然后取出培养苗，用清水洗净附着在根部的培养基，清洗时注意不要损害根部，然后移栽至水苔和腐殖土质量比为1:2的混合基质中，保持湿度和通风，空气湿度为75～85％，温度为20～25℃。
如上所述的一种墨兰培养繁殖方法，进一步说明为，所述芽诱导培养基为：1/2MS+0.6mg/L 6-BA+0.07mg/L NAA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂+2g/L蛋白胨+35mg/L赤霉素，pH值为5.8。
如上所述的一种墨兰培养繁殖方法，进一步说明为，所述芽增殖培养基为：1/2MS+1.5mg/L 6-BA+0.15mg/L NAA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂+5g/L蛋白胨+55mg/L赤霉素，pH值为5.8。
如上所述的一种墨兰培养繁殖方法，进一步说明为，所述生根培养基为：1/2MS+1.5mg/L 6-BA+0.07mg/L NAA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂+2g/L蛋白胨，pH值为5.8。
本发明的有益效果是：通过本发明能使培养后的苗株成苗率高，栽培后适应性强，苗株长势良好，通过生物技术手段在短时间内，满足了商业化生产的需求，为企业规模化、产业化提供了技术支持。本发明的成本低，以1/2MS培养基为基础母液，并且采用其他营养物来代替价格昂贵的椰子汁作为营养液，其大量元素的用量为标准MS培养基的大量元素用量的一半，在对平均叶长、芽平均伸长高度以及大芽百分比不受影响的前提下，显著降低了培养基的制备成本。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做详细的阐述。
本发明提供的一种墨兰培养繁殖方法，包括以下步骤：
(1)材料选取：选取当天挖取的无病虫害长势良好的墨兰，采用假鳞茎为外植体，去除多余的叶片；
(2)材料消毒：用软刷毛将选取的墨兰假鳞茎在水池中进行初步清洗，去除表面的泥沙，然后用洗洁精清洗干净，置于流水下冲洗60min，将墨兰假鳞茎置于超净工作台上用体积分数为75％的酒精消毒30s，再用无菌水冲洗5次，然后用质量分数为0.2％的氯化汞溶液分2～3次共消毒6～7min，每次用氯化汞溶液消毒后将墨兰假鳞茎用无菌水漂洗5次，并用消毒滤纸吸干表面水分，一般消毒用的0.1％氯化汞溶液灭菌效果不佳，而浓度较高的氯化汞溶液又易使外植体失去活性，抑制芽的诱导，而本培育方法采用质量分数为0.2％的氯化汞溶液能较好起到灭菌作用而又对其活性影响较小，并且采用分2～3次操作，能更好的保护外植体活性，使外植体的发芽率大大增加。最后在放入质量分数为4％的次氯酸钠溶液中消毒5～7min，消毒后用无菌水冲洗6～8次，用消毒滤纸吸干表面水分后放置于培养皿中备用；
表1为采用上述消毒方法对墨兰假鳞茎进行处理后，放置于芽诱导培养基中进行培养，对培养后墨兰假鳞茎发芽率的试验结果：
由表1可以看出，采用质量分数为0.2％的氯化汞溶液能较好起到灭菌作用而又对其活性影响较小，并且采用分2～3次操作，能更好的保护外植体活性，使外植体的发芽率大大增加。最后用质量分数为4％的次氯酸钠溶液中消毒5～7min，能更好起到灭菌作用；
(3)诱导培养：将上述消毒后的墨兰假鳞茎，接种在芽诱导培养基中进行培养，所述芽诱导培养基为：1/2MS+0.4～0.8mg/L 6-BA+0.05～0.08mg/L NAA+25～35g/L蔗糖+6～8g/L琼脂+1～3g/L蛋白胨+30～40mg/L赤霉素，pH值为5.8；培养条件：培养温度23～25℃，光照时间为13h/d，光照强度为1300～1500lx；诱导培养的时间一般为30～40天；
表2为芽诱导培养基成分及其用量
表2中所述的MS基础培养基为现有技术，这里不做详细阐述；表2中所述的6-BA为6-苄氨基腺嘌呤，又可以叫做细胞分裂素；所述NAA为萘乙酸；作为优选所述芽诱导培养基为：1/2MS+0.6mg/L 6-BA+0.07mg/L NAA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂+2g/L蛋白胨+35mg/L赤霉素，pH值为5.8，即为表2中芽诱导培养基3的成分和用量；
(4)增殖培养：将诱导培养后的墨兰假鳞茎用无菌手术刀切成2～3cm茎段，然后转移至芽增殖培养基中，所述芽增殖培养基为：1/2MS+1～2mg/L6-BA+0.1～0.2mg/L NAA+25～35g/L蔗糖+6～8g/L琼脂+3～6g/L蛋白胨+50～60mg/L赤霉素，pH值为5.8；培养条件：培养温度23～25℃，光照时间为13h/d，光照强度为1500～1800lx，增殖培养时间一般为40～50天；
表3为芽增殖培养基成分及其用量
表3中所述的6-BA为6-苄氨基腺嘌呤，又可以叫做细胞分裂素；所述NAA为萘乙酸；作为优选所述芽增殖培养基为：1/2 MS+1.5mg/L 6-BA+0.15mg/L NAA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂+5g/L蛋白胨+55mg/L赤霉素，pH值为5.8，即为表3中芽增殖培养基1的成分和用量；
(5)生根培养：将增殖培养出来的带有小叶片的假鳞茎无根幼苗单株切下，转移到生根培养基中，所述生根培养基为：1/2MS+1.4～1.6mg/L 6-BA+0.05～0.08mg/L NAA+25～35g/L蔗糖+6～8g/L琼脂+1～3g/L蛋白胨，pH值为5.8；培养条件：培养温度23～25℃，光照时间为13h/d，光照强度为1700～2000lx，生根培养的时间一般为20～30天；
表4为生根培养基成分及其用量
表4中所述的6-BA为6-苄氨基腺嘌呤，又可以叫做细胞分裂素；所述NAA为萘乙酸；作为优选所述生根培养基为：1/2MS+1.5mg/L 6-BA+0.07mg/L NAA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂+2g/L蛋白胨，pH值为5.8，即为表4中芽增殖培养基1的成分和用量；
(6)移栽：当生根培养试管苗生长至2～3cm高，根2～4条，叶1～2片时，将试管苗放在自然光下炼苗5～7天，打开瓶盖炼苗1～2天；然后取出培养苗，用清水洗净附着在根部的培养基，清洗时注意不要损害根部，然后移栽至水苔和腐殖土质量比为1:2的混合基质中，保持湿度和通风，空气湿度为75～85％，温度为20～25℃；通过本发明能使培养后的苗株成苗率高，栽培后适应性强，苗株长势良好，通过生物技术手段在短时间内，满足了商业化生产的需求，为企业规模化、产业化提供了技术支持。
本发明并不限于上述实例，在本发明的权利要求书所限定的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可做出的各种变形或修改均受本专利的保护。

Claims (4)

1.一种墨兰培养繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)材料选取：选取当天挖取的无病虫害长势良好的墨兰，采用假鳞茎为外植体，去除多余的叶片；
(2)材料消毒：用软刷毛将选取的墨兰假鳞茎在水池中进行初步清洗，去除表面的泥沙，然后用洗洁精清洗干净，置于流水下冲洗60min，将墨兰假鳞茎置于超净工作台上用体积分数为75％的酒精消毒30s，再用无菌水冲洗5次，然后用质量分数为0.2％的氯化汞溶液分2～3次共消毒6～7min，每次用氯化汞溶液消毒后将墨兰假鳞茎用无菌水漂洗5次，并用消毒滤纸吸干表面水分，最后在放入质量分数为4％的次氯酸钠溶液中消毒5～7min，消毒后用无菌水冲洗6～8次，用消毒滤纸吸干表面水分后放置于培养皿中备用；
(3)诱导培养：将消毒后的墨兰假鳞茎，接种在芽诱导培养基中进行培养，所述芽诱导培养基为：1/2MS+0.4～0.8mg/L 6-BA+0.05～0.08mg/L NAA+25～35g/L蔗糖+6～8g/L琼脂+1～3g/L蛋白胨+30～40mg/L赤霉素，pH值为5.8；培养条件：培养温度23～25℃，光照时间为13h/d，光照强度为1300～1500lx；
(4)增殖培养：将诱导培养后的墨兰假鳞茎用无菌手术刀切成2～3cm茎段，然后转移至芽增殖培养基中，所述芽增殖培养基为：1/2MS+1～2mg/L 6-BA+0.1～0.2mg/L NAA+25～35g/L蔗糖+6～8g/L琼脂+3～6g/L蛋白胨+50～60mg/L赤霉素，pH值为5.8；培养条件：培养温度23～25℃，光照时间为13h/d，光照强度为1500～1800lx；
(5)生根培养：将增殖培养出来的带有小叶片的假鳞茎无根幼苗单株切下，转移到生根培养基中，所述生根培养基为：1/2MS+1.4～1.6mg/L 6-BA+0.05～0.08mg/L NAA+25～35g/L蔗糖+6～8g/L琼脂+1～3g/L蛋白胨，pH值为5.8；培养条件：培养温度23～25℃，光照时间为13h/d，光照强度为1700～2000lx；
(6)移栽：当生根培养试管苗生长至2～3cm高，根2～4条，叶1～2片时，将试管苗放在自然光下炼苗5～7天，打开瓶盖炼苗1～2天；然后取出培养苗，用清水洗净附着在根部的培养基，清洗时注意不要损害根部，然后移栽至水苔和腐殖土质量比为1:2的混合基质中，保持湿度和通风，空气湿度为75～85％，温度为20～25℃。
2.根据权利要求1所述的一种墨兰培养繁殖方法，其特征在于：所述芽诱导培养基为：1/2MS+0.6mg/L 6-BA+0.07mg/L NAA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂+2g/L蛋白胨+35mg/L赤霉素，pH值为5.8。
3.根据权利要求1所述的一种墨兰培养繁殖方法，其特征在于：所述芽增殖培养基为：1/2MS+1.5mg/L 6-BA+0.15mg/L NAA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂+5g/L蛋白胨+55mg/L赤霉素，pH值为5.8。
4.根据权利要求1所述的一种墨兰培养繁殖方法，其特征在于：所述生根培养基为：1/2MS+1.5mg/L 6-BA+0.07mg/L NAA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂+2g/L蛋白胨，pH值为5.8。
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