CN117121815B - 一种菱角组培繁殖方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种菱角组培繁殖方法，解决了现有技术中菱角通过种子育苗播种存在品种纯度不纯和成本高的问题。一种菱角组培繁殖方法，包括：S1、外植体的制备：制备灭菌消毒的外植体，S2、启动培养：将外植体在启动培养基上培养获得无菌苗，S3、增殖培养：将无菌苗进行在增殖培养基上培养获得组培苗或生根苗。本发明提供的菱角组培快繁技术，一方面，保持原有品种的固有性状和特性，另一方面，在本发明提供的启动培养基和增殖培养基的配方下，菱角幼苗的培养周期短、成本低和成活率高，苗体健壮，叶色鲜亮，从芽旺盛；且占地空间小，周转快，节省了水田场地和水资源，避免菱角幼苗遭受水田的细菌病毒污染，可以实现大量生产优质菱角种苗。

Description

一种菱角组培繁殖方法

技术领域

本发明属于植物培植领域，具体涉及一种菱角组培繁殖方法。

背景技术

菱角是一种水生植物，具有解酒毒、健脾养胃和补肾养血的功效，在幼嫩时期将菱角当做水果来使用，其中所富含的汁液是非常多的，而且有浓郁的清香气息，可以起到生津止渴的效果。

目前，大多数菱角均采用水田播种育苗栽培。一方面，对于资源保护来说，保证种子纯度非常困难，种子不纯导致生长出的菱角品种参差不齐，品种纯度得不到保障；另一方面，水田播种育苗，需要大场地面积去种植留种，还需要大量水资源，并且水田里易携带病毒及害虫，菱角在水田里育苗，易受病毒及害虫的侵染，还存在水质不佳和温度难以把控等问题，而菱角育苗的时候对于温度和水质的把控比较严格，菱角对于温度的变化容忍度较低，这会导致菱角幼苗生长速度慢、成本高和成活率低。

发明内容

本发明提供了一种菱角组培繁殖方法，旨在解决现有技术中菱角通过种子育苗播种存在品种纯度不纯和成本高的问题。

为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案为：

一种菱角组培繁殖方法，包括：

S1、外植体的制备：取菱角，剪切成带腋芽的茎段，进行灭菌消毒及清洗处理，得到灭菌消毒后的外植体；

所述外植体的消毒步骤为：将茎段的表面洗净，用酒精浸泡25-35s，转移到超净工作台内，用无菌水漂洗，然后用次氯酸钠溶液浸泡10-20min，最后用无菌柠檬酸水浸洗4-7遍，得到灭菌消毒后的外植体；

S2、启动培养：将所述灭菌消毒后的外植体接种于启动培养基，再加入无菌水后进行启动培养，先进行暗培养，再进行光暗交替培养，得到无菌苗；

所述启动培养基包括2.0-2.5g/L MS基础培养基、0.10-0.50mg/L盐酸硫胺素、0.10-0.20g/L一水合柠檬酸、12-18g/L蔗糖、8.0-12g/L葡萄糖溶液、4.0-6.0g/L植物琼脂和0.40-0.60mg/L6-BA，调节pH＝5.5-6.5；

所述启动培养条件为温度在22-28℃之间，光照强度在1200-1800lux之间；

S3、增殖培养：取至少带两个芽点的无菌苗茎段接种于增殖培养基上，加入无菌水，光暗交替培养得到组培苗或生根苗；

所述增殖培养基包括4.0-4.5g/L MS基础培养基、0.10-0.50mg/L盐酸硫胺素、0.10-0.20g/L一水合柠檬酸、25-35g/L蔗糖、4.0-6.0g/L植物琼脂、2.0-3.0mg/L6-BA和0.08-0.12mg/LNAA，调节pH＝5.5-6.5；

所述增殖培养条件为温度在22-28℃之间，光照强度在1200-1800lux之间。

优选的方案，在步骤S1中，所述外植体的消毒步骤为：将茎段的表面洗净，用70％的酒精浸泡30s，转移到超净工作台内，用无菌水漂洗一遍，然后用2％的次氯酸钠溶液浸泡15min，最后用0.15％的无菌柠檬酸水浸洗6遍，得到灭菌消毒后的外植体。

基于上述方案，用2％次氯酸钠浸泡外植体，不仅能杀灭细菌的繁殖体和芽胞，而且对真菌、病毒也有较好的杀灭效果。试验证明，当外植体用所述2％次氯酸钠浸泡时间低于15min时，褐化数较低，但污染数较高，成活率较低；当外植体用所述2％次氯酸钠浸泡时间高于15min时，污染数较低，但褐化数较高，成活率较低；但当外植体用所述2％次氯酸钠浸泡15min时，褐化数和污染数都较低，且成活率高，有利于外植体发芽。

优选的方案，在步骤S2中，所述启动培养基包括：2.202g/L 1/2MS基础培养基、0.3mg/L盐酸硫胺素、0.15g/L一水合柠檬酸、15g/L蔗糖溶液、10g/L葡萄糖、5g/L植物琼脂和0.5mg/L 6-BA，调节pH＝5.8，再加入20ml无菌水进行启动培养。

基于上述方案，试验证明，外植体在1/2MS基础培养基浓度为2.202g/L、盐酸硫胺素浓度为0.3mg/L、一水合柠檬酸浓度为0.15g/L、蔗糖浓度为15g/L、葡萄糖溶液浓度为10g/L、植物琼脂浓度为5g/L、6-BA浓度为0.5mg/L和pH＝5.8的条件下培养，不加入无菌水时，菱角无菌苗的褐化数较高，成活率较低，但加入20ml无菌水进行启动培养后，菱角幼苗的褐化数大幅度降低，成活率得到很大提高，无菌水避免了菱角幼苗受细菌感染，降低了无菌苗的褐化率，提高了无菌苗的成活率。

优选的方案，在步骤S2中，所述启动培养条件为：温度25℃，光照强度1500lux。

基于上述方案，所述菱角对温度和光照比较敏感，在水温25℃和光照强度1500lux的时候进行发芽育苗最合适；所述菱角在光照充足、强度适中能够促进光合作用，生长的更快、形状更好。

优选的方案，在步骤S2中，所述外植体光照培养13h，暗培养11h，暗培养7天后，再光暗交替培养28天，得到无菌苗。

基于上述方案，菱角发芽时间为4-5月，昼长夜短，模拟4-5月的菱角光周期更适宜菱角外植体的发芽。

优选的方案，在步骤S3中，所述芽点包括无菌苗的顶芽和基部芽丛，所述顶芽取0.8-1.2cm，基部丛芽取0.5-0.8cm，茎段取0.8-1.2cm。

基于上述方案，顶芽取0.8-1.2cm和基部丛芽取0.5-0.8cm为芽生长最旺盛的部位，茎段取0.8-1.2cm为茎段最健壮的部位。

优选的方案，在步骤S3中，所述增殖培养基包括：4.405g/L MS基础培养基、0.3mg/L盐酸硫胺素、0.15g/L一水合柠檬酸、30g/L的蔗糖溶液、5g/L植物琼脂、2.5mg/L6-BA和0.1mg/LNAA，调节pH＝5.8，再加入20ml无菌水进行增殖培养。

基于上述方案，试验证明，当MS基础培养基浓度为4.405g/L、盐酸硫胺素浓度为0.3mg/L、一水合柠檬酸浓度为0.15g/L、的蔗糖溶液浓度为30g/L、植物琼脂浓度为5g/L、6-BA浓度为2.5mg/L和pH＝5.8，再添加浓度为0.1mg/L的NAA，并加入20ml无菌水进行增殖培养时，幼苗生长状况最好，不仅苗体健壮、叶色鲜亮，而且丛芽多，有利于种植。当所述增殖培养基不添加所述NAA时，幼苗生长状况差，丛芽少，但当所述NAA的浓度高于或低于2.5mg/L时，菱角幼苗的丛芽数量仍然较少，不适于增殖培养；当所述增殖培养基不加入无菌水时，菱角幼苗受细菌病毒残害，幼苗褐化严重，苗体虚弱，叶色发黄。

优选的方案，在步骤S3中，所述增殖培养条件：温度25℃，光照强度1500lux。

基于上述方案，菱角增殖培养过程中对温度和光照条件要求严格，菱角在25℃，光照强度1500lux的条件下增殖效果更佳。

优选的方案，在步骤S3中，所述无菌苗光照培养13h，暗培养11h，光照交替培养28天得到组培苗或生根苗。

基于上述方案，菱角增殖过程中，通过模拟植物自然生长光周期，通过光照培养和暗培养的交替来促进根的形成和培养壮苗。

优选的方案，所述组培苗可用于继代培养，所述生根苗可用于生根。

本发明的有益效果为：

本发明提供了一种菱角组培繁殖方法，通过对菱角茎段进行灭菌消毒制备外植体，经过启动培养和增殖培养获得可用于继代培养或生根的幼苗，具有以下优点：

1、使用健壮的菱角茎段制备外植体，培养外植体生长出幼苗，对于资源保存来说，提高了菱角的品种纯度，保持原有品种的固有性状和特性，移植该幼苗生长出来的菱角品质也得到了保障，避免了通过播种育苗的方式带来的品种纯度参差不齐的现象。

2、在本发明提供的所述启动培养基的配方中，包括MS基础培养基、盐酸硫胺素、一水合柠檬酸、蔗糖溶液、葡萄糖溶液、植物琼脂和6-BA，并将pH都调至5.8。其中，所述MS基础培养基能够保证组织生长所需的矿质营养，所述盐酸硫胺素对菱角的生长、分化等有很好的促进作用；所述一水合柠檬酸可以维持培养基的酸碱平衡；所述蔗糖和葡萄糖可以为菱角提供碳源和营养物质；所述植物琼脂可以使培养基凝胶化，凝胶化后的培养基可以提供一个稳定的基质，使菱角能够在其中生长和繁殖；所述6-BA可以促进菱角的幼芽形成，并且都加入无菌水避免细菌病毒感染幼苗。菱角外植体在本发明提供的启动培养基培养下，得到的无菌苗褐化数低，成活率高。

增殖培养基在启动培养基的配方基础上，不添加葡萄糖溶液，但加入了NAA，所述NAA是植物成长过程中的成长剂，可以促进菱角的生根和细胞分裂，有助于菱角无菌苗的增殖生长。增殖系数可达1：3-3.5，株高2.0cm左右，菱角幼苗存活率高且苗体健壮，叶色鲜亮，从芽旺盛，且所述启动培养和增殖培养的培养周期短，可以实现大量生产优质菱角种苗。

3、本发明提供的菱角组培快繁技术，在试管或瓶子内培养，占地空间小，周转快，可连续培养，节省了水田场地和水资源。组培过程中，温度、光照和水质条件容易控制，能为菱角幼苗提供适宜的环境，还能避免菱角幼苗受到病毒细菌的毒害。

4、在组织培养过程中模拟了菱角自然生长光周期，通过光照培养和暗培养的交替来促进根的形成和培养壮苗。在外植体发芽的过程中，光照会抑制外植体的发芽，并影响外植体的生化反应，在早期种苗阶段，所述外植体进行暗培养是为了避免光照对发芽的影响，提高发芽率和幼苗质量，以满足生长的需要，所以需要先进行暗培养在进行光暗交替培养。

5、本发明提供的菱角外植体消毒方法方式安全，不会影响菱角的食用价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简要介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关附图。

图1是本发明中外植体发芽获得无菌苗的状态示意图。

图2是本发明中无菌苗增殖培养获得组培苗或生根苗的状态示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚完整的描述。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。

本实施例的提供了一种菱角组培繁殖方法，包括：

S1、外植体的制备：取菱角，剪切成带腋芽的茎段，进行灭菌消毒及清洗处理，得到灭菌消毒后的外植体；

所述外植体的消毒步骤为：将茎段的表面洗净，用酒精浸泡25-35s，转移到超净工作台内，用无菌水漂洗，然后用次氯酸钠溶液浸泡10-20min，最后用无菌柠檬酸水浸洗4-7遍，得到灭菌消毒后的外植体；

S2、启动培养：将所述灭菌消毒后的外植体接种于启动培养基，再加入无菌水后进行启动培养，先进行暗培养，再进行光暗交替培养，得到无菌苗；

所述启动培养基包括2.0-2.5g/L MS基础培养基、0.10-0.50mg/L盐酸硫胺素、0.10-0.20g/L一水合柠檬酸、12-18g/L蔗糖溶液、8.0-12g/L葡萄糖溶液、4.0-6.0g/L植物琼脂和0.40-0.60mg/L6-BA，调节pH＝5.5-6.5；

所述启动培养条件为温度在22-28℃之间，光照强度在1200-1800lux之间；

S3、增殖培养：取至少带两个芽点的无菌苗茎段接种于增殖培养基上，加入无菌水，光暗交替培养得到组培苗或生根苗；

所述增殖培养基包括4.0-4.5g/L MS基础培养基、0.10-0.50mg/L盐酸硫胺素、0.10-0.20g/L一水合柠檬酸、25-35g/L蔗糖溶液、4.0-6.0g/L植物琼脂、2.0-3.0mg/L 6-BA和0.08-0.12mg/LNAA，调节pH＝5.5-6.5；

所述增殖培养条件为温度在22-28℃之间，光照强度在1200-1800lux之间。

其中，在步骤S1中，一种较优的实施方案：将茎段的表面洗净，用70％的酒精浸泡30s，转移到超净工作台内，用无菌水漂洗一遍，然后用2％的次氯酸钠溶液浸泡15min，最后用0.15％的无菌柠檬酸水浸洗6遍，得到灭菌消毒后的外植体。

具体的，选择健壮的菱角，用带腋芽的茎段作为外植体，先切取菱角鲜绿的茎部，把表面刷洗干净后；然后用自来水冲洗20min，把表面冲洗干净；从洗干净的茎上切取已经萌发的幼芽，注意尽可能多地保留幼芽基部，用容器盛放再冲洗一遍；用70％的酒精浸泡30s，转移到超净工作台内，用无菌水漂洗一遍，然后用2％的次氯酸钠溶液浸泡15min，杀灭细菌的繁殖体和芽胞，最后用0.15％的无菌柠檬酸水浸洗6遍，晾干后接种于启动培养基上。

为了使育苗效果更好，在步骤S2中，每个培养瓶只接入1个幼芽。其中，较优的实施方案：所述启动培养基包括2.202g/L 1/2MS基础培养基、0.3mg/L盐酸硫胺素、0.15g/L一水合柠檬酸、15g/L蔗糖溶液、10g/L葡萄糖、5g/L植物琼脂和0.5mg/L 6-BA，调节pH＝5.8，再加入20ml无菌水进行启动培养。

或者，所述启动培养基包括2.0g/L MS基础培养基、0.10mg/L盐酸硫胺素、0.10g/L一水合柠檬酸、12g/L蔗糖溶液、8.0g/L葡萄糖溶液、4.0g/L植物琼脂和0.40mg/L6-BA，调节pH＝5.5；

或者，所述启动培养基包括2.5g/L MS基础培养基、0.50mg/L盐酸硫胺素、0.20g/L一水合柠檬酸、18g/L蔗糖溶液、12g/L葡萄糖溶液、6.0g/L植物琼脂和0.60mg/L6-BA，调节pH＝6.5。

由于所述菱角对温度和光照比较敏感，一种较优的实施方案，所述启动培养条件为：温度25℃，光照强度1500lux。在光照条件下培养13h，暗培养11h，暗培养7天后，再光暗交替培养28天，得到无菌苗。

增殖培养需取至少带两个芽点的茎段，所述芽点包括无菌苗的顶芽和基部芽丛，所述顶芽取0.8-1.2cm，基部丛芽取0.5-0.8cm，茎段取0.8-1.2cm。

其中，为了使无菌苗获得均衡的营养条件和生长环境，在步骤S3中，较优的实施方案：所述增殖培养基包括4.405g/LMS基础培养基、0.3mg/L盐酸硫胺素、0.15g/L一水合柠檬酸、30g/L的蔗糖溶液溶液、5g/L植物琼脂、2.5mg/L6-BA和0.1mg/LNAA，有助于菱角无菌苗的增殖生长，调节pH＝5.8，再加入20ml无菌水进行增殖培养。

或者，所述增殖培养基包括4.0g/LMS基础培养基、0.10mg/L盐酸硫胺素、0.10g/L一水合柠檬酸、25g/L蔗糖溶液、4.0g/L植物琼脂、2.0mg/L 6-BA和0.08mg/LNAA，调节pH＝5.5；

或者，所述增殖培养基包括4.5g/LMS基础培养基、0.50mg/L盐酸硫胺素、0.20g/L一水合柠檬酸、35g/L蔗糖溶液、6.0g/L植物琼脂、3.0mg/L 6-BA和0.12mg/LNAA，调节pH＝6.5；

另外，一种较优的实施方案，所述增殖培养条件：温度25℃，光照强度1500lux；

在步骤S3中，所述无菌苗光照培养13h，暗培养11h，光照交替培养28天得到组培苗或生根苗，所述组培苗可用于继代培养，所述生根苗可用于生根。

为了能够更清楚地描述本发明，下面结合具体试验来做进一步的描述。

1、外植体的预处理

选择健壮的菱角，用带腋芽的茎段作为外植体。先切取菱角鲜绿的茎部，把表面刷洗干净后，然后用自来水冲洗20min，把表面冲洗干净；从洗干净的茎上切取已经萌发的幼芽，注意尽可能多地保留幼芽基部，用容器盛放再冲洗一遍；用70％的酒精浸泡30s，转移到超净工作台内，用无菌水漂洗一遍，然后用2％的次氯酸钠溶液浸泡10-20min，最后用0.15％的无菌柠檬酸水浸洗6遍，晾干后接种于启动培养基上。

表1外植体的灭菌消毒结果

结论：如表1所示，所述外植体用70％的酒精浸泡30s，用无菌水漂洗一遍，然后用2％的次氯酸钠溶液浸泡10-20min，最后用0.15％的无菌柠檬酸水浸洗6遍，得到灭菌消毒后的外植体。其中，当所述外植体用2％的次氯酸钠溶液浸泡10min时，外植体被污染数较高，成活率较低，灭菌效果较差，此方案不满足需求；当所述外植体用2％的次氯酸钠溶液浸泡20min时，污染数较低，但褐化数较高，成活率较低，此方案不满足需求；当所述外植体用2％的次氯酸钠溶液浸泡15min时，成活数最高，污染数和褐化数也较低，为最佳方案。

2、启动培养试验

将试验1中的外植体接种于启动培养基上，每个培养瓶只接入1个幼芽，接种完成后培养基上加入约20ml的无菌水，暗培养7天后，光暗交替培养28天，可得无菌苗。

启动培养条件：温度25±3℃，光照强度1500±300lux，光照培养13h/暗培养11h。

设置两组试验Test1和Test2，其中两组试验都用所述启动培养基培养，启动培养基包括：2.202g g/L 1/2MS基础培养基、0.3mg/L盐酸硫胺素、0.15g/L一水合柠檬酸、15g/L蔗糖溶液、10g/L葡萄糖溶液、5g/L植物琼脂和0.5mg/L6-BA，调节pH＝5.8，进行启动培养。其中，Test1组不加入无菌水的，Test2加入20ml无菌水，具体条件参见表2。

另外，所述MS基础培养基可以从市面上购买，例如品牌Duchefa等。

表2外植体的启动培养

表3外植体的启动培养结果

名称	样本数量	褐化	成活
				Test1	15	15	2
Test2	15	5	11

结论：由表2和表3可知，当没有加入无菌水时，褐化数极高，成活率极低，不满足需求；当加入20ml无菌水后，灭菌效果显著，褐化数大幅度降低，成活率得到了很大的提高，如图1，获得了较多的丛芽，适合进行下一步的培养，为最佳方案。

3、增殖培养试验

取无菌苗的顶芽，基部芽丛，以及茎段。其中顶芽取0.8-1.2cm，基部丛芽取0.5-0.8cm，茎段0.8-1.2cm，至少带2个芽点，接种于增殖培养基上，进行增殖培养。

温度：25±3℃；光照强度：1500±300lux；光照培养13h/暗培养11h，培养28天后，即可得用于继代的组培苗或用于生根的生根苗。

增殖培养基包括4.405g/L MS基础培养基、0.3mg/L盐酸硫胺素、0.15g/L一水合柠檬酸、30g/L蔗糖溶液、5g/L植物琼脂、2.0-5.0mg/L 6-BA和0.03-0.1mg/LNAA，调节pH＝5.8。通过设置不同浓度的6-BA和NAA，以及是否添加NAA设置了实验组Test1-Test8，其中Test1-Test4不添加无菌水，Test5-Test8添加了20ml无菌水，具体条件参见表4。

所述MS基础培养基可以从市面上购买，例如品牌Duchefa等。

表4增殖培养基的配方

表5增殖培养结果

结论：结果如表5所示，不加入无菌水条件下，不管6-BA和NAA的浓度如何，以及是否添加NAA，菱角幼苗的生长状况都较差，苗体较弱，叶色发黄，而且基部褐化严重。在加入无菌水的条件下，不添加NAA，6-BA的浓度为0.15mg/L时，叶色正常，当6-BA的浓度为1mg/L时，叶色较亮，但两项试验幼苗的丛芽都较少，不是最佳方案；当6-BA的浓度为2.5mg/L，并加入0.1mg/L的NAA时，培养菱角苗的生长状况最好，增殖系数达1：3-3.5，株高2.0cm左右，如图2，菱角幼苗健壮，叶色鲜亮，且丛芽旺盛，增殖数高，叶色鲜亮，增殖效果较理想，为最佳方案。

本发明不局限于上述可选实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是落入本发明权利要求界定范围内的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种菱角组培繁殖方法，其特征在于，包括：

S1、外植体的制备：取菱角，剪切成带腋芽的茎段，进行灭菌消毒及清洗处理，得到灭菌消毒后的外植体；

所述外植体的消毒步骤为：将茎段的表面洗净，用酒精浸泡25-35s，转移到超净工作台内，用无菌水漂洗，然后用次氯酸钠溶液浸泡10-20min，最后用无菌柠檬酸水浸洗4-7遍，得到灭菌消毒后的外植体；

S2、启动培养：将所述灭菌消毒后的外植体接种于启动培养基，再加入无菌水后进行启动培养，先进行暗培养，再进行光暗交替培养，得到无菌苗；

所述启动培养基包括2.0-2.5g/L MS基础培养基、0.10-0.50mg/L盐酸硫胺素、0.10-0.20g/L一水合柠檬酸、12-18g/L蔗糖、8.0-12g/L葡萄糖溶液、4.0-6.0g/L植物琼脂和0.40-0.60mg/L 6-BA，调节pH=5.5-6.5；

所述启动培养条件为温度在22-28℃之间，光照强度在1200-1800 lux之间；

S3、增殖培养：取至少带两个芽点的无菌苗茎段接种于增殖培养基上，加入无菌水，光暗交替培养得到组培苗；

所述增殖培养基包括4.0-4.5g/L MS基础培养基、0.10-0.50mg/L盐酸硫胺素、0.10-0.20g/L一水合柠檬酸、25-35g/L蔗糖、4.0-6.0g/L植物琼脂、2.0-3.0mg/L 6-BA和0.08-0.12mg/L NAA，调节pH=5.5-6.5；

所述增殖培养条件为温度在22-28℃之间，光照强度在1200-1800lux之间。

2.根据权利要求1所述的一种菱角组培繁殖方法，其特征在于，在步骤S1中，所述外植体的消毒步骤为：将茎段的表面洗净，用70%的酒精浸泡30s，转移到超净工作台内，用无菌水漂洗一遍，然后用2%的次氯酸钠溶液浸泡15min，最后用0.15%的无菌柠檬酸水浸洗6遍，得到灭菌消毒后的外植体。

3.根据权利要求1所述的一种菱角组培繁殖方法，其特征在于，在步骤S2中，所述启动培养基包括：2.202g/L 1/2MS基础培养基、0.3mg/L盐酸硫胺素、0.15g/L一水合柠檬酸、15g/L蔗糖溶液、10g/L葡萄糖、5g/L植物琼脂和0.5mg/L 6-BA，调节pH=5.8，再加入20ml无菌水进行启动培养。

4.根据权利要求1所述的一种菱角组培繁殖方法，其特征在于，在步骤S2中，所述启动培养条件为：温度25℃，光照强度1500lux。

5.根据权利要求1所述的一种菱角组培繁殖方法，其特征在于，在步骤S2中，所述外植体光照培养13h，暗培养11h，暗培养7天后，再光暗交替培养28天，得到无菌苗。

6.根据权利要求1所述的一种菱角组培繁殖方法，其特征在于，在步骤S3中，所述芽点包括无菌苗的顶芽和基部芽丛，所述顶芽取0.8-1.2cm，基部丛芽取0.5-0.8cm，茎段取0.8-1.2cm。

7.根据权利要求1所述的一种菱角组培繁殖方法，其特征在于，在步骤S3中，所述增殖培养基包括：4.405g/L MS基础培养基、0.3mg/L盐酸硫胺素、0.15g/L一水合柠檬酸、30g/L的蔗糖溶液、5g/L植物琼脂、2.5mg/L 6-BA和0.1mg/L NAA，调节pH=5.8，再加入20ml无菌水进行增殖培养。

8.根据权利要求1所述的一种菱角组培繁殖方法，其特征在于，在步骤S3中，所述增殖培养条件：温度25℃，光照强度1500lux。

9.根据权利要求1所述的一种菱角组培繁殖方法，其特征在于，在步骤S3中，所述无菌苗光照培养13h，暗培养11h，光照交替培养28天得到组培苗。

10.根据权利要求9所述的一种菱角组培繁殖方法，其特征在于，所述组培苗用于继代培养。