KR20110010871A

KR20110010871A - 여우구슬 부정근의 대량생산 방법

Info

Publication number: KR20110010871A
Application number: KR1020090068196A
Authority: KR
Inventors: 배기화; 최용의; 윤필용
Original assignee: 재단법인 제주테크노파크
Priority date: 2009-07-27
Filing date: 2009-07-27
Publication date: 2011-02-08

Abstract

본 발명은 여우구슬 부정근의 대량생산 방법에 관한 것이다.

본 발명의 여우구슬 부정근의 대량생산 방법은 여우구슬 종자를 멸균하여 무균화하는 단계와, 1/3 MS배지위에 치상하여 상기 무균화된 여우구슬 종자의 발아를 유도하는 단계와, 발아된 여우구슬의 어린가지 부위를 IBA(Indole-3-butyric acid)가 첨가된 MS 배지위에 치상하여 1차 부정근을 유도하는 단계와, 상기 유도된 1차 부정근을 생물반응기를 통해 배양하되, IBA와 슈크로스가 첨가된 MS 액체배지를 이용하여 2차 부정근을 유도하고 이를 배양하는 단계를 포함하여 구성된다.

본 발명에 의해, 여우구슬의 종자발아체를 이용하여 부정근을 유도함으로써 대량생산이 가능하며, 두차례의 부정근 유도화단계를 거침으로써 캘러스화 현상을 방지하여 전체적인 형태와 정근부분이 정상적으로 형성되는 여우구슬 부정근의 대량 생산방법이 제공된다.

여우구슬, 부정근, 유도, 대량, 생산

Description

여우구슬 부정근의 대량생산 방법{MASS PROPAGATION METHOD OF ADVENTITIOUS ROOT PHYLLANTHUS URINARIA}

본 발명은 여우구슬 부정근의 대량생산 방법에 관한 것으로써, 특히 캘러스화 현상을 방지한 여우구슬 부정근의 대량 생산방법에 관한 것이다.

B형 간염 바이러스(HBV)는 인체에 특이적으로 감염되는 헤파드나바이러스과(Hepadnaviridae) 계통의 바이러스로서, 잠복기는 60 내지 110일 정도이며 임상기를 거쳐 90 ~ 95 %는 감염으로부터 완전히 회복된다.

감염에서 회복되지 않은 경우에는 HBV DNA가 사람 간세포의 게놈 DNA에 동화되어 만성 활동성간염, 간경변, 간암으로 발전하게 된다.

HBV에 의한 만성간염은 만성 바이러스 감염증, 임파종 질환 및 만성신장장애를 일으켜 결국 사망에까지 이르게 하는 치사율이 매우 높은 질환이라 할 수 있다.

B형 간염 치료제로서 몇 가지 약제가 개발되기는 하였으나 만족할만한 효능을 지닌 것은 거의 없으며, 아라-에이 (Ara-A)라든가 아시클로버 (Acyclovir) 등 현재 사용되고 있는 약제들도 독성이 강하다는 사실이 문제로 되고 있다.

이에 최근에 이러한 부작용이 없으면서 효과적으로 병원균을 치료하는데 중 점을 두어 연구를 진행하고 있다.

이러한 방법 중에 한가지인 천연물에서 추출, 정제하여 약제로 사용하려는 연구들이 다방면으로 진행되고 있다.

우리나라에서는 수년전부터 여우구슬 (Phyllanthus. urinaria)을 주 원료로한 추출물형태의 간염치료제가 개발되어 시판되고 있다.

대극과 (Euphorbiaceae)과에 속하는 식물은 목본으로 광대싸리 (Securinega suffruticosa)가 있고 초본으로는 여우구슬 (Phyllanthus. urinaria)과 여우주머니 두 종이 우리나라에 서식하는 것으로 알려져 있다.

여우구슬은 줄기가 곧게 자라며 줄기에는 여러 개의 가지가 착생한다.

기록에 의하면 50 cm 내외로 자란다고 되어 있지만 비배(肥培)조건만 좋게 하면 20 ~ 30 cm가 더 자랄 수가 있다.

여우구슬의 자연적 생육지는 황지(荒地)나 묵밭 또는 들판의 잔디밭 사이에서 홀로 또는 군락을 이르고 자라는데 우리나라에서는 제주부터 평북지역에 이르기까지 광범위하게 분포하는 것으로 알려져 있다.

여우주머니과 계통의 식물로 여우구슬(Phyllnthus urinaria)을 포함하여 P. cochinchinesis, P. embtica, P. matsumurae, 등이 현재 약용되고 있으며 , 주요성분으로는 탄닌계 성분들과 트리테르펜(triterpene)이 함유되어 있으며, P. discoides에서는 새로운 알칼로이드로서 phyllantine, phyllantidine, phyllanthine이 분리되어 있다.

한편 인도, 태국 등지에서 나며 80년대 후반서부터 각광을 받고 있는 여우주 머니과계통의 식물인 여우주머니(Phyllanthus niruri)는 nirurine, 4-Methoxynorsecurinine 등의 신규한 알칼로이드(alkaloid)와 리그난(lignan) 화합물로서 nirtetralin, hypophyllanthin, phyltetralin, phyllanthin, lintetralin 등과 신규 phthalic acid 유도체인 phthalic acid bis-ester 등이 분리되어 있다.

이러한 연구들 중에 특히 주목해야 할 것은 phyllanthoside의 분리인데 이 물질은 항암 효과을 지니는 물질로 보고되어 있다. 이 물질의 화학적인 특성으로 보아 항암의 효과에 대해서 긍정 적인 평가가 내려져 있고 간암 환자에 대한 이 물질의 투여에 의해서 간 조직 내의 병적(neoplastic)핵산유도체의 실질적인 감소가 임상적으로 증명이 되었다.

하지만 이러한 천연물을 생산하기 위해서는 자연상태의 산물들을 채집하거나 인위적으로 재배하여 공급을 해야 한다.

그러기 위해서는 이들 서식지의 확보와 서식환경의 확보등이 우선적으로 연구가 되어 져야 하지만 아직까지 국내에서 이들 서식지에 관한 연구뿐만 아니라 기내 조직배양에 관한 연구들도 전무한 상태이다.

또한 재배를 통한 생산 역시 목적물질의 감소와 농약등이 문제시 될 수 있고 노동집약적이기 때문에 생산에 따른 경제적 효율은 그리 높지 않을 것으로 예상된다.

본 발명은 상기와 같은 문제를 해결하기 위하여, 약리작용이 뛰어난 여우구슬의 유식물체로부터 부정근의 유도에 미치는 배양재료, 배지조건, 옥신의 종류등의 배양조건을 확립하고 부정근의 액체배양 체계 확립과 생물반응기를 이용한 기내 대량생산 및 증식을 하기 위한 기초 실험체계를 확립하는데 목적을 두었다.

이에, 본 발명에서는 여우구슬의 종자발아체를 이용하여 부정근을 유도하며, 특히 두차례의 부정근 유도화단계를 거침으로써 캘러스화 현상을 방지하여 전체적인 형태와 정근부분이 정상적으로 형성되는 여우구슬 부정근의 대량 생산방법을 제공하게 된다.

본 발명의 여우구슬 부정근 대량 생산방법으로는 여우구슬 종자를 멸균하여 무균화하는 단계와, 1/3 MS배지위에 치상하여 상기 무균화된 여우구슬 종자의 발아를 유도하는 단계와, 발아된 여우구슬의 어린가지 부위를 IBA(Indole-3-butyric acid)가 첨가된 MS 배지위에 치상하여 1차 부정근을 유도하는 단계와, 상기 유도된 1차 부정근을 생물반응기를 통해 배양하되, IBA와 슈크로스가 첨가된 MS 액체배지를 이용하여 2차 부정근을 유도하고, 이를 배양하는 단계를 포함하여 구성된다.

또, 상기 1차 부정근 유도하는 단계에서 IBA가 3.0 mg/ℓ 첨가된 MS배지를 사용하는 것이 특징이다.

또, 상기 2차 부정근을 배양하는 단계에서 IBA가 1.0 mg/ℓ, 슈크로스가 3.0 mg/ℓ 첨가된 MS배지를 사용하는 것이 특징이다.

또, 상기 2차 부정근을 배양하는 단계에서 염의 농도가 1/2인 MS 배지를 사용하는 것이 특징이다.

또한, 상기 2차 부정근을 배양하는 단계에서 생물반응기 내부로 1차 부정근 10 g당 4L의 액체배지를 넣고 22 ± 1℃에서 배양하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 의해, 여우구슬의 종자발아체를 이용하여 부정근을 유도함으로써 여우구슬 부정근의 대량 생산방법이 제공된다.

또한, 두차례의 부정근 유도화단계를 거침으로써 캘러스화 현상을 방지하여 전체적인 형태와 정근부분이 정상적으로 형성되는 여우구슬 부정근의 대량 생산방법이 제공된다.

본 발명은 여우구슬 부정근의 대량 생산방법에 관한 것으로써, 여우구슬의 기내 부정근 유도 및 증식조건의 확립을 목적으로 수행되었다.

우선 여우구슬의 기내 발아체로부터 부위(shoot and root)를 달리하여 부정근을 유도한 결과 shoot 부위는 root보다 양호한 부정근의 유도를 보였다.

또한 유도된 부정근을 이용하여 옥신의 종류 (IAA, IBA, NAA와 2.4-D)에 따른 부정근 유도율을 조사한 결과 IBA와 NAA는 IAA와 2.4-D보다 높은 유도율을 보였 다. IBA의 농도에 따른 유도율과 증식효율은 IBA가 1.0 mg/L첨가되었을 때 가장 높은 유도 및 증식효율을 보였다.

최적의 액체배지조건을 확인하고자 IBA의 농도는 1.0 mg/L로 첨가하고 sucrose의 농도를 달리하여 실험한 결과 sucrose는 30 g/L 첨가 되었을 때 가장 높은 생중량과 건중량을 나타냈다.

액체배양된 여우구슬의 부정근을 각각 MS, 1/2MS, 1/3MS배지에 30 g/L sucrose, 1.0 mg/L IBA가 첨가된 5L 용량의 생물반응기에 4주간 배양한 결과 1/2MS 배지에서 양호한 생장을 보였다.

본 발명에서는 여우구슬의 종자발아체를 이용하여 부정근의 유도 및 증식조건에 필요한 기내배양조건을 조사하였고 2차적으로 유도된 부정근을 이용하여 플라스크와 생물반응기 배양을 통한 효율적인 증식조건을 조사하였다.

또한, 뿌리를 식용으로 하는 경우 생물반응기 배양을 통해 현탁세포배양 배양 방법보다 유전적, 생화학적으로 안정적이라는 것이 지배적이다.

따라서 장기적으로 뿌리저장기관이 함유하고 있는 유용한 물질의 생산이라는 측면에서 적합한 재료인 것으로 보고되고 있다.

이에 삼각플라스크와 생물반응기를 통한 액체배양의 증식조건도 확립하였다.

이러한 결과는 처음으로 여우구슬의 기내 부정근의 생산 체계를 확립하였다고 생각되어지고 향후 여우구슬을 이용한 생리활성물질의 생산 등, 다양한 식물소재개발연구에 중요한 기초자료를 제공할 것으로 보여진다.

이하, 본 발명에 대하여 실시예를 통하여 보다 상세히 설명하나, 이들이 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

<실시예 1> 시료의 무균처리 및 무균발아

(1) 시료 무균처리

여우구슬 (Phyllanthus. urinaria L.)의 종자를 강원도 방태산 인근에서 채집하였다.

상기 종자는 3개월간 저온처리한 후 포화수분 상태에서 24시간 침지한 후 종피를 완전히 제거 하였다.

종자의 소독은 70% 에탄올에 1분, 1% 차아염소산 나트륨용액에 15분간 침지한 후 멸균수로 5회 세척하였다.

(2) 무균발아

상기와 같이 멸균된 종자는 식물생장조절물질이 첨가되지 않은 1/3MS (Murashige and Skoog, 1962) 배지에 치상하여 무균발아를 하였다.

실험에 사용한 모든 배지와 기구는 121℃, 1.5기압으로 20분간 고온,고압 멸균하여 페트리디쉬(petri dish)에 각각 30 mℓ씩 분주하여 사용하였다.

<실시예 2> 1차 부정근 유도

기내배양 체계가 확립되어 있지 않은 식물의 경우 이들을 이용한 부정근의 유도는 초기 배양재료나 부위의 선택이 중요하다.

이에 상기 실시예 1과 같이 발아된 여우구슬의 임의부위별로 1차 부정근을 유도해 보았다.

구체적으로 설명하면. 상기 발아된 여우구슬의 어린가지(Shoot)와 뿌리(Root)를 나누어 실험하되, shoot 부위는 root 부위를 제거하고 0.5 cm 정도로 횡절단하여 실험에 사용하였다.

Root는 근단을 포함하여 1 cm로 절단하여 실험에 사용하였다.

MS배지에 3.0 mg/L의 IBA(Indole-3-butyric acid)가 첨가된 배지위에 치상하여 4주 후 부정근의 개수, 길이를 조사하였다.

절편은 Petri dish당 10개씩, 총 30개씩 각각 치상하였고 22 ± 1℃에서 암배양 하였다.

이때 모든 데이터(*)는 means ± 표준편차(SD,standard diviation)으로 표시하였다.

변인들의 집단간 차이를 알아보기 위해서 ANOVA를 실시하였고, 유의성이 있는 경우 Duncan's multiple range test로 사후검증을 하였다.

통계적 유의성은 P〈0.05로 설정하여 분석하였다.

그 결과, 아래의 표 1과 같이 나타났다.

시료부위 (Explants)	부정근의 수 (No. of adventitious root/segment)	부정근의 길이 (Length of adventitious root /segment (mm))
shoot	28.4 ±3.5^*a	48.1±7.5a
root	14.3±3.8b	33.4±5.6b

상기 표 1에 나타나 있듯이, 종자로부터 발아하여 2주된 여우구슬의 유식물체를 shoot 와 root 부위로 구분한 다음 IBA 3.0 mg/L이 첨가된 MS 배지에 치상하여 4주간 배양한 후 절편에 따른 부정근의 유도갯수, 길이를 조사하였다.

초본류인 여우구슬은 shoot와 root 부위에서 대체적으로 양호한 부정근의 유도를 보였다.

하지만 유식물체의 root부위를 배양하여 부정근을 유도한 경우 shoot 부위보다 배양체가 캘러스화가 되는 경향을 보였으며, Shoot 부위를 이용하여 부정근을 유도 하였을 때 절편당 유도갯수, 길이가 root 부위보다 높았다.

이에 여우구슬의 경우 IBA를 기본으로 포함하는 MS배지에서 부정근의 유도는 shoot 부위를 이용하는 것이 가장 효과적인 것으로 사료된다.

<실시예 3> Auxin의 종류 및 IBA농도에 따른 2차 부정근 유도

상기 실시예 2과 같이 어린가지로 부터 유도된 여우구슬의 1차 부정근을 Auxin의 종류 및 IBA농도에 따라 2차 부정근을 유도하였다.

구체적으로 설명하면, 상기 실시예 2에서 유도된 여우구슬의 1차 부정근 절편의 근단을 1 cm로 절단하여 sucrose가 30 g/L 포함된 MS배지에 2,4-D, IAA, IBA, NAA가 1 mg/L 첨가하여 10개씩 각각 30개의 절편을 치상하였다.

배양 4주후에 부정근의 유도율을 조사하였다.

절편은 식물생장조절제의 처리에 따라 petri dish당 10개씩, 총 30개씩 각각 치상하였고 22 ± 1℃에서 암배양 하였다.

그 결과, 아래의 표 2와 도 1, 2, 3과 같이 나타났다.

IBA농도별 (IBA concentration, mg/ℓ)	부정근의 수 (No. of adventitious root/segment)	부정근의 길이 (Length of adventitious root (mm))
0	32.7±6.7^*e	55.0±12.3d
0.1	158.0±6.6b	103.7±22.3b
0.5	228.7±18.1a	225.0±12.6a
1.0	134.7±8.5bc	85.7±11.3bc
3.0	48.3±4.0d	19.0±3.7e
5.0	33.7±3.8de	12.3±4.7f

상기와 같이 옥신의 종류에 따라서 부정근의 유도를 비교하기 위해 1.0 mg/L 2,4-D, IAA, NAA, 및 IBA가 첨가된 MS배지에 근단을 포함하는 부정근을 치상하여 4주간 배양한 후 절편당 유도개수와 길이를 조사하였다.

옥신을 첨가하지 않은 처리구에서는 부정근의 한쪽 절단면의 길이신장만 이루어졌고, IAA와 2,4-D가 첨가된 배지에서는 조직이 캘러스화 되는 현상이 보였다(도 2C, D)

NAA가 첨가된 배지에서는 측근이 유도되면서 모절편이 캘러스화 되는 경향을 보였다 (도 2B).

IBA를 포함하는 배지에서 생장한 부정근은 전체적인 형태와 근정단 부분 (root tip)이 정상적이고 측근형성이 양호함을 보였으며 (도 2A), 부정근의 유도는 각 절편당 10개, 길이는 21.9 cm로 가장 높았다 (도 1, 표 2).

이상의 결과로 볼 때 초기 부정근의 유도는 옥신류 홀몬 중에 IBA를 선택하는 것이 좀 더 효율적일 것으로 사료된다.

2차 부정근의 유도 시 가장 효과적인 옥신으로 조사된 IBA를 바탕으로 농도에 따라서 부정근의 유도를 알아보기 위해 0, 0.1, 0.5, 1.0, 3.0, 및 5.0 mg/L의 IBA가 첨가된 MS배지에 부정근을 치상하여 4주간 배양한 후 개수, 길이, 생중량, 및 건중량을 조사하였다.

1.0 mg/L의 IBA (도 3D)를 기준으로 농도가 낮을수록 측근의 발달이 적었고 (도 3A, B, C).

반면에 IBA의 농도가 높아지면 부정근이 캘러스화 현상을 보이며 측근의 발달이 이루어짐을 확인할 수 있었고(도 3E) IBA가 5.0 mg/L첨가된 배지에서는 부정근의 유도 양상이 전혀 포착되지 않았다 (도 3F).

산삼, 인삼 그리고 시호의 경우 부정근의 유도는 2,4-D를 처리한 다음 캘러스를 유도한 후 증식된 캘러스로부터 부정근을 유도하는 단계로 진행이 된다 (Paek and Chakravarthy 2003; Yu et al. 2000; Kim et al 1995).

하지만 본 연구에서는 여우구슬 식물체의 shoot와 root 부위에서 캘러스의 유도나 증식 없이 1.0 mg/L IBA가 첨가된 MS 배지에서 짧은 기간안에 부정근을 유도 할 수 있었다.

<실시예 4> sucrose농도에 따른 2차 부정근 증식

상기 실시예 3의 결과에서 IBA가 1.0 mg/L 첨가된 배지에서의 여우구슬 부정근 유도 및 증식은 다른 옥신에 비해 효과적이기 때문에 MS 배지를 기본으로 IBA의 농도는 1.0 mg/L로 고정하고 sucrose의 농도를 달리하여 액체배양에 따른 생중량의 증가를 조사하였다.

구체적으로 설명하면, 고체배지조건에서 확립한 IBA의 1.0 mg/L를 기본으로 하여 sucrose가 0, 10, 30, 및 50 g/L첨가된 액체배지를 조성하였다.

여우구슬 부정근 1 g을 취해서 위에 제조된 배지에 접종하여 22 ± 1℃에서 암배양 하였다.

배양용기는 250 mL의 삼각플라스크(Horex, Germany)를 사용하였고, 배지는 100 mL를 첨가하였다.

배양은 4주간 110 rpm으로 액체배양 하였으며, 4주후 생중량과 건중량을 조사하였다.

그 결과 도 4에 나타나 있듯이, Sucrose의 농도는 30 g/L가 첨가된 배지가 생중량과 건중량이 10 g/L와 50 g/L의 sucrose가 첨가된 배지보다 각각 2배, 0.5 배 높았다.

이상의 결과로 볼 때 sucrose의 적정 농도는 30 g/L로 판단되어 지고 이보다 낮거나 높으면 생장이 감소됨을 관찰하였다.

설명하면, 여우구슬의 경우 sucrose가 30 g/L 첨가되었을 때 가장 높은 생중량과 건중량을 보였다.

Sucrose가 첨가되지 않은 배지에서는 부정근의 생장이 일어나지 않았고 50 g/L 정도의 고농도로 처리가 되면 생장량이 낮아지는 것으로 보아 적절한 sucrose (탄소원)의 농도는 여우구슬 부정근의 증식에 있어서 중요한 요소인 것으로 보여 진다.

<실시예 5> MS salt 농도에 생물반응기 배양

생물반응기는 대량생산과 생산비 절감에 초점을 맞추어 약용식물의 biomass 생산연구에 이용되어왔다.

부정근은 생물반응기 배양을 통한 biomass생산시 연속적인 증식과 안정적인 공급이 가능한 배양재료이다.

하지만 30일 이상 물에 잠겨서 배양하기 때문에 적절한 염의 농도를 고려해야 한다.

이에 따라 고체배지와 액체배지를 통해 부정근의 증식에 효과적인 배지조성을 확립하여 생물반응기 배양에 기본적인 배지로 선정하였다.

구체적으로 설명하면, 여우구슬의 부정근 10 g을 취해 5L 용적의 풍선형 생물반응기에 4L의 액체배지를 넣고 접종하여 22 ± 1℃에서 암배양 하였다.

배지의 제조는 MS, 1/2MS, 및 1/3MS를 각각 제조하였다.

IBA의 농도는 1.0 mg/L, sucrose는 30 g/L를 첨가하였다.

암조건에서 4주간 배양 후 부정근의 생중량과 건중량을 비교하였다.

그 결과 도 6에 나타나 있듯이, 고체배지 (도 6A)와 액체배지 (도 6B)를 통해 부정근의 증식에 효과적인 배지조성을 확립하여 생물반응기 배양에 기본적인 배지로 선정하였다.

배지는 IBA의 농도를 3.0 mg/L로 고정하고 sucrose가 30 g/L첨가된 배지에 MS, 1/2MS 그리고 1/3MS로 줄인 다양한 배지를 제조하여 4주후 생중량과 건중량을 조사하였다.

그 결과 MS 염의 농도를 1/2로 줄인 배지에서 가장 높은 생중량과 건중량을 나타냈다(도 5A, B).

도 1은 옥신 종류에 따른 2차 부정근의 성장길이를 나타낸 그래프.

IAA : 인돌아세트산(Indoleacetic acid)

IBA : 인돌뷰티르산(Indolebutyric acid)

NAA : 나프탈렌아세트산(Naphthalene acetic acid)

2,4-D : 2,4-디클로로페녹시아세트산(2,4-dichlorophenoxyacetic acid)

도 2는 옥신 종류에 따른 2차 부정근의 성장상태를 나타낸 도면.

A : IAA, B : IBA, C : NAA, D : 2,4-D

도 3은 IBA 농도에 따른 2차 부정근의 성장상태를 나타낸 도면.

A : 대조구(control) B : IBA 0.1 mg/ℓ

C : IBA 0.5 mg/ℓ D : IBA 1.0 mg/ℓ

E : IBA 3.0 mg/ℓ F : IBA 5.0 mg/ℓ

도 4는 슈크로스 농도에 따른 2차 부정근의 성장길이를 나타낸 그래프.

A : 생중량을 나타낸 도면

B : 건중량을 나타낸 도면

도 5는 MS salt 농도에 따른 2차 부정근의 성장길이를 나타낸 그래프.

A : 생중량을 나타낸 도면

B : 건중량을 나타낸 도면

도 6은 배양기 종류에 따른 2차 부정근의 성장상태를 나타낸 도면.

A : 페트리디쉬에서 배양상태를 나타낸 도면.

B : 250 ml 플라스크에서 배양상태를 나타낸 도면.

C : 생물반응기에서 배양상태를 나타낸 도면.

Claims

여우구슬 종자를 멸균하여 무균화하는 단계;

1/3 MS배지위에 치상하여 상기 무균화된 여우구슬 종자의 발아를 유도하는 단계;

발아된 여우구슬의 어린가지 부위를 IBA(Indole-3-butyric acid)가 첨가된 MS 배지위에 치상하여 1차 부정근을 유도하는 단계;

상기 유도된 1차 부정근을 생물반응기를 통해 배양하되, IBA와 슈크로스가 첨가된 MS 액체배지를 이용하여 2차 부정근을 유도하고, 이를 배양하는 단계;를 포함하여 구성된,

여우구슬 부정근 대량 생산방법.
제1항에 있어서,

상기 1차 부정근 유도하는 단계에서 IBA가 3.0 mg/ℓ 첨가된 MS배지를 사용하는 것을 특징으로 하는,

여우구슬 부정근 대량 생산방법.
제2항에 있어서,

상기 2차 부정근을 배양하는 단계에서 IBA가 1.0 mg/ℓ, 슈크로스가 3.0 mg/ℓ 첨가된 MS배지를 사용하는 것을 특징으로 하는,

여우구슬 부정근 대량 생산방법.
제3항에 있어서,

상기 2차 부정근을 배양하는 단계에서 염의 농도가 1/2인 MS 배지를 사용하는 것을 특징으로 하는,

여우구슬 부정근 대량 생산방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 생산방법에 있어서,

상기 2차 부정근을 배양하는 단계에서 생물반응기 내부로 1차 부정근 10 g당 4L의 액체배지를 넣고 22 ± 1℃에서 배양하는 것을 특징으로 하는,

여우구슬 부정근 대량 생산방법.