CN105638465B - 一种草莓的组培快繁方法 - Google Patents
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Classifications
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
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Abstract
本发明公开一种草莓的组培快繁方法，包括以下步骤：(1)外植体选取及灭菌：切取草莓叶片或萼片，清洗并进行灭菌处理后，得外植体；(2)愈伤组织诱导培养：将步骤(1)所得外植体接种到愈伤组织诱导培养基中培养2—3周，得愈伤组织；(3)分化及增殖培养：取步骤(2)所得愈伤组织，接种到分化培养基中培养5—6周，得分化幼芽；将所述分化幼芽接种到增殖培养基上培养8—9周，得增殖幼苗；(4)生根培养：将步骤(3)所得增殖幼苗分离成单株，接种到生根培养基中培养2—4周即得草莓无菌苗；其组培流程简便，培养时间短，增殖频率高，幼苗整齐，便于后期统一的移栽和种植管理，易于操作，可进行产业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及生物组培育苗技术领域，具体涉及一种草莓的组培快繁方法。
背景技术
草莓为蔷薇科、草莓属多年生草本，又名红莓、洋莓、地莓等，外观呈心形，鲜美红嫩，果肉多汁，含有特殊的浓郁水果芳香，其富含氨基酸、果糖、蔗糖、葡萄糖、柠檬酸、苹果酸、果胶、胡萝卜素、维生素B1、B2、烟酸及矿物质钙、镁、磷、钾、铁等，这些营养素对生长发育有很好的促进作用，对老人、儿童大有裨益。国外学者研究发现，草莓中的有效成分，可抑制癌肿的生长。每百克草莓含维生素C 50—100毫克，比苹果、葡萄高10倍以上，饭后吃一些草莓，可分解食物脂肪，有利消化，因此，草莓受到大量消费者的喜爱。目前的草莓主要通过营养生殖进行繁殖，但成活率不是很高，繁殖系数低，繁殖周期长，场地要求大，人工成本较高，远不能满足大量消费者的需求。
因此，如何提高其生产效率，缩短培育时间，降低人工成本，提高成活率，保持遗传稳定性，提高其繁殖系数成为目前亟待解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本申请提供一种草莓的组培快繁方法，所用培养基配方简单，组培流程简便，培养时间短，增殖频率高，幼苗整齐，便于后期统一的移栽和种植管理，降低了人工成本，能保证所长出的幼苗植株在形状上的一致性，易于操作，可进行产业化生产。
为解决以上技术问题，本发明提供的技术方案是一种草莓的组培快繁方法，包括以下步骤：
(1)外植体选取及灭菌：切取草莓叶片或萼片，清洗并进行灭菌处理后，得外植体；
(2)愈伤组织诱导培养：将步骤(1)所得外植体接种到愈伤组织诱导培养基中培养2—3周，得愈伤组织，所述愈伤组织诱导培养基的组成为：MS基本培养基，补充0.5—3.0mg/L TDZ、0.25—1.5mg/L NAA；
(3)分化及增殖培养：取步骤(2)所得愈伤组织，接种到分化培养基中培养5—6周，得分化幼芽；将所述分化幼芽接种到增殖培养基上培养8—9周，得增殖幼苗，所述分化培养基与所述增殖培养基的组成均为：MS基本培养基，补充0.5—3.5mg/L TDZ、0.05—0.25mg/LNAA；
(4)生根培养：将步骤(3)所得增殖幼苗分离成单株，接种到生根培养基中培养2—4周即得草莓无菌苗，所述生根培养基的组成为：1/2MS基本培养基，补充0.1—0.5mg/LIAA。
优选的，所述外植体选取及灭菌的具体操作为：切取草莓幼嫩叶片或萼片，清洗干净后，用体积分数2％巴氏消毒液处理4—6分钟，冲洗干净，在超净台上用75％的酒精处理15—25s，无菌水冲洗3—4次，再用0.1％的升汞处理4—6min，无菌水冲洗2—4次，再用体积分数4％的次氯酸钠溶液处理3—5min，无菌水冲洗2—5次，晾干即可。
更为优选的，所述叶片或萼片切取的长度为0.5—0.9cm。
优选的，所述愈伤组织诱导培养基的组成为：MS基本培养基，补充1.0—2.0mg/LTDZ、0.5—1.0mg/L NAA。
更为优选的，所述愈伤组织诱导培养基的组成为：MS基本培养基，补充1.5mg/LTDZ、1.0mg/L NAA。
优选的，所述分化培养基与所述增殖培养基的组成均为：MS基本培养基，补充1.0—3.0mg/L TDZ、0.05—0.10mg/L NAA。
更为优选的，所述分化培养基与所述增殖培养基的组成均为：MS基本培养基，补充2.0mg/L TDZ、0.05mg/L NAA。
优选的，所述生根培养基的组成为：1/2MS基本培养基，补充0.2—0.4mg/L IAA。
更为优选的，所述生根培养基的组成为：1/2MS基本培养基，补充0.3mg/L IAA。
优选的，所述愈伤组织诱导培养中，先进行暗培养5—8天，再进行光照下培养。
本申请所述MS基本培养基是由Murashige和Skoog设计的，无机盐量和离子浓度较高的培养基，元素之间平衡好，满足植物生长所需营养和生理，可作为多数植物组培快速繁殖的基本培养基。
所述1/2MS基本培养基为MS的大量元素减半，其他成分不变形成的培养基。
所述TDZ是一种植物生长调节剂，具有很强的细胞分裂素活性，可以促进植物芽的再生和繁殖，打破芽的休眼，促进种子萌发，促进愈伤组织生长，延缓植物衰老等，可以对其它的植物激素和生理活性物质的作用来调节植物的生长发育过程，可用作植物组织培养。
所述NAA为萘乙酸，是一种植物生长激素，在植物使用扦插法繁殖时使用，也可用于植物组织培养，能促进细胞分裂与扩大，诱导形成不定根增加座果，防止落果，改变雌、雄花比率等，可经叶片、树枝的嫩表皮，种子进入到植株内，随营养流输导到全株。
所述IAA为吲哚乙酸，是一种植物生长激素，能够调节植物的生长，不仅能促进生长，而且具有抑制生长和器官建成的作用。在细胞水平上，可刺激形成层细胞分裂、刺激枝的细胞伸长、抑制根细胞生长、促进木质部、韧皮部细胞分化、促进插条发根、调节愈伤组织的形态建成，因此可用作植物组织培养。
本申请与现有技术相比，其详细说明如下：本申请技术方案提供了一种草莓的组培快繁方法，包括外植体的选取及灭菌、愈伤组织诱导培养、分化及增殖培养、生根培养的步骤，通过对愈伤组织诱导培养基、分化培养基、增殖培养基、生根培养基的筛选，得到最佳的培养基组分和配比，采用前述植物生长激素配比形成的培养基，配方简单，培养基成本低，配合各阶段的培养条件，得到的幼苗培养时间短，培养流程简便，提高了草莓繁殖的效率，繁殖系数为30，能快速获得遗传性状一致的草莓无菌苗，利用组织培养技术，进行外植体培养，可不受季节气候变化、自然灾害的影响，可进行大规模的工业化育苗及深加工。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1
本实施例所述的一种草莓的组培快繁方法，包括以下步骤：
(1)外植体选取及灭菌：切取草莓幼嫩叶片或萼片，切取的长度为0.5—0.9cm，清洗干净后，用体积分数2％巴氏消毒液处理4—6分钟，冲洗干净，在超净台上用75％的酒精处理15—25s，无菌水冲洗3—4次，再用0.1％的升汞处理4—6min，无菌水冲洗2—4次，再用体积分数4％的次氯酸钠溶液处理3—5min，无菌水冲洗2—5次，晾干即可；
(2)愈伤组织诱导培养：将步骤(1)所得外植体接种到愈伤组织诱导培养基中培养2—3周，得愈伤组织，所述愈伤组织诱导培养基的组成为：MS基本培养基，补充1.5mg/LTDZ、1.0mg/L NAA，其中所述愈伤组织诱导培养中，先进行暗培养5—8天，再进行光照下培养；
(3)分化及增殖培养：取步骤(2)所得愈伤组织，接种到分化培养基中培养5—6周，得分化幼芽；将所述分化幼芽接种到增殖培养基上培养8—9周，得增殖幼苗，所述分化培养基与所述增殖培养基的组成均为：MS基本培养基，补充2.0mg/L TDZ、0.05mg/L NAA；
(4)生根培养：将步骤(3)所得增殖幼苗分离成单株，接种到生根培养基中培养2—4周即得草莓无菌苗，所述生根培养基的组成为：1/2MS基本培养基，补充0.3mg/L IAA。
本实施例中，愈伤组织诱导培养中，愈伤组织生成的时间为15天；分化及增殖培养中，开始分化幼芽的时间为30天，幼芽开始增殖的时间为5天，增殖系数为30；生根培养中，开始生根的时间为10天。
实施例2
本实施例所述的一种草莓的组培快繁方法，与实施例1的区别在于：
步骤(2)中，愈伤组织诱导培养基的组成为：MS基本培养基，补充0.5mg/L TDZ、0.25mg/L NAA；
步骤(3)中，分化培养基与所述增殖培养基的组成均为：MS基本培养基，补充0.5mg/L TDZ、0.05mg/L NAA；
步骤(4)中，生根培养基的组成为：1/2MS基本培养基，补充0.5mg/L IAA。
本实施例中，愈伤组织诱导培养中，愈伤组织生成的时间为18天；分化及增殖培养中，开始分化幼芽的时间为40天，幼芽开始增殖的时间为5天，增殖系数为15；生根培养中，开始生根的时间为10天。
实施例3
本实施例所述的一种草莓的组培快繁方法，与实施例1的区别在于：
步骤(2)中，愈伤组织诱导培养基的组成为：MS基本培养基，补充3.0mg/L TDZ、1.5mg/L NAA；
步骤(3)中，分化培养基与所述增殖培养基的组成均为：MS基本培养基，补充3.5mg/L TDZ、0.25mg/L NAA；
步骤(4)中，生根培养基的组成为：1/2MS基本培养基，补充0.1mg/L IAA。
本实施例中，愈伤组织诱导培养中，愈伤组织生成的时间为15天；分化及增殖培养中，开始分化幼芽的时间为30天，幼芽开始增殖的时间为5天，增殖系数为13；生根培养中，开始生根的时间为10天。
实施例4
本实施例所述的一种草莓的组培快繁方法，与实施例1的区别在于：
步骤(2)中，愈伤组织诱导培养基的组成为：MS基本培养基，补充0.5mg/L TDZ、0.25mg/L NAA；
步骤(3)中，分化培养基与所述增殖培养基的组成均为：MS基本培养基，补充3.5mg/L TDZ、0.25mg/L NAA；
步骤(4)中，生根培养基的组成为：1/2MS基本培养基，补充0.1mg/L IAA。
本实施例中，愈伤组织诱导培养中，愈伤组织生成的时间为18天；分化及增殖培养中，开始分化幼芽的时间为35天，幼芽开始增殖的时间为5天，增殖系数为16；生根培养中，开始生根的时间为10天。
实施例5
本实施例所述的一种草莓的组培快繁方法，与实施例1的区别在于：
步骤(2)中，愈伤组织诱导培养基的组成为：MS基本培养基，补充3.0mg/L TDZ、1.5mg/L NAA；
步骤(3)中，分化培养基与所述增殖培养基的组成均为：MS基本培养基，补充0.5mg/L TDZ、0.05mg/L NAA；
步骤(4)中，生根培养基的组成为：1/2MS基本培养基，补充0.5mg/L IAA。
本实施例中，愈伤组织诱导培养中，愈伤组织生成的时间为15天；分化及增殖培养中，开始分化幼芽的时间为40天，幼芽开始增殖的时间为5天，增殖系数为11；生根培养中，开始生根的时间为10天。
实施例6
本实施例所述的一种草莓的组培快繁方法，与实施例1的区别在于：
步骤(2)中，愈伤组织诱导培养基的组成为：MS基本培养基，补充1.0mg/L TDZ、0.5mg/L NAA；
步骤(3)中，分化培养基与所述增殖培养基的组成均为：MS基本培养基，补充1.0mg/L TDZ、0.05mg/L NAA；
步骤(4)中，生根培养基的组成为：1/2MS基本培养基，补充0.4mg/L IAA。
本实施例中，愈伤组织诱导培养中，愈伤组织生成的时间为18天；分化及增殖培养中，开始分化幼芽的时间为35天，幼芽开始增殖的时间为5天，增殖系数为22；生根培养中，开始生根的时间为10天。
实施例7
本实施例所述的一种草莓的组培快繁方法，与实施例1的区别在于：
步骤(2)中，愈伤组织诱导培养基的组成为：MS基本培养基，补充2.0mg/L TDZ、1.0mg/L NAA；
步骤(3)中，分化培养基与所述增殖培养基的组成均为：MS基本培养基，补充3.0mg/L TDZ、0.10mg/L NAA；
步骤(4)中，生根培养基的组成为：1/2MS基本培养基，补充0.2mg/L IAA。
本实施例中，愈伤组织诱导培养中，愈伤组织生成的时间为15天；分化及增殖培养中，开始分化幼芽的时间为32天，幼芽开始增殖的时间为5天，增殖系数为23；生根培养中，开始生根的时间为10天。
实施例8
本实施例所述的一种草莓的组培快繁方法，与实施例1的区别在于：
步骤(2)中，愈伤组织诱导培养基的组成为：MS基本培养基，补充1.0mg/L TDZ、0.5mg/L NAA；
步骤(3)中，分化培养基与所述增殖培养基的组成均为：MS基本培养基，补充3.0mg/L TDZ、0.10mg/L NAA；
步骤(4)中，生根培养基的组成为：1/2MS基本培养基，补充0.2mg/L IAA。
本实施例中，愈伤组织诱导培养中，愈伤组织生成的时间为18天；分化及增殖培养中，开始分化幼芽的时间为35天，幼芽开始增殖的时间为5天，增殖系数为25；生根培养中，开始生根的时间为10天。
实施例9
本实施例所述的一种草莓的组培快繁方法，与实施例1的区别在于：
步骤(2)中，愈伤组织诱导培养基的组成为：MS基本培养基，补充2.0mg/L TDZ、1.0mg/L NAA；
步骤(3)中，分化培养基与所述增殖培养基的组成均为：MS基本培养基，补充1.0mg/L TDZ、0.05mg/L NAA；
步骤(4)中，生根培养基的组成为：1/2MS基本培养基，补充0.4mg/L IAA。
本实施例中，愈伤组织诱导培养中，愈伤组织生成的时间为15天；分化及增殖培养中，开始分化幼芽的时间为35天，幼芽开始增殖的时间为5天，增殖系数为22；生根培养中，开始生根的时间为10天。
实施例10
愈伤组织诱导培养基中生长激素成分和浓度对腋芽生长的影响
取生长情况一致的外植体若干，经过灭菌晾干后接种到愈伤组织诱导培养基上培养2—3周，培养过程中，先进行暗培养5—8天，再进行光照下培养。其中愈伤组织诱导培养基采用MS基本培养基，补充生长激素。在基本培养基相同的条件下，根据生长激素的成分和浓度进行分组，观察并记录培养基中外植体的培养情况，具体分组及培养结果见表1。
表1愈伤组织诱导培养基中生长激素成分和浓度对诱导的影响结果
从上表可以看出，TDZ和NAA同时使用比二者任一单用时的愈伤组织诱导率要高。通过愈伤组织形态观察，TDZ与NAA同时使用愈伤形态较好，有利于分化，在只有TDZ的培养基上愈伤组织玻璃化状态，在仅含NAA培养基上愈伤组织生长较快，但是愈伤水浸状，难分化。且从7—9组可以看出，两者同时使用时，TDZ为1.5mg/L，NAA为1.00mg/L时，愈伤组织诱导率较高，且状态较好，为愈伤组织诱导培养基的最适合的生长激素组成条件。
实施例11
分化培养基与增殖培养基中生长激素成分和浓度对分化增殖的影响
取生长情况一致的经过愈伤组织诱导培养的愈伤组织若干，接种到分化培养基中培养5—6周，得分化幼芽；将所述分化幼芽接种到增殖培养基上培养8—9周，得增殖幼苗。其中分化培养基与增殖培养基均采用MS基本培养基，补充生长激素。在MS基本培养基相同的条件下根据生长激素的成分和浓度进行分组，观察并记录培养基中愈伤组织的培养情况，具体分组及培养结果见表2。
表2分化培养基与增殖培养基中生长激素成分和浓度对分化增殖的影响结果
从上表可以看出，TDZ和NAA同时使用比二者任一单用时的分化率和增殖率要高得多，且从10—12组可以看出，二者同时使用时，TDZ为2.0mg/L，NAA为0.05mg/L时，其分化率和增殖系数最高，为分化培养基和增殖培养基的最适合的生长激素组成条件。
实施例12
生根培养基中生长激素成分和浓度对生根的影响
取生长情况一致的经过分化及增殖培养的幼苗单株若干，接种到生根培养基上培养2—4周，其中，生根培养基采用1/2MS基本培养基，并补充IAA，在1/2MS基本培养基条件相同的情况下，根据IAA的浓度进行分组，观察并记录培养基中幼苗单株的培养情况，具体分组及培养结果见表3。
表3生根培养基中生长激素成分和浓度对生根的影响结果
从上表可以看出，IAA为0.3mg/L，其生根率达到100％，且长势较好，平均生根数和平均根长均较高，为生根培养基的最适合的生长激素条件。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种草莓的组培快繁方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)外植体选取及灭菌：切取草莓叶片或萼片，清洗并进行灭菌处理后，得外植体；
(2)愈伤组织诱导培养：将步骤(1)所得外植体接种到愈伤组织诱导培养基中培养2—3周，得愈伤组织，所述愈伤组织诱导培养基的组成为：MS基本培养基，补充0.5—3.0mg/LTDZ、0.25—1.5mg/L NAA；
(3)分化及增殖培养：取步骤(2)所得愈伤组织，接种到分化培养基中培养5—6周，得分化幼芽；将所述分化幼芽接种到增殖培养基上培养8—9周，得增殖幼苗，所述分化培养基与所述增殖培养基的组成均为：MS基本培养基，补充0.5—3.5mg/L TDZ、0.05—0.25mg/LNAA；
(4)生根培养：将步骤(3)所得增殖幼苗分离成单株，接种到生根培养基中培养2—4周即得草莓无菌苗，所述生根培养基的组成为：1/2MS基本培养基，补充0.1—0.5mg/L IAA。
2.根据权利要求1所述的一种草莓的组培快繁方法，其特征在于：所述外植体选取及灭菌的具体操作为：切取草莓幼嫩叶片或萼片，清洗干净后，用体积分数2％巴氏消毒液处理4—6分钟，冲洗干净，在超净台上用75％的酒精处理15—25s，无菌水冲洗3—4次，再用0.1％的升汞处理4—6min，无菌水冲洗2—4次，再用体积分数4％的次氯酸钠溶液处理3—5min，无菌水冲洗2—5次，晾干即可。
3.根据权利要求2所述的一种草莓的组培快繁方法，其特征在于：所述叶片或萼片切取的长度为0.5—0.9cm。
4.根据权利要求1所述的一种草莓的组培快繁方法，其特征在于：所述愈伤组织诱导培养基的组成为：MS基本培养基，补充1.0—2.0mg/L TDZ、0.5—1.0mg/L NAA。
5.根据权利要求4所述的一种草莓的组培快繁方法，其特征在于：所述愈伤组织诱导培养基的组成为：MS基本培养基，补充1.5mg/L TDZ、1.0mg/L NAA。
6.根据权利要求1所述的一种草莓的组培快繁方法，其特征在于：所述分化培养基与所述增殖培养基的组成均为：MS基本培养基，补充1.0—3.0mg/L TDZ、0.05—0.10mg/L NAA。
7.根据权利要求6所述的一种草莓的组培快繁方法，其特征在于：所述分化培养基与所述增殖培养基的组成均为：MS基本培养基，补充2.0mg/L TDZ、0.05mg/L NAA。
8.根据权利要求1所述的一种草莓的组培快繁方法，其特征在于：所述生根培养基的组成为：1/2MS基本培养基，补充0.2—0.4mg/L IAA。
9.根据权利要求8所述的一种草莓的组培快繁方法，其特征在于：所述生根培养基的组成为：1/2MS基本培养基，补充0.3mg/L IAA。
10.根据权利要求1所述的一种草莓的组培快繁方法，其特征在于：所述愈伤组织诱导培养中，先进行暗培养5—8天，再进行光照下培养。
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