CN106359085A - 一种尾柳桉生根培养基及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于林业生物技术育种领域或植物细胞工程领域，公开了一种尾柳桉生根培养基及应用。该生根培养基是在改良MS培养基的基础上补加IBA和3‑AB，本发明通过添加新型的生根诱导物质3‑AB，并在生根类生长调节剂IBA的协同作用下，尾柳桉的生根率在87％以上，移栽成活率在91％以上，生根苗上袋后生长整齐且健壮，抗性强，完全达到了规模化和商品化生产种苗的要求。而且该生根培养基重现性好，效果稳定，多次使用后在生根率和移栽成活率上无较大波动，因此，彻底解决了尾柳桉组培诱导时难生根问题。

Description

一种尾柳桉生根培养基及应用

技术领域

本发明属于林业生物技术育种领域或植物细胞工程领域，特别涉及一种尾柳桉生根培养基及应用。

背景技术

柳桉(Eucalyptus saligna)是桉属(Eucalyptus L’Herit.)一种高大的常绿乔木，原分布区位于澳大利亚昆士兰南部和新南威尔士的部分地区。福建桉树引种实践以及陶德生(1997年)研究表明，引种到中国的柳桉具有较好的早期速生特性、适应性、耐霜冻和耐贫瘠土壤能力，可生长于亚热带林区，作为速生耐寒桉树种开发潜力巨大。另外，柳桉叶子细窄，树冠小，抗台风能力强，这对于在中国东南沿海需要选育抗台风的商品林树种具有显著意义。

本发明所用的尾柳桉(E.urophylla×E.saligna)，是母本为尾叶桉和父本为柳桉的人工杂交种，主要适生于我国的福建、湖南、四川、江西、贵州和云南等亚热带地区，具有生长迅速和耐寒能力强两大优良性状，是一种具开发潜力的人工商品林用栽植良种。

柳桉可以通过研发出专用的增殖培养基配方来获得大量的增殖苗；但是，其生根培养基配方的研发难度非常大，虽经过多年多人的研发，其生根率却仍然很低。即使有个别报道，声称取得了高生根率，但却不稳定，生根效果重现性差。至今，尚无已应用于工厂化生产的柳桉生根培养基配方出现。柳桉难生根问题严重制约了该良种的推广和使用，因此，需要开发它的组培生根技术。

王碧兰等(1982年)在柳桉的组织培养中尝试应用EF植物生长促进剂代替生长素，成功的诱导出愈伤组织，分化出绿色的嫩芽，但很难发根，她推测EF植物生长促进剂可能会抑制根系发生。谭柏韬(2009年)以柳桉带腋芽的幼嫩茎段为外植体进行组培快繁，通过改良生根培养基配方使生根率达85％以上，并发现在气温18～25℃时有利于插穗愈合生根，但是该方法生根效果不稳定，无法应用于大规模生产。

在生根机理研究方面，刘卫东等(1997年)研究发现桉树不定根的产生必须经过诱导产生根原细胞，并指出生根的难易与茎内出现的韧皮纤维含量和排列有关；他还发现，酚类物质和单宁类物质可以抑制桉树生根，且浓度越高，抑制作用越强烈。李明等(2000年)研究了不同生长素处理对难生根无性系尾叶桉MLA插条氧化酶活性的影响，发现氧化酶活性高低可能直接影响不定根的形成。欧阳磊(2006年)研究指出激素种类和浓度、基本培养基种类及其大量元素的含量、蔗糖浓度和继代次数对桉树不同无性系的生根有显著性影响，并且发现光照对生根也有一定的影响。柳桉属于桉属中难生根的树种，但尚未见对其生根机理的专门研究，这也是导致柳桉诱导生根技术研发进展缓慢的重要原因。在本发明专利出现之前，国内种苗市场上未见有柳桉组培苗的规模化上市，也未见有柳桉的组培无性系试验林出现。

3-AB(3-aminobenzamide，3-氨基苯甲酰胺)是PARP(poly ADP-ribosepolymerase，聚ADP核糖聚合酶)的一种有效抑制剂。在本发明中，3-AB作为一种生理活性物质，起到了诱导桉树不定根发生的显著效果，可以推测，3-AB在尾柳桉的不定根诱导过程中，并非传统认知上的细胞抑制剂的作用，而是作为一种植物生长调节剂，行使了基因表达诱导和信号传导的功能。查阅相关资料文献发现，该物质尚无应用在生根培养基配方中的先例。

本发明是在发明人进行切片观察尾柳桉生根过程和内源激素检测的实验基础上，通过引入新型的生根诱导物质，获得了较好的生根效果，现在已经利用该生根培养基配方实现了尾柳桉组培苗的规模化生产，在广东西江林业局和韶关龙山林场营造了组培无性系试验林。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种可实现稳定诱导尾柳桉生根的培养基。

本发明另一目的在于提供上述尾柳桉生根培养基在诱导尾柳桉生根中的应用。

本发明的目的通过下述方案实现：

一种尾柳桉生根培养基，其配方如下所示：

①大量元素：硝酸铵530mg/L，硝酸钾500mg/L，七水硫酸镁300mg/L，磷酸二氢钾400mg/L，二水氯化钙66mg/L，四水硝酸钙300mg/L；

②微量元素：碘化钾0.83mg/L，硼酸6.2mg/L，四水硫酸锰22.3mg/L，七水硫酸锌8.6mg/L，二水钼酸钠0.25mg/L，五水硫酸铜0.025mg/L，六水氯化钴0.025mg/L；

③铁盐：七水硫酸亚铁27.8mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L；

④有机成分：盐酸吡哆醇0.25mg/L，盐酸硫胺素0.25mg/L，甘氨酸0.48mg/L，泛酸钙0.8mg/L，烟酸2mg/L，肌醇100mg/L，生物素0.24mg/L，苯甲酸钠10mg/L，半胱氨酸5mg/L；

⑤蔗糖20g/L，卡拉胶7.5g/L；

⑥添加的诱导生根物质：IBA 0.3mg/L，3-AB(PARP抑制剂)0.1mg/L。

上述生根培养基的配方是在原MS培养基配方的基础上做如下改变：1)琼脂替换为卡拉胶，终浓度为7.5g/L；2)添加了四水硝酸钙、泛酸钙、半胱氨酸、生物素、苯甲酸钠、IBA和3-AB，各物质终浓度依次分别为：300mg/L、0.8mg/L、5mg/L、0.24mg/L、10mg/L、0.3mg/L和0.1mg/L；3)在原MS培养基配方的基础上浓度发生改变的物质有：硝酸铵，终浓度改变为530mg/L；硝酸钾，终浓度改变为500mg/L；七水硫酸镁，终浓度改变为300mg/L；磷酸二氢钾，终浓度改变为400mg/L；二水氯化钙，终浓度改变为66mg/L；盐酸吡哆醇，终浓度改变为0.25mg/L；盐酸硫胺素，终浓度改变为0.25mg/L；甘氨酸，终浓度改变为0.48mg/L；烟酸，终浓度改变为2mg/L；蔗糖，终浓度改变为20g/L。

所述的尾柳桉生根培养基的pH值为5.8～6.0。

上述的尾柳桉生根培养基在诱导尾柳桉生根中的应用，具体包括以下步骤：将增殖培养后的尾柳桉组培苗进行诱导生根培养，然后进行组培苗上袋，最后用于移栽大田和造林。

所述的生根培养的条件为：培养温度为22～25℃，每天光照时间为15～16h；黑暗时间为8～9h，光照强度为1500～2000lx，生根培养时间为20～30天。

优选的，所述的生根培养的条件为：培养温度为23℃，每天光照时间为16h；黑暗时间为8h，光照强度为1800lx，生根培养25天。

所述的增殖培养的增殖培养基在原MS培养基配方的基础上做如下改变：1)琼脂替换为卡拉胶，终浓度为7.5g/L；2)添加了泛酸钙、半胱氨酸、生物素、苯甲酸钠、NAA和6-BA，各物质终浓度依次分别为：0.8mg/L、5mg/L、0.24mg/L、10mg/L、0.4mg/L和0.8mg/L；3)在原MS培养基配方的基础上浓度发生改变的物质有：硝酸铵，终浓度改变为1800mg/L；磷酸二氢钾，终浓度改变为270mg/L；盐酸吡哆醇，终浓度改变为0.25mg/L；盐酸硫胺素，终浓度改变为0.25mg/L；甘氨酸，终浓度改变为0.48mg/L；烟酸，终浓度改变为2mg/L。

所述的增殖培养基的配方为：

①大量元素：硝酸铵1800mg/L，硝酸钾1900mg/L，二水氯化钙440mg/L，七水硫酸镁370mg/L，磷酸二氢钾270mg/L；

②微量元素：碘化钾0.83mg/L，硼酸6.2mg/L，四水硫酸锰22.3mg/L，七水硫酸锌8.6mg/L，二水钼酸钠0.25mg/L，五水硫酸铜0.025mg/L，六水氯化钴0.025mg/L；

③铁盐：七水硫酸亚铁27.8mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L；

④有机成分：盐酸吡哆醇0.25mg/L，盐酸硫胺素0.25mg/L，甘氨酸0.48mg/L，泛酸钙0.8mg/L，烟酸2mg/L，肌醇100mg/L，生物素0.24mg/L，苯甲酸钠10mg/L，半胱氨酸5mg/L；

⑤蔗糖30g/L，卡拉胶7.5g/L；

⑥添加的植物生长调节剂：NAA 0.4mg/L，6-BA 0.8mg/L。

所述的增殖培养的增殖培养基的pH值为5.8～6.0。

所述的增殖培养的条件为：培养温度为22～25℃，每天光照时间为15～16h；黑暗时间为8～9h，光照强度为1500～2000lx，每隔30～40天继代培养一次。

优选的，所述的增殖培养的条件为：培养温度为23℃，每天光照时间为16h；黑暗时间为8h，光照强度为1800lx，每隔35天继代培养一次。

本发明的机理为：

本发明在切片观察尾柳桉生根过程和检测内源激素变化规律的基础上，通过引入新型的生根诱导物质，获得了较好的生根诱导效果。本发明的尾柳桉生根培养基是在原MS培养基配方的基础上做如下改变：1)琼脂替换为卡拉胶；2)添加了四水硝酸钙、泛酸钙、半胱氨酸、生物素、苯甲酸钠、IBA和3-AB；3)在原MS培养基配方的基础上改变了硝酸铵、硝酸钾、七水硫酸镁、磷酸二氢钾、二水氯化钙、盐酸吡哆醇、盐酸硫胺素、甘氨酸、烟酸和蔗糖的终浓度。其中，卡拉胶是培养基的凝固剂，用于固体培养；IBA是诱导生根的传统激素，它在促进细胞分化和分裂，不定根形成和维管束系统的分化方面具有确定性的作用；3-AB是传统意义上的细胞抑制剂，其在不定根诱导等新功能上的研究刚刚开始。从本发明来看，在生根诱导物质IBA的配合下，3-AB起到了诱导不定根产生的显著效果，使形成层细胞的生长和发育方向发生了改变，由薄壁细胞状态发育成为不定根的根原基形态，细胞变小和变密，并不断沿平周方向进行分裂，最终突破表皮生长成为侧根。3-AB和IBA这2种物质同时使用的效果显著优于单独使用3-BA或IBA所产生的诱导生根效果。尾柳桉增殖培养基是在原MS培养基配方的基础上做如下改变：1)琼脂替换为卡拉胶；2)添加了泛酸钙、半胱氨酸、生物素、苯甲酸钠、NAA和6-BA；3)在原MS培养基配方的基础上改变了硝酸铵、磷酸二氢钾、盐酸吡哆醇、盐酸硫胺素、甘氨酸和烟酸的终浓度。其中6-BA是常用的细胞分裂素，已知可以促进细胞分裂，促进组织分化，并可促进侧芽发生；NAA是常用的生长素，2种激素联用，可使桉树保持均衡的分裂(增殖)和生长状态。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：

(1)本发明通过添加新型的生根诱导物质3-AB，并在其他生根类生长调节剂的协同作用下，使得尾柳桉的生根率在87％以上，移栽成活率在91％以上，生根苗上袋后生长整齐且健壮，抗性强，完全达到了规模化和商品化生产种苗的要求。

(2)本发明的生根培养基在实践应用时重现性好，效果稳定，多次使用后发现，在生根率和移栽成活率上无较大波动，因此，是彻底解决了尾柳桉组培诱导时难生根问题。采用本发明所用生根培养基，已实现尾柳桉组培生根苗的规模化和工厂化生产。

附图说明

图1为经过增殖培养后的尾柳桉增殖苗。

图2为实施例1诱导生根培养后的尾柳桉生根苗。

图3为实施例1组培生根苗移栽后成活的尾柳桉种苗。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例中所用试剂如无特殊说明均可从市场常规购得。本发明实施例中所用3-AB(PARP抑制剂)购自美国Sigma公司。

在本实施例中，所有实施例中采用的生根培养基均包含改良的MS培养基：①大量元素：硝酸铵530mg/L，硝酸钾500mg/L，七水硫酸镁300mg/L，磷酸二氢钾400mg/L，二水氯化钙66mg/L，四水硝酸钙300mg/L；②微量元素：碘化钾0.83mg/L，硼酸6.2mg/L，四水硫酸锰22.3mg/L，七水硫酸锌8.6mg/L，二水钼酸钠0.25mg/L，五水硫酸铜0.025mg/L，六水氯化钴0.025mg/L；③铁盐：七水硫酸亚铁27.8mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L；④有机成分：盐酸吡哆醇0.25mg/L，盐酸硫胺素0.25mg/L，甘氨酸0.48mg/L，泛酸钙0.8mg/L，烟酸2mg/L，肌醇100mg/L，生物素0.24mg/L，苯甲酸钠10mg/L，半胱氨酸5mg/L；⑤蔗糖20g/L，卡拉胶7.5g/L。

所有实施例中采用的增殖培养的增殖培养基的配方为：①大量元素：硝酸铵1800mg/L，硝酸钾1900mg/L，二水氯化钙440mg/L，七水硫酸镁370mg/L，磷酸二氢钾270mg/L；②微量元素：碘化钾0.83mg/L，硼酸6.2mg/L，四水硫酸锰22.3mg/L，七水硫酸锌8.6mg/L，二水钼酸钠0.25mg/L，五水硫酸铜0.025mg/L，六水氯化钴0.025mg/L；③铁盐：七水硫酸亚铁27.8mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L；④有机成分：盐酸吡哆醇0.25mg/L，盐酸硫胺素0.25mg/L，甘氨酸0.48mg/L，泛酸钙0.8mg/L，烟酸2mg/L，肌醇100mg/L，生物素0.24mg/L，苯甲酸钠10mg/L，半胱氨酸5mg/L；⑤蔗糖30g/L，卡拉胶7.5g/L；⑥添加的植物生长调节剂：NAA 0.4mg/L，6-BA 0.8mg/L。增殖培养基的pH值为5.8，增殖培养的条件为：培养温度为23℃，每天光照时间为16h；黑暗时间为8h，光照强度为1800lx，每隔35天继代培养一次。

所有实施例中所用的尾柳桉已申请植物新品种，新品种名称为尾柳桉TH06002(E.urophylla×E.saligna TH06002)，该植物品种权号为20130086，本发明的申请人属新品种的品种权人，拥有用于本发明所需的植物材料。

对比实施例1：

取在无菌组培瓶内生长高度超过2.5cm的组培增殖苗(如图1所示)，在超净工作台上切去基部的愈伤组织，转接到无菌的已加入生根培养基的组培瓶内。组培瓶为240mL玻璃组培瓶，加入的生根培养基体积为30mL。生根培养基的配方包括：改良MS+IBA 0.3mg/L(终浓度)，且pH为5.8。培养的条件为培养温度为23℃，每天光照时间为16h；黑暗时间为8h，光照强度为1800lx，生根培养25天。

对比实施例2：

取在无菌组培瓶内生长高度超过2.5cm的组培增殖苗，在超净工作台上切去基部的愈伤组织，转接到无菌的已加入生根培养基的组培瓶内。组培瓶为240mL玻璃组培瓶，加入的生根培养基体积为30mL。生根培养基的配方包括：改良MS+3-AB 0.1mg/L(终浓度)，且pH为5.8。培养的条件为：培养温度23℃，每天光照时间为16h；黑暗时间为8h，光照强度为1800lx，生根培养25天。

实施例1：

取在无菌组培瓶内生长高度超过2.5cm的组培增殖苗，在超净工作台上切去基部的愈伤组织，转接到无菌的已加入生根培养基的组培瓶内。组培瓶为240mL玻璃组培瓶，加入的生根培养基体积为30mL。生根培养基的配方包括：改良MS+IBA0.3mg/L(终浓度)+3-AB0.1mg/L(终浓度)，且pH为5.8。培养的条件为：培养温度为23℃，每天光照时间为16h；黑暗时间为8h，光照强度为1800lx，生根培养25天。生根培养后的尾柳桉生根苗如图2所示。

上述对比实施例1和2、以及实施例1中诱导尾柳桉生根的实验结果如表1所示，均取100株，各指标计算公式如下：

生根率(％)＝生根株树/接种总株数×100％

平均根数(条)＝总生根数/生根株数

平均根长(cm)＝所有根总长/总生根数

平均株高(cm)＝所有苗总高/总株数

表1尾柳桉生根诱导结果

从表1可以看出，3-AB作为一种生理活性物质，起到了诱导桉树不定根发生的显著效果，3-AB和IBA这两种物质同时使用的效果显著优于单独使用3-BA或IBA所产生的诱导生根效果。而且本发明所述培养基可使尾柳桉的生根率达到89％以上，将生根后的尾柳桉组培苗上袋移栽后，成活率可达91％以上，移栽后成活的尾柳桉种苗如图3所示。

取1000株上袋生根苗进行病害调查，病害发生率为1％，说明种苗抗性强，不易生病；移袋45天后取1000株小苗测定株高，平均株高为7.5cm，最大值为8.0cm，最小值为6.8cm，最大值-最小值＝1.2cm，最大和最小值离平均值偏移值分别为0.5cm和0.7cm；取5000株上袋生根苗，分五次用本发明的生根培养基进行培养并测试生根的生根率，每次取1000株，5次结果分别为92.1％，89.7％，88.5％，87.6％，85.2％。最大和最小生根率差距在6.9％，最终生根率平均值为88.6％，最大和最小生根率与平均值偏移程度分别为3.5％和3.4％。说明本发明的生根培养基在实践应用时，重现性好，效果稳定，多次使用后发现，在生根率和移栽成活率上无较大波动，且生根苗上袋后生长整齐且健壮，抗性强，完全达到了规模化和商品化生产种苗的要求。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种尾柳桉生根培养基，其特征在于配方如下：

①大量元素：硝酸铵530mg/L，硝酸钾500mg/L，七水硫酸镁300mg/L，磷酸二氢钾400mg/L，二水氯化钙66mg/L，四水硝酸钙300mg/L；

②微量元素：碘化钾0.83mg/L，硼酸6.2mg/L，四水硫酸锰22.3mg/L，七水硫酸锌8.6mg/L，二水钼酸钠0.25mg/L，五水硫酸铜0.025mg/L，六水氯化钴0.025mg/L；

③铁盐：七水硫酸亚铁27.8mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L；

④有机成分：盐酸吡哆醇0.25mg/L，盐酸硫胺素0.25mg/L，甘氨酸0.48mg/L，泛酸钙0.8mg/L，烟酸2mg/L，肌醇100mg/L，生物素0.24mg/L，苯甲酸钠10mg/L，半胱氨酸5mg/L；

⑤蔗糖20g/L，卡拉胶7.5g/L；

⑥添加的诱导生根物质：IBA 0.3mg/L，3-AB 0.1mg/L。

2.根据权利要求1所述的尾柳桉生根培养基，其特征在于：

所述的尾柳桉生根培养基的pH值为5.8～6.0。

3.根据权利要求1或2所述的尾柳桉生根培养基在诱导尾柳桉生根中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于具体包括以下步骤：

将增殖培养后的尾柳桉组培苗进行诱导生根培养，然后进行组培苗上袋，最后用于移栽大田和造林。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：

所述的生根培养的条件为：培养温度为22～25℃，每天光照时间为15～16h；黑暗时间为8～9h，光照强度为1500～2000lx，生根培养时间为20～30天。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：

所述的生根培养的条件为：培养温度为23℃，每天光照时间为16h；黑暗时间为8h，光照强度为1800lx，生根培养25天。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：

所述的增殖培养的增殖培养基的配方为：

①大量元素：硝酸铵1800mg/L，硝酸钾1900mg/L，二水氯化钙440mg/L，七水硫酸镁370mg/L，磷酸二氢钾270mg/L；

②微量元素：碘化钾0.83mg/L，硼酸6.2mg/L，四水硫酸锰22.3mg/L，七水硫酸锌8.6mg/L，二水钼酸钠0.25mg/L，五水硫酸铜0.025mg/L，六水氯化钴0.025mg/L；

③铁盐：七水硫酸亚铁27.8mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L；

④有机成分：盐酸吡哆醇0.25mg/L，盐酸硫胺素0.25mg/L，甘氨酸0.48mg/L，泛酸钙0.8mg/L，烟酸2mg/L，肌醇100mg/L，生物素0.24mg/L，苯甲酸钠10mg/L，半胱氨酸5mg/L；

⑤蔗糖30g/L，卡拉胶7.5g/L；

⑥添加的植物生长调节剂：NAA 0.4mg/L，6-BA 0.8mg/L。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：

所述的增殖培养的增殖培养基的pH值为5.8～6.0。

9.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：

所述的增殖培养的条件为：培养温度为22～25℃，每天光照时间为15～16h；黑暗时间为8～9h，光照强度为1500～2000lx，每隔30～40天继代培养一次。