CN103238518B - 茉莉花愈伤组织诱导及继代保持的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种茉莉花愈伤组织诱导及继代保持的方法，包括茉莉花外植体处理的步骤、诱导培养的步骤、继代增殖培养与保持的步骤。本发明不仅能够快速获得大量茉莉花愈伤组织，且所获得的茉莉花愈伤组织具有高诱导效率及高质量的优点，同时可长期继代保持茉莉花愈伤组织，即具有旺盛的生长能力，从而为茉莉花生物技术和细胞培养生产次生代谢产物等研究奠定了良好的基础。

Description

茉莉花愈伤组织诱导及继代保持的方法

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，尤其涉及一种茉莉花愈伤组织诱导及继代保持的方法。

背景技术

茉莉花为木犀科素馨属(或茉莉属)亚热带常绿灌木。茉莉花树冠直立或半开展状，花冠白色，极芳香，花期较长；《本草纲目》中记载其花、叶、根均可入药，根能理气、活血、安神镇痛，花能开郁、辟秽，叶能消肿解毒，近代研究也表明，茉莉花根提取物具有抗心律失常、镇静催眠、抑制中枢神经系统、降低耗氧率等作用。其在盆栽观赏、园林绿化、花茶窖制、香料生产等方面得到了广泛应用。因此，在我国茉莉花已渗透到人们的社会生活中，是我国既具观赏价值又具经济价值的重要园林花卉，也是中国的文化符号之一。然而，随着近年来茉莉花茶市场下滑，加上花色单一，致使茉莉花栽培面积大大缩水，为了茉莉花产业的可持续发展，必须大力发展茉莉花新品种选育，但传统的育种方法对于茉莉花有很大局限性。另一方面，对于茉莉花的研究还主要集中在栽培加工技术和理化性质分析等前期研究方面，有关茉莉花生物技术研究还鲜见报道，虽然近年来茉莉花的组织培养有所报道，但相关的文献和研究还较少。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种茉莉花愈伤组织诱导及继代保持的方法。

本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：一种茉莉花愈伤组织诱导及继代保持的方法，包括以下步骤：

(1)外植体处理：从生长健壮的母株上剪取当年生枝条或花器官，去除叶片后洗净、消毒，在无菌条件下切取长0.5cm的茎段或花瓣作为接种的外植体；

(2)诱导培养：将外植体接种于诱导培养基中，并于温度23～25℃，光照强度1500～2000lx，每天光照12h的培养条件下培养30天，得初代愈伤组织；

所述诱导培养基包括下述成分：MS培养基、6-苄氨基腺嘌呤2.0mg/L、α-萘乙酸0.2mg/L、蔗糖30g/L和琼脂粉6g/L；其中，各成分的浓度均以诱导培养基总溶液的体积为基准；

(3)继代保持：将初代愈伤组织转接于继代培养基中，并于温度23～25℃，光照强度1500～2000lx，每天光照12h的条件下进行继代增殖培养，直至获得生长一致且生长旺盛的愈伤组织，同时用所述继代培养基长期保持愈伤组织；

所述继代培养基包括下述成分：MS培养基、6-苄氨基腺嘌呤2.0mg/L、α-萘乙酸0.2mg/L、蔗糖30g/L和琼脂粉6g/L；其中，各成分的浓度均以继代培养基总溶液的体积为基准。

本发明的有益效果在于：不仅能够快速获得大量茉莉花愈伤组织，且所获得的茉莉花愈伤组织具有高诱导效率及高质量的优点，同时可长期继代保持茉莉花愈伤组织，即具有旺盛的生长能力，从而为茉莉花生物技术和细胞培养生产次生代谢产物等研究奠定了良好的基础。

具体实施方式

一种茉莉花愈伤组织诱导及继代保持的方法，

A.实验材料的选取与预处理

从生长健壮的茉莉花母株上剪取当年生枝条或花器官，去除叶片后放入加有洗涤剂的水中浸洗3～5min，再用自来水冲洗1～2h；然后移入超净工作台，将枝条置于适量的75％乙醇(v/v)中浸泡30s，再用0.1％HgCl₂(w/v)消毒6～8min(花器官为6min)，接着用无菌水冲洗3～4次。在无菌条件下切取长0.5cm左右的茎段或花瓣作为接种的外植体。

B.启动培养：取所获得的茉莉花外植体，接种至诱导培养基中，并置于培养室中培养，7天后可见愈伤组织形成，30天左右长成初代愈伤组织；其中，培养条件为温度23～25℃，光照强度1500～2000lx，每天光照12h；

所述诱导培养基包括下述成分：MS培养基、6-苄氨基腺嘌呤2.0mg/L、α-萘乙酸0.2mg/L、蔗糖30g/L和琼脂粉6g/L；其中，各成分的浓度均以诱导培养基总溶液的体积为基准。

所述MS培养基具体包括以下各成分：硝酸铵(NH₄NO₃)1650mg/L、硝酸钾(KNO₃)1900mg/L、氯化钙(CaCl₂·2H₂O)440mg/L、硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)370mg/L、磷酸二氢钾(KH₂PO₄)170mg/L、硫酸锰(MnSO₄·H₂O)22.3mg/L、硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O)8.6mg/L、氯化钴(CoCl₂·6H₂O)0.025mg/L、硫酸铜(CuSO₄·5H₂O)0.02mg/L、硼酸(H₃BO₃)6.2、钼酸钠(Na₂MoO₄·2H₂O)0.25mg/L、碘化钾(KI)0.83mg/L、硫酸亚铁(FeSO₄·7H₂O)28.7mg/L、乙二胺四乙酸二钠(Na₂-EDTA)37.3mg/L、烟酸0.5mg/L、维生素B₆0.5mg/L、维生素B₁0.1mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸2mg/L。

C.继代增殖与保持：将初代愈伤组织转接于继代培养基中，并置于培养室中进行培养，以获得生长一致且生长旺盛的愈伤组织；同时用所述继代培养基长期继代保持愈伤组织；其中，培养条件为温度23～25℃，光照强度1500～2000lx，每天光照12h。所述继代培养基包括下述成分：MS培养基、6-苄氨基腺嘌呤2.0mg/L、α-萘乙酸0.2mg/L、蔗糖30g/L和琼脂粉6g/L；其中，各成分的浓度均以继代培养基总溶液的体积为基准。

一、茉莉花愈伤组织诱导过程的影响因素

1、不同类型外植体对愈伤组织诱导的影响

将茉莉花茎段或花瓣接种于下文所述J2培养基中后，置于光照下培养。接种7d后，茎段或花瓣切口处均可观察到愈伤组织形成，以后愈伤组织块会不断膨大，30d左右后长成初代愈伤组织。从产生愈伤组织的能力上看，茎段或花瓣的差别不大，但从愈伤组织的长势上，初代培养时，茎段产生的愈伤组织长势较强；而花瓣产生的愈伤组织，长势比较弱，且要及时继代，否则会褐变死亡。

2、培养条件对愈伤组织诱导的影响

将茉莉花茎段接种于6种培养基中诱导愈伤组织，实验结果发现共形成6种类型的愈伤组织：JC1、JC2、JC3、JC4、JC5、JC6。JC1是淡绿色或鲜绿色的粒状松散状愈伤组织；JC2是深绿色粒状硬质愈伤组织，从后期的继代保持中，发现该类型愈伤组织JC2生活力最强，增殖速度快；JC3是鲜绿色或深绿色粒状松散状愈伤组织；JC4是深绿色块状硬质愈伤组织；JC5是浅黄绿色粒状松软状愈伤组织，有玻璃化的趋势，这种愈伤组织继代后会褐变死亡；JC6是JC1的一种衍生型愈伤组织，颜色较淡。在比较光照和黑暗对茉莉花愈伤组织诱导的影响时发现，在光照条件下愈伤组织主要为上述六种，而在黑暗中诱导培养产生的愈伤组织，均为浅黄色或白色松散粒状，定为JC7型愈伤组织。由此可见，在光照的条件下，茉莉花愈伤组织类型较多，而在黑暗中仅产生JC7型愈伤组织。在光照条件下，JC1、JC2、JC3、JC4、JC6类型的愈伤组织可以继代增殖，为有效愈伤组织；而JC5类型愈伤组织不能继代保持，为无效愈伤组织。黑暗下，JC7愈伤组织也可以继代增殖。

3、不同培养基对愈伤组织诱导的影响

将茉莉花茎段接种于表1所列的6种培养基中，观察其在光照条件下愈伤组织诱导的情况，实验结果见表2。从表2可以看出，6种培养基接种的茎段都能成功诱导出愈伤组织，其中J1、J2、J3和J5诱导率均为100％，J4和J6分别为77.78％和15.56％，经邓肯氏新复极差测验表明，在愈伤组织诱导率上，前四种培养基(即J1、J2、J3、J5)与后两种培养基(即J4、J6)存在极显著差异(P＜0.01)。另外，6种培养基中产生愈伤组织类型的差异很大，J1、J2和J5培养基中能分别形成上述JC1、JC2和JC5三种类型愈伤组织；J3和J4培养基均能诱导出上述JC2型，但均还产生了JC3和JC4型愈伤组织；J6培养基则能诱导出上述JC1和JC6愈伤组织。

从表2中可以看到，J1、J2和J3培养基产生的有效愈伤组织诱导率最高，均为100％，经邓肯氏新复极差测验表明，在有效愈伤组织诱导率上这三种培养基之间并没有存在显著性的差异，但这三种与J4、J5和J6培养基存在极显著差异(P＜0.01)。从产生JC2类型愈伤组织的比例看(见表2)，以J2培养基中诱导出的JC2类型愈伤组织占有率最高达100％，J2培养基与J3、J4培养基存在极显著差异。可见，在茉莉花愈伤组织诱导时，附加2,4-D、KT、GA3的培养基虽然可以成功诱导出愈伤组织，但并没有J2培养基的效果理想。综合表1和表2还可看出，不同浓度配比的BA、NAA都可以用来诱导茉莉花愈伤组织，但采用较高或较低浓度的NAA不利于JC2类型愈伤组织的诱导。综合有效愈伤组织诱导率和JC2类型愈伤组织诱导率两个因素，以附加2.0mg·L^-1BA和0.2mg·L^-1NAA的MS培养基(即J2培养基)用于诱导茉莉花愈伤组织为佳。其中，表1中的J1、J2、J3、J4、J5、J6培养基均指在MS培养基中附加了各成分及其含量的培养基。2,4-D为：2,4-二氯苯氧基乙酸；BA为：6-苄氨基腺嘌呤；NAA为：α-萘乙酸；KT为：6-糠氨基嘌呤；TDZ为：苯基噻二唑基脲；GA₃为：赤霉素。

表1各培养基中的附加成份及其含量(单位：mg/L)

表2不同培养基对愈伤组织诱导的影响

注：有效愈伤组织是指JC1、JC2、JC3、JC4和JC6类型愈伤组织的总和；表中不同字母表示邓肯氏新复极差测验差异显著性，其中大写字母为差异极显著(P<0.01)，小写字母为差异显著(P<0.05)。

二、茉莉花愈伤组织的继代保持

1、不同培养基对愈伤组织继代培养的影响

采用表1所列的培养基，选取生长状态良好的上述JC2型愈伤组织，于光照下进行继代培养试验，实验结果如表3所示。从表3可以看出，将刚诱导出来的JC2型愈伤组织接种于继代培养基中，并不是都会发生褐变，从褐变率来看，6种培养基可大体分为2组：J1、J2、J3为第一组，J4、J5、J6为第二组；邓肯氏新复极差测验表明，第二组的培养基的褐变率明显高于第一组，第一组中J1、J2、J3之间基本无差别；第二组中J4、J6、J5三者之间为显著差异，发J5的褐变率最高达40％。

表3不同培养基对茉莉花愈伤组织继代保持的影响

从表3中还可看到，除添加TDZ的J5培养基外，J1、J2、J3、J4和J6培养基培养的有效愈伤组织率均达到100％。从产生的JC2型愈伤组织来看，J1、J2、J3三种培养基(即分别添加了NAA、NAA和BA组合、2,4-D)中培养的愈伤组织，为JC2类型的愈伤组织较高，占有率分别达到81.10％、100％和72.23％；添加有KT的J4培养基中所形成的JC2类型愈伤组织为57.33％，而添加有TDZ的J5，及添加了GA3的J6培养基不能产生JC2型愈伤组织。邓肯氏新复极差分析表明，J2和J1、J3之间存在极显著差异，J1和J3之间存在显著差异；而J4和J5、J6之间存在极显著差异。

在进行茉莉花愈伤组织继代保持时，综合有效愈伤组织和快速获得JC2型愈伤组织的两方面因素，以附加2.0mg/L BA和0.2mg/L NAA的MS培养基为最佳。

2、培养条件对愈伤组织继代培养的影响

选取茉莉花JC2型愈伤组织，接种于J2培养基中，并于光照或黑暗条件下培养。实验结果发现在黑暗条件下培养的愈伤组织，虽然很少发生褐变，但会产生白色或苍白色松散粒状JC7类型愈伤组织，并且这种情况会随继代次数的增加而增加。在有光照的条件下，会抑制JC7类型愈伤组织的产生，而均形成JC2类型愈伤组织。

3、不同类型愈伤组织对其继代保持的影响

分别挑选生长状态良好的JC1、JC2、JC3、JC4、JC5和JC6等6种类型的愈伤组织接种于J2培养基中，于光照条件下进行继代培养试验。JC1、JC2、JC3类型的愈伤组织继代培养后一般不会发生褐变，一般培养约30d后愈伤组织团会增大到原来的6～7倍，且大部分可以增殖出JC2型愈伤组织；JC1刚开始时以JC1类型的居多，随继代次数的增加，也会趋向于产生JC2类型愈伤组织，最终也可获得一致的JC2类型愈伤组织并可长期继代保持。JC4、JC5和JC6则会发生褐变；JC4进行继代培养1代后会出现类型分化产生JC2和JC4型愈伤组织，且JC2型愈伤组织居多，随继代次数增加，会趋向于形成JC2型愈伤组织；JC6型愈伤组织继代培养后也会出现类型分化的情况，且褐变率高、无JC2类型愈伤组织形成；JC5类型愈伤组织继代后发生褐变，不能增殖，最终死亡。

4、不同外植体来源的愈伤组织对继代培养的影响

选取茎段或花器官组织来源的JC2型愈伤组织，分别接种于J2培养基中，于光照条件下进行继代培养。试验结果表明，不论是茎段还是花器官组织诱导产生的愈伤组织，在继代培养时，不会有太大的差异，经过几代培养和筛选，都能获得生长良好且能长期继代保持的JC2类型愈伤组织，这些愈伤组织都呈现出质地较硬、鲜绿或深绿色。

5、愈伤组织的长期继代保持

在筛选出茉莉花JC2型愈伤组织后，在附加2.0mg/L BA和0.2mg/L NAA的MS培养基中，于光照条件下，可长期继代保持。

本发明中培养室中的条件均为：温度23～25℃，光照强度1500～2000lx，每天光照12h。

Claims (1)

1.一种茉莉花愈伤组织诱导及继代保持的方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)外植体处理：从生长健壮的母株上剪取当年生枝条或花器官，去除叶片后洗净、消毒，在无菌条件下切取长0.5cm的茎段或花瓣作为接种的外植体；

(2)诱导培养：将外植体接种于诱导培养基中，并于温度23～25℃，光照强度1500～2000lx，每天光照12h的培养条件下培养30天，得初代愈伤组织；

所述诱导培养基包括下述成分：MS培养基、6-苄氨基腺嘌呤2.0mg/L、α-萘乙酸0.2mg/L、蔗糖30g/L和琼脂粉6g/L；其中，各成分的浓度均以诱导培养基总溶液的体积为基准；

(3)继代保持：将初代愈伤组织转接于继代培养基中，并于温度23～25℃，光照强度1500～2000lx，每天光照12h的条件下进行继代增殖培养，直至获得生长一致且生长旺盛的愈伤组织，同时用所述继代培养基长期保持愈伤组织；

所述继代培养基包括下述成分：MS培养基、6-苄氨基腺嘌呤2.0mg/L、α-萘乙酸0.2mg/L、蔗糖30g/L和琼脂粉6g/L；其中，各成分的浓度均以继代培养基总溶液的体积为基准。