CN103651145B

CN103651145B - 一种沉水樟组织培养方法

Info

Publication number: CN103651145B
Application number: CN201310728451.2A
Authority: CN
Inventors: 罗坤水; 罗忠生; 胡庆; 林洪
Original assignee: Jiangxi Academy of Forestry
Current assignee: Jiangxi Academy of Forestry
Priority date: 2013-12-26
Filing date: 2013-12-26
Publication date: 2016-07-06
Anticipated expiration: 2033-12-26
Also published as: CN103651145A

Abstract

本发明公开了一种沉水樟组织培养方法，属木本植物无性繁殖技术领域，本发明以沉水樟当年新抽半木质化，带有腋芽的茎段为材料，经初步处理后，接种到含6-BA0.2～3.0mg/L，NAA0.01～0.5mg/L的诱导培养基中，获得无菌外植体；培养40～50d后，形成愈伤组织和不定芽；在继代增殖扩繁培养阶段，提出了增殖培养基的合理PH值、不同无机盐浓度、细胞分裂素6-BA的合适浓度，尤其是硫代硫酸钠对增殖不定芽生长的影响，使继代增殖系数MR值达到2.5的同时，不定芽长势充满活力。在诱导生根培养上，筛选出合适的生长素配比，使有效生根率达到96％，组培苗移栽成活率达到90％以上。

Description

一种沉水樟组织培养方法

技术领域

本发明涉及一种木本植物无性繁殖技术领域，尤其涉及一种木本植物无性繁殖方法。

背景技术

沉水樟(Cinnamomummicranthum)为樟科，樟属常绿阔叶大乔木，树形高大，树高可达40m、胸径1.5m，干形通直，枝繁叶茂，天然分布于我国中亚热带的中南部至南亚热带的大部分地区，包括我国的浙江、江西、湖南的中南部，台湾北部，福建、广东、广西等7省，在越南北部也有少量分布，地理位置约在北纬22°20′至27°30′，东径106°至120°之间，垂直分布一般在海拔100～800m之间。沉水樟除提供木材外，根、干、叶可提取黄油素，是合成洋茉莉醛的重要原料，可作医药及芳香油原料，经济价值高。沉水樟的繁育通常有种子繁殖和扦插繁殖，由于沉水樟属自花授粉，雌雄花发育成熟期不一致，结果量少，果实又常受瘦蜂寄生，种子空壳率高，发芽率低；而扦插繁殖又受穗条来源少，生根率不高的影响。因此，若能采用组织培养的方法进行沉水樟繁殖，将可以较好地解决沉水樟种子发芽率低，扦插繁育困难，移栽成活率低等难题。

发明内容

本发明的目的就在于提供一种解决上述问题，使沉水樟组培苗移栽成活率达到90％以上的无性繁殖方法。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种沉水樟组织培养方法，方法步骤如下：

a.取沉水樟当年新抽半木质化枝条，剪取带有2-3个腋芽的茎段，去除叶片后，置于无菌水中振荡洗涤3～5min，取出后再用70％的酒精处理1～2min，然后置于0.1％HgCl₂7～15min，最后用无菌水清洗3次。

b.将处理好的材料接种到诱导培养基：MS+6-BA0.2～3.0mg/L+NAA0.01～0.5mg/L，获得无菌外植体，在培养温度26～28℃、光强1500～2000lx、光照12h/d条件下，经40～50d后，获得无菌的愈伤组织和不定芽。

c.放入继代增殖培养基：1/2MS(MS基本培养基成分减半)+6-BA0.3～3.0mg/L+NAA0.03～0.5mg/L+Na₂S₂O₃50～300mg/L，pH=5.5。

d.放入诱导生根培养基：1/2MS+IBA0.3～1.5mg/L+NAA0.01～0.3mg/L，pH=5.5。

e.将经以上培养的生根苗移栽；

作为优选，步骤b中诱导培养基：MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L；

作为优选，步骤c中继代增殖培养基为1/2MS+6-BA0.8mg/L+NAA0.05mg/L+Na₂S₂O₃150mg/L，PH=5.5；

作为优选，步骤d中，诱导生根培养基为1/2MS+IBA1.0mg/L+NAA0.05mg/L；

作为优选，步骤e中，将已生根的组培苗拿去炼苗，炼苗20～30d至茎干成深绿色，再洗去培养基，移栽到椰糠和泥炭土混合的基质中，其中椰糠占1/3、泥炭土占2/3，在温度26～30℃，湿度80～100％的条件下培育25d；

作为优选，所述步骤b、c、d中，MS基本培养基内含蔗糖3％，卡拉胶0.8％。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案与现有技术相比，优点在于：本发明沉水樟组织培养不定芽诱导培养基采用MS+6-BA0.2～3.0mg/L+NAA0.01～0.5mg/L，pH=6.0；继代增殖扩繁培养基采用1/2MS+6-BA0.3～3.0mg/L+NAA0.03～0.5mg/L+Na₂S₂O₃50～300mg/L，pH=5.5；诱导生根培养基采用1/2MS+IBA0.3～1.5mg/L+NAA0.01～0.3mg/L，pH=5.5。将经以上培养的沉水樟生根苗移栽，成活率90％以上。

具体实施方式

下面将对本发明作进一步说明。本试验材料取自于吉安林科所内林龄30年、树高19m、胸径60cm的沉水樟当年生新抽半木质化枝条。

一、试验方法

(一)培养条件

基本培养基均含蔗糖3％，卡拉胶0.8％，pH5.5，置于温度26～28℃、光强1500～2000lx、光照12h/d下培养。

(二)增殖培养

以下研究试验中，除试验4每个处理200个重复外，其它试验每个处理100个重复，每个重复1个增殖单位(1个2～3个节的茎段)，每个增殖周期35d。

1、培养基pH值

两种处理的培养基，均使用1/2MS+6-BA0.8mg/L+NAA0.05mg/L培养基。但配制培养基时，分别将pH值调配到6.5，5.5，5.2，5.0，以pH=6.0为对照。培养一个增殖周期后调查统计新抽不定芽数量及长势情况。

2、培养基中6-BA

将每个增殖单位置1/2MS+NAA0.05mg/L，并配合6-BA浓度分别为0，0.5，0.8，1.0，2.0，3.0mg/L中，以6-BA0mg/L为对照，培养一个增殖周期后调查统计新抽侧芽数量。

3、培养基中基本盐类

主要采用MS、1/2MS、1/4MS和改良MS(3/5的硝酸胺和硝酸钾，2倍的碘化钾、氯化钴和氯化钙，6/5的硫酸镁、硫酸锰、硫酸锌和硫酸铜，其它成分不变)，配合6-BA0.8mg/L+NAA0.05mg/L，pH值5.5，以MS基本培养基为对照，培养一个增殖周期后调查统计新抽不定芽数量及长势情况。

(三)继代培养基中硫代硫酸钠

继代增殖培养过程中发现，培养增殖的茎段新抽芽顶梢或叶有不同程度枯顶或掉叶现象，长势较差。采用培养基1/2MS+6-BA0.8mg/L+NAA0.05mg/L，配合添加Na₂S₂0₃150mg/L、300mg/L，MgSO₄800mg/L、1600mg/L四个处理，以不添加Na₂S₂O₃或MgSO₄为对照，培养一个增殖周期后分别调查统计枯顶或掉叶比率。

(四)生根培养

基本培养基为1/2MS，配合以IBA、NNA、IAA不同浓度及其配比，调查统计15d、30d生根率。

二、结果与分析

(一)不同pH值培养基对增殖速率的影响

从表1可以看出，增殖培养基pH值以5.5为宜。在培养基1/2MS+6-BA0.8mg/L+NAA0.05mg/L(pH=5.5)中，芽团长势好活力足，不定芽数量增多，增殖系数最高，达2.5，同时高度大于2.0cm不定芽和生根苗数量均最多，收获率达1.72。pH值升高或降低，芽团长势一般，增殖系数及收获率均在一般水平；pH值降低到5.0，还会出现新抽叶焉软现象。

表1：不同PH值培养基对增殖速率的影响

(二)不同浓度的6-BA培养基对增殖速率的影响

细胞分裂素6-BA对沉水樟组培增殖的作用具体表现为：在0～1.0mg/L范围内，随着6-BA浓度的升高，增殖系数越高；在1.0～3.0mg/L范围内趋于稳定，增殖系数在2.5左右。综合增殖系数、可收获率及长势情况几个指标考虑，从表2可以看出，6-BA浓度以0.8-1.0mg/L最佳。

表2：不同浓度的6-BA培养基对增殖速率的影响

(三)不同基本盐类浓度的培养基对增殖速率和长势的影响

在6-BA0.8mg/L+NAA0.05mg/L(pH值5.5)，通过调整培养基中不同盐类浓度，可以发现：基本培养基以1/2MS为宜，其增殖系数和收获率最高，且长势良好。如采用全量MS基本培养基，也会出现芽少、活力不足及个别叶片枯掉现象。

表3：不同基本盐类浓度的培养基对增殖速率和长势的影响

(四)硫代硫酸钠在继代增殖中对不定芽生长的影响

在1/2MS+6-BA0.8mg/L+NAA0.05mg/L(pH=5.5)培养基中，沉水樟仍存在不同程度的枯顶和掉叶现象。由表4可知，在继代培养基中加入一定浓度的硫代硫酸钠能有效解决不定芽的枯顶或掉叶问题，增殖芽团在培养基1/2MS+6-BA0.8mg/L+NAA0.05mg/L+Na₂S₂O₃150mg/L(pH=5.5)中，不定芽的枯顶掉叶率降到0.6％。

表4：Na₂S₂O₃对不定芽枯顶和掉叶的影响

(五)生长素IAA、IBA和NAA对生根的影响

探索不同生长素对沉水樟组培生根的影响，生长素IAA对沉水樟组培生根作用不明显，其生根率最高仅26％；IBA和NAA对生根均起作用，但IBA、NAA单独使用，生根率均较低，最高仅78％。试验表明，以1/2MS+IBA1.0mg/L+NAA0.05mg/L培养基最佳，生根率达96％，其根系多且细长，以此处理的生根苗移栽成活率也最高，达90％以上；而1/2MS+IBA1.0mg/L+NAA0.1(或0.2)mg/L，其根系虽多，但粗短易断，移栽后成活率低，仅30～45％之间。

表5：诱导生根试验处理结果

(六)炼苗移栽

将已生根的组培苗拿去炼苗，炼苗20～30d到茎干成深绿色，再洗去培养基移栽到1/3椰糠+2/3泥炭土的基质中，再在温度26～30℃，湿度80～100％的条件下培育25d，成活率可达90％以上。

三、结论与讨论

(一)结论

沉水樟组织培养不定芽诱导培养基可采用MS+6-BA0.2～3.0mg/L+NAA0.01～0.5mg/L(pH=6.0)；继代增殖扩繁培养基可采用1/2MS+6-BA0.3～3.0mg/L+NAA0.03～0.5mg/L+Na₂S₂O₃50～300mg/L(pH=5.5)；诱导生根培养基以1/2MS+IBA0.3～1.5mg/L+NAA0.01～0.3mg/L(pH=5.5)为宜。

(二)讨论

沉水樟组织培养中，很难达到98％以上的有效生根率，仍存在部分不定芽不能生根现象。同时，组培生根苗移栽成活率也仅在90～92％之间。因此，提高有效生根率及移栽成活率，是下一步应研究解决的重点。初步设想在继代增殖和生根培养之间，进行一次过渡增殖培养，通过减低激素水平，复壮培养不定芽来解决生根率低等问题。

以上对本发明所提供的一种沉水樟组织培养方法进行了详尽介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施事例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，对本发明的变更和改进将是可能的，而不会超出附加权利要求所规定的构思和范围，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims

1.一种沉水樟组织培养方法，其特征在于，方法步骤如下：

a.取沉水樟当年新抽半木质化枝条，剪取带有2-3个腋芽的茎段，去除叶片后，置于无菌水中振荡洗涤3～5min，取出后再用70％的酒精处理1～2min，然后置于0.1％HgCl₂7～15min，最后用无菌水清洗3次；

b.将处理好的材料接种到诱导培养基：MS+6-BA0.2～3.0mg/L+NAA0.01～0.5mg/L，获得无菌外植体，在培养温度26～28℃、光强1500～2000lx、光照12h/d条件下，经40～50d后，获得无菌的愈伤组织和不定芽；

c.放入继代增殖培养基：1/2MS(MS基本培养基成分减半)+6-BA0.3～3.0mg/L+NAA0.03～0.5mg/L+Na₂S₂O₃50～300mg/L，pH=5.5；

d.放入诱导生根培养基：1/2MS+IBA0.3～1.5mg/L+NAA0.01～0.3mg/L，pH=5.5；

e.将经以上培养的生根苗移栽。

2.根据权利要求1所述一种沉水樟组织培养方法，其特征在于：步骤b中诱导培养基：MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L。

3.根据权利要求1所述一种沉水樟组织培养方法，其特征在于：步骤c中继代增殖培养基为1/2MS+6-BA0.8mg/L+NAA0.05mg/L+Na₂S₂O₃150mg/L，pH=5.5。

4.根据权利要求1所述一种沉水樟组织培养方法，其特征在于：步骤d中，诱导生根培养基为1/2MS+IBA1.0mg/L+NAA0.05mg/L。

5.根据权利要求1所述一种沉水樟组织培养方法，其特征在于：步骤e中，将已生根的组培苗拿去炼苗，炼苗20～30d至茎干成深绿色，再洗去培养基，移栽到椰糠和泥炭土混合的基质中，其中椰糠占1/3、泥炭土占2/3，在温度26～30℃，湿度80～100％的条件下培育25d。

6.根据权利要求1所述一种沉水樟组织培养方法，其特征在于：所述步骤b、c、d中，MS基本培养基内含蔗糖3％，卡拉胶0.8％。