CN105660406B - 一种茄子花药诱导培养基及配制方法 - Google Patents
一种茄子花药诱导培养基及配制方法 Download PDFInfo
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Classifications
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Abstract
本发明提供了一种茄子花药诱导培养基及配制方法。培养基的成分由大量元素、微量元素、铁盐及络合剂、有机成分、无机添加物、植物生长调节剂、生理活性物质、碳源、凝固剂及其它添加物所组成。培养基的配制方法包括配制母液、制备生理活性物质、配制培养液、培养液加热溶解与分装、培养基高压蒸汽灭菌、培养基加入IAA等步骤。本发明所述的培养基具有高效率地诱导茄子花药产生花粉愈伤、培养基褐化轻的优点，可以显著提高茄子花药培养效率，加快茄子花培育种进程。
Description
技术领域
本发明涉及一种茄子花药诱导培养基及配制方法，具体涉及一种可以显著提高茄子花药培养效率的花药诱导培养基及其配制方法，属于农业科学技术领域。
背景技术
茄子（Solanum melongene L.），别名落苏、伽、酪酥、昆仑瓜、小菰等，是茄科茄属以浆果为产品的一年生草本植物。茄子起源于亚洲东南的印度、缅甸及其临近的热带地区。古印度为最早的驯化地，至今印度仍有茄子野生种和近源种。茄子除鲜食外，还可以加工制成酱茄子、腌茄或茄子干等。茄子果实富含人体所需的蛋白质、维生素、粗纤维和矿物质等，特别是其中富含的维生素P在果蔬中含量最高，可以增加毛细血管的弹性和细胞间的黏力，防止微血管破裂，特有的维生素D可以降低血液中的胆固醇含量，经常食用茄子可防止动脉硬化和心血管疾病，还能增强肝脏生理功能，预防多种肝脏疾病，是一种良好的保健蔬菜。
茄子在全世界都有分布，以亚洲最多，占世界总产量的74%。茄子在我国栽培历史悠久，类型品种繁多，是我国非常重要的果菜类蔬菜，在我国南北各地普遍栽培，2005年种植面积达到105.4万公顷，栽培面积在蔬菜作物中排第四位，产量居世界之首，是我国夏秋的主要栽培蔬菜之一。茄子除了作为一种重要的果菜类蔬菜外，在遗传育种、细胞学等方面也是很重要的研究对象，因此，开展茄子育种一直是蔬菜育种领域的重点工作。
我国的茄子育种方式一直以来都以常规杂交育种为主，周期长、见效慢，不能切实满足生产上对茄子良种的迫切需求，单倍体育种是解决这一问题的重要的育种方法之一。单倍体育种可以大大提高育种选择的效率，缩小育种群体的规模，并缩短育种年限。花药培养和小孢子培养是获得单倍体的主要途径。经花药培养得到的花粉株系间性状变异幅度大，超亲现象和出现特殊优良性状的频率要显著高于常规育种，株系内性状整齐，世代间稳定性强，通过花药或小孢子培养选育出的自交系具有高度的纯和性，以此配制的杂交组合往往具有更强的杂种优势。
茄子花药培养的研究开始于20世纪70年代初。1973年Raina和Lyer通过花药培养经愈伤组织获得了茄子单倍体植株。同年，我国的王纪方等通过培养茄子花药也成功的获得了纯合的单倍体植株。1975年北京市农科院蔬菜所单倍体育种组以六叶茄、九叶茄为材料经花药培养同样获得了单倍体植株，经花药培养培育出品种尤丹茄一号，该品种已在生产上推广应用。1987年，Tuberosa R等进行茄子花药培养试验，成功地通过胚状体途径成苗，得到了单倍体植株。1996年，Miyoshi通过直接培养游离小孢子的方法，经愈伤组织途径获得了再生植株；2004年，连勇等以四倍体茄子为材料进行了游离小孢子培养，获得了再生植株；2007年，孙振英等利用茄子离体小孢子培养技术，通过愈伤组织途径再生获得了茄子二倍体栽培种的再生植株。
茄子花药培养研究虽取得了较大进展，但在理论和应用上仍存在一些问题。至今，关于茄子小孢子由配子体发育途径向孢子体途径转变，进而形成单倍体植株的发育调控机理尚不明确，培养基成分及培养条件间相互作用关系不清楚，茄子花药培养愈伤组织、不定芽诱导率低的问题仍然不能很好的解决，这严重的影响着茄子花药培养技术的进一步发展。因此，加快茄子花培育种机理研究，开发出花药愈伤诱导率分化率更高的培养基，具有重要的现实需求。
发明内容
本发明的目的是针对目前茄子花培育种中花药诱导愈伤组织效率较低的现状，提供了一种茄子花药诱导培养基及配制方法。
本发明的目的是通过以下方式实现的：
一种茄子花药诱导培养基及配制方法，其特征在于：所述培养基的组成为：
大量元素：KNO3 1800～2000mg/L，NH4NO3 1600～1700mg/L，KH2PO4 650～750mg/L，MgSO4∙7H2O 350～400mg/L，CaCl2∙2H2O 400～480mg/L；
微量元素：MnSO4∙4H2O 20～25mg/L，ZnSO4∙7H2O 8.0～9.0mg/L，H3BO3 11～13mg/L，KI 0.75～0.85mg/L，CuSO4∙5H2O 0.02～0.03mg/L，CoCl∙6H2O 0.02～0.03mg/L，NaMoO4∙2H2O 0.2～0.3mg/L；
铁盐及络合剂：FeSO4∙7H2O 50～60mg/L，Na2-EDTA∙2H2O 70～80mg/L；
有机成分：肌醇 230～270mg/L，维生素B1 0.45～0.55mg/L，维生素B6 0.45～0.55mg/L，维生素C 40～50μmol/L，烟酸 0.45～0.55mg/L，叶酸 0.25～0.35mg/L，丝氨酸55～65mg/L，丙氨酸 14～18mg/L；
无机添加物：AgNO3 7.5～8.5mg/L，活性炭 1.6～2.0g/L；
植物生长调节剂：2，4-D 0.45～0.55mg/L，IAA 0.35～0.45mg/L，ZT 0.35～0.45mg/L；
生理活性物质：马铃薯提取液 45～55g/L，椰乳23～27g/L；
碳源：葡萄糖 45～55g/L，纤维二糖 18～22g/L；
凝固剂及其它添加物：植物凝胶 4.7～5.3g/L，甘露醇35～45g/L，水解蛋白 0.9～1.1g/L。
所述的培养基的组分的最佳含量为：
大量元素：KNO3 1900mg/L，NH4NO3 1650mg/L，KH2PO4 700mg/L，MgSO4∙7H2O 375mg/L，CaCl2∙2H2O 440mg/L；
微量元素：MnSO4∙4H2O 22.5mg/L，ZnSO4∙7H2O 8.5mg/L，H3BO3 12mg/L，KI 0.8mg/L，CuSO4∙5H2O 0.025mg/L，CoCl∙6H2O 0.025mg/L，NaMoO4∙2H2O 0.25mg/L；
铁盐及络合剂：FeSO4∙7H2O 55mg/L，Na2-EDTA∙2H2O 75mg/L；
有机成分：肌醇 250mg/L，维生素B1 0.5mg/L，维生素B6 0.5mg/L，维生素C 8mg/L，烟酸 0.5mg/L，叶酸 0.3mg/L，丝氨酸 60mg/L，丙氨酸 16mg/L；
无机添加物：AgNO3 8mg/L，活性炭 1.8g/L；
植物生长调节剂：2，4-D 0.5mg/L，IAA 0.4mg/L，ZT 0.4mg/L；
生理活性物质：马铃薯提取液 50g/L，椰乳25g/L；
碳源：葡萄糖 50g/L，纤维二糖 20g/L；
凝固剂及其它添加物：植物凝胶 5g/L，甘露醇40g/L，水解蛋白 1g/L。
所述的培养基配方的配制pH值为：5.6～6.0，最佳配制pH值为5.8。
所述的培养基的配制方法包括如下步骤：
（1）配制母液
大量元素、微量元素、铁盐及络合剂母液分别配制成10、100、10倍的母液；肌醇单独配制成40倍母液，其它有机成分配制成500倍母液；IAA和ZT分别将称量好后用少量无水酒精溶解，然后用热的蒸馏水定容，2，4-D称量好后加入1mol/L的NaOH，磁力搅拌器搅拌10h即溶解，2，4-D、ZT和IAA母液均配制成0.5g/L；
所有母液预先配制，4℃冷藏保存备用，IAA需用棕色容量瓶装，避光保存；
（2）制备生理活性物质
马铃薯提取液的制备：将马铃薯块茎洗净后称取50g，带皮切成碎片，加入100ml蒸馏水，煮沸20min，用4～6层纱布过滤静置，待沉淀后将取上清液；
椰乳的提取：将新鲜椰汁从椰壳中取出放入容器中，加热至80℃左右，稍静置后过滤至密封塑料瓶中，-20℃冷藏保存备用；
（3）配制培养液
先在烧杯中加入一些蒸馏水，分别量取所需量的大量元素、微量元素、铁盐及络合剂、肌醇母液、有机成分母液加入烧杯中，将称量好的AgNO3、活性炭、蔗糖、纤维二糖、甘露醇、水解蛋白、马铃薯提取液和椰乳加入烧杯中，搅拌溶解定容至1L后用pH计调节pH值；
（4）培养液加热溶解与分装
将称量好的植物凝胶加入配好的培养液中，用电炉加热至沸腾，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈透明状后停止加热，稍微冷却后，按照25ml培养基/瓶分装入100ml三角瓶中，封口膜密封，扎紧；
（5）培养基高压蒸汽灭菌
将三角瓶置于温度为121℃、压力为15kPa高压蒸汽条件下灭菌20min，而后降温至55℃左右取出，置于超净工作台中；
（6）培养基内添加IAA
按照25ml培养基/瓶的用量计算需加入的IAA母液用量，无菌操作下加入已灭菌的IAA母液，趁热摇匀，密封后自然冷却。
所述步骤6中的IAA母液的灭菌方法为：用灭菌的0.22μm的微孔滤膜无菌操作，过滤灭菌。
本发明所述的培养基具有高效率地诱导茄子花药产生花粉愈伤、培养基褐化轻的优点，可以显著提高茄子花药培养效率，加快茄子花培育种进程。
具体实施方式
下面结合实施案例对本发明作进一步说明，而非限制本发明。
实施例1
（1）配制母液
大量元素母液：按照培养基中大量元素的配方：KNO3 1900mg/L，NH4NO3 1650mg/L，KH2PO4 700mg/L，MgSO4∙7H2O 375mg/L，CaCl2∙2H2O 440mg/L配制大量元素母液，各成分溶解在一起，配制为10倍的母液；
微量元素母液：按照培养基中微量元素的配方：MnSO4∙4H2O 22.5mg/L，ZnSO4∙7H2O8.5mg/L，H3BO3 12mg/L，KI 0.8mg/L，CuSO4∙5H2O 0.025mg/L，CoCl∙6H2O 0.025mg/L，NaMoO4∙2H2O 0.25mg/L配制微量元素母液，各成分溶解在一起，配制为100倍的母液；
铁盐及络合剂母液：按照培养基中铁盐及络合剂的配方：FeSO4∙7H2O 55mg/L，Na2-EDTA∙2H2O 75mg/L L配制铁盐及络合剂母液，二者溶解在一起，配制为10倍的母液；
肌醇母液：按照培养基中肌醇的配方：肌醇 250mg/L单独配制肌醇母液，配制成40倍母液；
有机成分母液：按照培养基中有机成分的配方：维生素B1 0.5mg/L，维生素B60.5mg/L，维生素C 8mg/L，烟酸 0.5mg/L，叶酸 0.3mg/L，丝氨酸 60mg/L，丙氨酸 16mg/L配制有机成分母液，各成分溶解在一起，配制为500倍的母液；
植物生长调节剂母液：IAA和ZT分别将称量好后用少量无水酒精溶解，然后用热的蒸馏水定容，2，4-D称量好后加入1mol/L的NaOH，磁力搅拌器搅拌10h即溶解，2，4-D、ZT和IAA母液均配制成0.5g/L；
所有母液预先配制，4℃冷藏保存备用，IAA需用棕色容量瓶装，避光保存；
（2）制备生理活性物质
马铃薯提取液的制备：将马铃薯块茎洗净后称取50g，带皮切成碎片，加入100ml蒸馏水，煮沸20min，用4～6层纱布过滤静置，待沉淀后将取上清液；
椰乳的提取：将新鲜椰汁从椰壳中取出放入容器中，加热至80℃左右，稍静置后过滤至密封塑料瓶中，-20℃冷藏保存备用；
（3）配制培养液
先在烧杯中加入一些蒸馏水，分别量取所需量的大量元素、微量元素、铁盐及络合剂、肌醇母液、有机成分母液加入烧杯中，将称量好的AgNO3、活性炭、蔗糖、纤维二糖、甘露醇、水解蛋白、马铃薯提取液和椰乳加入烧杯中，搅拌溶解定容至1L后用pH计调节pH值；
（4）培养液加热溶解与分装
将称量好的植物凝胶加入配好的培养液中，用电炉加热至沸腾，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈透明状后停止加热，稍微冷却后，按照25ml培养基/瓶分装入100ml三角瓶中，封口膜密封，扎紧；
（5）培养基高压蒸汽灭菌
将三角瓶置于温度为121℃、压力为15kPa高压蒸汽条件下灭菌20min，而后降温至55℃左右取出，置于超净工作台中；
（6）培养基内添加IAA
将IAA母液预先用灭菌的0.22μm的微孔滤膜无菌操作，过滤灭菌，然后按照25ml培养基/瓶的用量计算需加入的IAA母液用量，无菌操作下加入已灭菌的IAA母液，趁热摇匀，密封后自然冷却。
选择茄子品种绿罐茄和博杂一号作为花药培养供体，田间植株进入花期后，于晴天上午9：00-11：00取盛花期花蕾，将花蕾用洗衣粉洗净，以清洗附着在外植体上的灰尘和细菌，再用流动的自来水冲洗，4℃低温预处理。2天后取出花蕾，把花蕾用75%的酒精浸30S，再用滴加1滴吐温-20的0.1%的氯化汞溶液浸8min，取出后用无菌蒸馏水冲洗5次，然后在无菌条件下剥出花药接种于本发明的茄子花药诱导培养基，暗培养4周左右，得到白色或淡绿色愈伤，计算愈伤组织诱导率，然后转移入再生培养基。愈伤组织诱导率（%）=（愈伤组织产生数/接种花药总数）×100，茄子愈伤组织诱导率统计结果如下表。
由上表的统计结果可以发现，本发明的茄子花药诱导培养基对茄子品种绿罐茄和博杂一号花药愈伤组织的平均诱导率为9.7%，花药诱导效率较前人有了较大的提高，有效的解决了目前茄子花药培养中愈伤组织诱导率过低的问题。本发明提供的茄子花药诱导培养基对茄子花药诱导效率高、花培效果好，可以大大加快茄子育种进程。
上述实例只是为说明本发明的技术构思以及技术特点，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明的实质所做的等效变换或修饰，都应该涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种茄子花药诱导培养方法，其特征在于：所采用的茄子花药诱导培养基由以下组分制成：
大量元素：KNO3 1900mg/L，NH4NO3 1650mg/L，KH2PO4 700mg/L，MgSO4∙7H2O 375mg/L，CaCl2∙2H2O 440mg/L；
微量元素：MnSO4∙4H2O 22.5mg/L，ZnSO4∙7H2O 8.5mg/L，H3BO3 12mg/L，KI0.8mg/L，CuSO4∙5H2O 0.025mg/L，CoCl2∙6H2O 0.025mg/L，Na2MoO4∙2H2O 0.25mg/L；
铁盐及络合剂：FeSO4∙7H2O 55mg/L，Na2-EDTA∙2H2O 75mg/L；
有机成分：肌醇250mg/L，维生素B1 0.5mg/L，维生素B6 0.5mg/L，维生素C 8mg/L，烟酸0.5mg/L，叶酸0.3mg/L，丝氨酸60mg/L，丙氨酸16mg/L；
无机添加物：AgNO3 8mg/L，活性炭1.8g/L；
植物生长调节剂：2，4-D 0.5mg/L，IAA 0.4mg/L，ZT 0.4mg/L；
生理活性物质：马铃薯提取液50g/L，椰乳25g/L；
碳源：葡萄糖50g/L，纤维二糖20g/L；
凝固剂及其它添加物：植物凝胶5g/L，甘露醇40g/L，水解蛋白1g/L；
茄子花药诱导培养方法包括：
选择茄子品种绿罐茄和博杂一号作为花药培养供体，田间植株进入花期后，于晴天上午9：00-11：00取盛花期花蕾，将花蕾用洗衣粉洗净，以清洗附着在外植体上的灰尘和细菌，再用流动的自来水冲洗，4℃低温预处理；2天后取出花蕾，把花蕾用75%的酒精浸30S，再用滴加1滴吐温-20的0.1%的氯化汞溶液浸8min，取出后用无菌蒸馏水冲洗5次，然后在无菌条件下剥出花药接种于茄子花药诱导培养基，暗培养4周，得到白色或淡绿色愈伤。
2.根据权利要求1所述的茄子花药诱导培养方法，其特征在于：所述茄子花药诱导培养基的pH值为：5.6～6.0。
3.根据权利要求1所述的茄子花药诱导培养方法，其特征在于：所述茄子花药诱导培养基的配制方法包括如下步骤：
（1）配制母液
大量元素、微量元素、铁盐及络合剂母液分别配制成10、100、10倍的母液；肌醇单独配制成40倍母液，其它有机成分配制成500倍母液；IAA和ZT分别将称量好后用少量无水酒精溶解，然后用热的蒸馏水定容，2，4-D称量好后加入1mol/L的NaOH，磁力搅拌器搅拌10h即溶解，2，4-D、ZT和IAA母液均配制成0.5g/L；所有母液预先配制，4℃冷藏保存备用，IAA需用棕色容量瓶装，避光保存；
（2）制备生理活性物质
马铃薯提取液的制备：将马铃薯块茎洗净后称取50g，带皮切成碎片，加入100ml蒸馏水，煮沸20min，用4～6层纱布过滤静置，待沉淀后将取上清液；
椰乳的提取：将新鲜椰汁从椰壳中取出放入容器中，加热至80℃，稍静置后过滤至密封塑料瓶中，-20℃冷藏保存备用；
（3）配制培养液
先在烧杯中加入一些蒸馏水，分别量取所需量的大量元素、微量元素、铁盐及络合剂、肌醇母液、有机成分母液加入烧杯中，将称量好的AgNO3、活性炭、蔗糖、纤维二糖、甘露醇、水解蛋白、马铃薯提取液和椰乳加入烧杯中，搅拌溶解定容至1L后用pH计调节pH值；
（4）培养液加热溶解与分装
将称量好的植物凝胶加入配好的培养液中，用电炉加热至沸腾，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈透明状后停止加热，稍微冷却后，按照25ml培养基/瓶分装入100ml三角瓶中，封口膜密封，扎紧；
（5）培养基高压蒸汽灭菌
将三角瓶置于温度为121℃、压力为15kPa高压蒸汽条件下灭菌20min，而后降温至55℃取出，置于超净工作台中；
（6）培养基内添加IAA
按照25ml培养基/瓶的用量计算需加入的IAA母液用量，无菌操作下加入已灭菌的IAA母液，趁热摇匀，密封后自然冷却。
4.根据权利要求3所述的茄子花药诱导培养方法，其特征在于：IAA母液的灭菌方法为：用灭菌的0.22μm的微孔滤膜无菌操作，过滤灭菌。
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