CN105993948A - 一种香水百合的花药培养脱毒方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种香水百合的花药培养脱毒方法，该脱毒方法详细步骤包括：（1）配制香水百合花药诱导培养基；（2）接种花药的选材；（3）花药消毒与接种；（4）花药诱导培养；（5）胚性愈伤分化与继代培养；（6）香水百合鳞茎的炼苗与移栽；（7）香水百合单倍体植株的剔除。本发明的香水百合的花药培养脱毒方法通过香水百合花药培养获得了香水百合花粉植株，进而剔除群体中掺杂的单倍体植株获得香水百合二倍体植株，进一步进行百合病毒检测发现，该脱毒方法几乎达到100%脱毒，大大提高了百合种质，获得了产量和品质得到极大提升的百合脱毒植株。

Description

一种香水百合的花药培养脱毒方法
技术领域
本发明涉及园艺学领域，尤其涉及一种通过花药培养途径高效脱除百合病毒的香水百合的花药培养脱毒方法。
背景技术
百合（Lilium spp.）是百合科（Liliaceae）百合属（Lilium）多年生球根花卉，其花大、花色丰富、花形优美、寓意纯洁而深受人们喜爱，是当今世界上重要的切花品种之一。西方人以百合为圣洁象征，在公元约1000年前以色列国王所罗门的寺庙柱顶就是用百合花作装饰。百合花的花名是为了纪念圣母玛利亚，自古以来圣母就被基督教视为清纯的象征，因此它的花语就是纯洁。目前全世界约有100多种百合品种，我国栽培约有60多种。百合切花是目前世界上发展最快的花卉之一。
香水百合是百合中的一种，别名卡萨布兰卡，天上百合，原产地为喜马拉雅山区、澳洲等各个地区。香水百合是百合中的女王，花语为“伟大纯洁的爱”，送的是心仪的女子，香水百合发展潜力巨大，市场前景广阔。
百合以有性方式（种子繁殖）和无性方式进行繁殖，商业上主要以扦插繁殖和分球繁殖等无性繁殖为主，长期的无性繁殖将会使体内逐渐积累大量病毒致使植物发生病毒病，并导致种性退化，百合也不例外。病毒病经常对百合生产造成严重危害。自Stewart（1896）描述百合的坏死条纹以来，相继报道了百合的病毒病原19种，其中发生普遍、危害严重的病毒有4种，即百合无病症病毒（LSV）、黄瓜花叶病毒（CMV）、百合 X 病毒（LVX）和郁金香顶裂病毒等4种病毒危害。近年来，随着百合引种数量的增加、种植面积的扩大以及不规范的种球自繁，病毒病已开始在我国各百合种植区发生流行，一般发病率为40%-50%，二代种球的带毒率在90%以上。病毒病对百合的危害表现主要有：植株严重矮化，脉明，花叶，畸形，坏死斑，鳞茎变小，产量下降，种质明显退化，开花少且小，有的甚至盲花，严重时整株枯死，严重制约了我国百合的产量和质量。
百合在中国鲜切花中属于高端花卉，年销量不断攀升，这使得百合脱毒技术的研究成为百合产量和品质发展的重要手段，如何减少和消除病毒病，生产优质无毒种苗，是百合种球商品化生产面临的一个重要问题。目前，百合病毒病已成为仅次于真菌病害的主要病害，由于病毒复制与植物代谢密切相关，而且有些病毒的抗逆性很强，一直没有有效的防治措施，因此，获得无病毒苗成为生产高品质百合的关键。对百合脱毒研究最早的是Philhps（1962年），利用百合茎尖培养脱毒苗，试验获得成功后，又有许多外国学者也成功获得茎尖脱毒苗。1966年Mori和Hamaya 通过茎尖培养获得了百合无病毒植株。目前，生产上主要是通过热处理、组培茎尖脱毒和化学处理等方法进行脱毒。然而，目前的百合脱毒方法并不完善，各种脱毒方法均有其不足之处。热处理是利用病毒和植物对温度敏感性的差异不同，利用高温对植物进行处理，高温使病毒钝化，在植物体内很难繁殖，部分植物细胞耐高温加速细胞分裂和繁殖，从而获得无病毒的新生植物组织部分，再进一步繁殖得到无病毒苗，然而热处理不能脱除所有病毒，且影响百合存活率；茎尖培养脱毒是利用病毒在植物体内分布不均匀，在根尖和茎尖病毒含量很少或不含病毒，因此，采用茎尖离体培养的方法可以脱除病毒，其缺点是植物的存活率很低；化学处理法是将抗病毒药剂注射进植物体内或者加入培养基中，以达到除去病毒的目的，一般要与茎尖组织培养相结合应用，可一定程度的提高茎尖脱毒效率和存活率。
花药离体培养是把花粉发育到一定阶段的花药接种到培养基上，来改变花药内花粉粒的发育程序，使其分裂形成细胞团，进而分化成胚状体，形成愈伤组织，由愈伤组织再分化成植株的一种技术，花药培养主要用途为培育单倍体植株，然而，由于小孢子基本不携带病毒，通过花药培养培育的植株几乎能达到完全脱毒的目的，因此，若将离体的百合花药培育成单倍体植株，进而选择百合的单倍体植株加倍的正常植株来育苗，可以较好的达到百合脱毒的目的。
目前，在百合脱毒技术研究中，还是以热处理和茎尖组织培养技术研究和利用的比较多，百合花药培养脱毒法研究和利用的较少，但在一些园艺作物上已见报道。主要原因还是在于现有的百合花药培养效率较低，远远达不到生产的要求。培养基是花药培养的物质基础，直接关系到培养物的生长与分化，培养基组分是影响花培效率的一个很重要的因素。培养基各组分的合适用量，以及它们之间一定的组合关系，可导致花培效率的大幅度提高。继续筛选和优化基本培养基，提高培养基选用的针对性，是提高花药培养力的有效措施；大量的研究发现一些附加物可以显著提高花药培养力，发现和优化组合花药培养附加物质，可进一步提高花药培养力。
通过大量香水百合花药培养的摸索和实践，我们进一步优化了基本培养基配方，并且不断尝试加入一些提高花药诱导力的添加物并组合其种类搭配及浓度，摸索出了一种高效率地诱导香水百合花药诱导培养的培养基配方，达到了通过香水百合花药培养进行脱毒的产业化应用效率。我们的研究结果对于香水百合的脱毒技术的进步具有较大的实用价值。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术存在的缺陷，提供了一种通过香水百合花药培养途径高效脱除百合病毒的香水百合的花药培养脱毒方法。
本发明的目的是通过以下技术方案解决的：
一种香水百合的花药培养脱毒方法，其特征在于：该花药培养脱毒方法的详细步骤如下：
（1）配制香水百合花药诱导培养基
香水百合花药诱导培养基按每升蒸馏水中由以下物质配制而成：
大量元素：KNO3 2500～2700mg/L，NH4NO3 1600～1800mg/L，KH2PO4 440～480mg/L，MgSO4∙7H2O 350～390mg/L，CaCl2∙2H2O 820～860mg/L；
微量元素：MnSO4∙4H2O 20～25mg/L，ZnSO4∙7H2O 8.0～9.0mg/L，H3BO3 6.0～6.5mg/L，KI 0.8～0.85mg/L，CuSO4∙5H2O 0.02～0.03mg/L，CoCl∙6H2O 0.02～0.03mg/L，NaMoO4∙2H2O0.2～0.3mg/L；
铁盐：Na2-EDTA∙2H2O 35～40mg/L，FeSO4∙7H2O 25～30mg/L；
有机成分：肌醇 90～110mg/L，维生素B1 0.09～0.11mg/L，维生素B6 0.45～0.55mg/L，烟酸 0.45～0.55mg/L，甘氨酸 1.8～2.2mg/L，丝氨酸 0.75～0.85mg/L；
激素：2，4-D 3.2～3.6mg/L，KT 2.0～2.4mg/L；
凝固剂：植物凝胶 6.0～6.5g/L；
活性添加剂：椰乳14～16g/L，甘露醇20～24g/L，水解蛋白 0.8～1.0g/L，活性炭 0.35～0.45g/L；
碳源：蔗糖55～65g/L；
将大量元素、微量元素、铁盐、有机成分和激素分别配制成一定浓度倍数的母液贮备，配制时，预先量出配制培养基总量一半体积的蒸馏水，分别加入一定体积或质量的大量元素、微量元素、铁盐、有机成分、活性添加剂，定容，加热至60-80℃，然后加入碳源、凝固剂和激素，搅拌至沸腾后，培养基完全融解，停止加热，调节pH为5.8-6.0，然后将培养基分装于500ml的三角瓶中，每瓶盛120ml～150ml的培养基，密封后置于温度为121℃、压力为15kPa高压蒸汽条件下灭菌20min，自然冷却凝固；
（2）接种花药的选材
在香水百合正常现蕾开花季节，上午取材，用冰壶带回实验室；
（3）花药消毒与接种
将花蕾用自来水冲洗10～20min，在超净工作台无菌条件下，先用75%酒精消毒2min，再用0.1%升汞+2-3滴吐温-80消毒15min，无菌水冲洗3～4次后，从花蕾中取出带有花丝的花药，接种到步骤（1）的诱导培养基上；
（4）花药诱导培养
将接种花药后的培养基进行花药诱导培养，50-65d后诱导出花药胚性愈伤；
（5）胚性愈伤分化与继代培养
无菌条件下将诱导成功的胚性愈伤组织转接到分化培养基上，光照条件下分化培养25-40天至小芽长至0.6cm以上，将高于0.6cm的小芽切下，转接入继代培养基上继代培养，2-3个月后即可得到直径 0.8-2.0cm 的百合小鳞茎；
（6）香水百合鳞茎的炼苗与移栽
将香水百合小鳞茎的三角瓶封口膜打开炼苗，7～10d后将小鳞茎从三角瓶中取出，清洗掉根部的培养基残留，移栽入温室内，定期喷施百合壮苗营养液来壮苗；
（7）香水百合单倍体植株的剔除
采用根尖压片法观察所得香水百合植株的倍性，剔除仅含12条染色体的百合单倍体植株。
所述步骤（1）的香水百合花药诱导培养基的最佳配方为：
按每升蒸馏水中由以下物质配制而成：
大量元素：KNO3 2600mg/L，NH4NO3 1700mg/L，KH2PO4 460mg/L，MgSO4∙7H2O 370mg/L，CaCl2∙2H2O 840mg/L；
微量元素：MnSO4∙4H2O 22.5mg/L，ZnSO4∙7H2O 8.5mg/L，H3BO3 6.25mg/L，KI 0.825mg/L，CuSO4∙5H2O 0.025mg/L，CoCl∙6H2O 0.025mg/L，NaMoO4∙2H2O 0.25mg/L；
铁盐：Na2-EDTA∙2H2O 37.5mg/L，FeSO4∙7H2O 27.5mg/L；
有机成分：肌醇 100mg/L，维生素B1 0.1mg/L，维生素B6 0.5mg/L，烟酸 0.5mg/L，甘氨酸 2.0mg/L，丝氨酸 0.8mg/L；
激素：2，4-D 3.4mg/L，KT 2.2mg/L；
凝固剂：植物凝胶 6.25g/L；
活性添加剂：椰乳15g/L，甘露醇22g/L，水解蛋白 0.9g/L，活性炭 0.4g/L；
碳源：蔗糖60g/L。
所述步骤（2）中的筛选百合花蕾的标准为：按照花蕾长度为22～28mm、花蕾内花药中的小孢子大都处于单核期的标准选择花蕾。
所述步骤（4）中花药诱导培养的培养条件控制为：温度控制为24℃-27℃，湿度控制为65%-80%，黑暗条件。
所述步骤（5）中分化培养的培养基配方为：MS+6.5%蔗糖+0.8mg/L2，4-D+0.25mg/LNAA；培养条件控制为：温度25℃-28℃，湿度65%-80%，光照为1200-1800Lx，光周期为14h光/10h暗。
所述步骤（5）中继代培养的培养基配方为：1/2MS+6.0%蔗糖+0.6mg/L6-BA +0.15mg/L NAA；培养条件控制为：温度25℃-28℃，湿度65%-80%，光照为1200-1800Lx，光周期为14h光/10h暗。
所述步骤（6）中百合壮苗营养液的配方为：KH2PO4 0.3g/L，CaSO4 0.1g/L，MgSO4∙7H2O 0.1g/L，ZnSO4∙7H2O 0.2mg/L，FeSO4∙7H2O 0.6mg/L，CuSO4 0.1mg/L，MnSO4∙4H2O0.5mg/L，H3BO3 0.2mg/L；将以上个成分定量充分溶解在纯净水里即成营养液；
所述的百合壮苗营养液的用法为：百合鳞茎移栽时浇一次，以后每7-10天浇一次，每次用量为50-80ml/株百合。
所述步骤（7）中香水百合单倍体植株的剔除在生产上的标准可以简化为：移栽后的香水百合生长到现蕾期时，根据植株高度差异，将群体植株高度后30%的植株剔除。
本发明相比现有技术有如下优点：
本发明通过优化香水百合花药培养途径的培养基配方，摸索出了一种高效率地诱导香水百合花药诱导培养的培养基，使得香水百合的花培效率达到了通过香水百合花药培养进行脱毒生产脱毒植株的产业化应用要求。
由于百合花药中的花粉基本不携带病毒，通过花药培养培育的花粉植株几乎能达到完全脱毒的目的，我们将花粉植株进行百合病毒检测也发现，该脱毒方法几乎达到100%脱毒，大大提高了百合种质，获得了产量和品质均得到极大提升的百合脱毒植株。
具体实施方式
下面结合实施案例对本发明作进一步说明，而非限制本发明。
实施例1
2012年7月，选择大田栽培的香水百合品种白精灵和元帅的花药分别进行花培诱导脱毒，其详细步骤如下：
（1）配制香水百合花药诱导培养基
按每升蒸馏水中由以下物质配制而成：
大量元素：KNO3 2600mg/L，NH4NO3 1700mg/L，KH2PO4 460mg/L，MgSO4∙7H2O 370mg/L，CaCl2∙2H2O 840mg/L；
微量元素：MnSO4∙4H2O 22.5mg/L，ZnSO4∙7H2O 8.5mg/L，H3BO3 6.25mg/L，KI 0.825mg/L，CuSO4∙5H2O 0.025mg/L，CoCl∙6H2O 0.025mg/L，NaMoO4∙2H2O 0.25mg/L；
铁盐：Na2-EDTA∙2H2O 37.5mg/L，FeSO4∙7H2O 27.5mg/L；
有机成分：肌醇 100mg/L，维生素B1 0.1mg/L，维生素B6 0.5mg/L，烟酸 0.5mg/L，甘氨酸 2.0mg/L，丝氨酸 0.8mg/L；
激素：2，4-D 3.4mg/L，KT 2.2mg/L；
凝固剂：植物凝胶 6.25g/L；
活性添加剂：椰乳15g/L，甘露醇22g/L，水解蛋白 0.9g/L，活性炭 0.4g/L；
碳源：蔗糖60g/L；
将大量元素、微量元素、铁盐、有机成分和激素分别配制成一定浓度倍数的母液贮备，配制时，预先量出配制培养基总量一半体积的蒸馏水，分别加入一定体积或质量的大量元素、微量元素、铁盐、有机成分、活性添加剂，定容，加热至70℃左右，然后加入碳源、植物凝胶和激素，搅拌至沸腾后，培养基完全融解，停止加热，调节pH为5.9，然后将培养基分装于500ml的三角瓶中，每瓶盛120ml～150ml的培养基，密封后置于温度为121℃、压力为15kPa高压蒸汽条件下灭菌20min，自然冷却凝固即得；
（2）接种花药的选材
在白精灵和元帅正常现蕾开花季节，上午取材，按照花蕾长度为22～28mm、花蕾内花药中的小孢子大都处于单核期的标准选择花蕾，分别用冰壶带回实验室；
（3）花药消毒与接种
将花蕾用自来水冲洗10～20min，在超净工作台无菌条件下，先用75%酒精消毒2min，再用0.1%升汞+2-3滴吐温-80消毒15min，无菌水冲洗3～4次后，从花蕾中取出带有花丝的花药，接种到步骤（1）的诱导培养基上；
（4）花药诱导培养
将接种白精灵和元帅花药后的培养基分别进行花药诱导培养，培养室环境控制为：温度24℃-27℃，湿度65%-80%，黑暗条件；花药诱导培养50-65d后，白精灵和元帅均诱导出幼嫩黄白、松散状的花药胚性愈伤，统计白精灵和元帅愈伤组织诱导率，分别达到了25.3%和18.7%；
（5）胚性愈伤分化与继代培养
无菌条件下将诱导成功的白精灵和元帅的胚性愈伤组织转接到分化培养基上（分化培养基配方为：MS+6.5%蔗糖+0.8mg/L2，4-D+0.25mg/L NAA），光照条件下（培养条件控制为：温度25℃-28℃，湿度65%-80%，光照为1200-1800Lx，光周期为14h光/10h暗）分化培养25-40天至小芽长至0.6cm以上，此时统计愈伤组织分化率，白精灵和元帅愈伤组织分化率分别为87.6%和78.9%；将高于0.6cm的小芽切下，转接入继代培养基上（继代培养基配方为：1/2MS+6.0%蔗糖+0.6mg/L6-BA +0.15mg/L NAA）继代培养（培养条件控制为：温度25℃-28℃，湿度65%-80%，光照为1200-1800Lx，光周期为14h光/10h暗），2-3个月后得到直径 0.8-2.0cm 的百合小鳞茎；
（6）鳞茎的炼苗与移栽
将白精灵和元帅小鳞茎的三角瓶封口膜打开炼苗，7～10d后将小鳞茎从三角瓶中取出，清洗掉根部的培养基残留，移栽入温室内，喷施百合壮苗营养液壮苗（百合壮苗营养液的配方为：KH2PO4 0.3g/L，CaSO4 0.1g/L，MgSO4∙7H2O 0.1g/L，ZnSO4∙7H2O 0.2mg/L，FeSO4∙7H2O 0.6mg/L，CuSO4 0.1mg/L，MnSO4∙4H2O 0.5mg/L，H3BO3 0.2mg/L；将以上个成分定量充分溶解在纯净水里即成营养液），百合壮苗营养液的施用用法为：百合鳞茎移栽时浇一次，以后每7-10天浇一次，每次用量为50-80ml/株百合；
（7）单倍体植株的剔除
采用根尖压片法观察所得白精灵和元帅植株的倍性，剔除仅含12条染色体的百合单倍体植株；统计白精灵和元帅单倍体植株的比例，分别为22.7%和26.5%，且白精灵和元帅单倍体植株在各自的花培群体中均表现为最矮，生长至现蕾期时差异尤为明显，因此，在生产上剔除百合单倍体植株的标准可以简化为：移栽后的香水百合生长到现蕾期时，根据植株高度差异，将群体植株高度后30%的植株剔除。
实施例2
2013年4月，采用目前常用的茎尖分生组织培养结合热处理和茎尖培养结合病毒唑化学处理的两种常规百合脱毒方法对百合品种白精灵和元帅进行脱毒处理，分别获得白精灵和元帅脱毒苗，将实施例1采用本发明的技术路线获得的白精灵和元帅脱毒苗冷冻株，一起检测侵染百合的3种主要病毒：黄瓜花叶病毒（CMV）、百合无症病毒（LSV）和百合斑驳病毒（LMoV），比较本发明的技术路线与常规脱毒方法对百合常见病毒的脱毒效果差异。鉴定方法采用多重RT-PCR技术（参照陈进等《百合三种主要病毒的RT-PCR检测及脱毒技术研究》），三种脱毒方法对白精灵和元帅三种病毒的脱毒效果如表1。
由表1可以发现，本发明的香水百合的花药培养脱毒方法基本可以达到完全脱毒的效果，相比目前常规的百合脱毒方法，脱毒效果有了极大的进步，而且百合花药培养操作技术较常规茎尖培养操作技术要求低，更便于产业化实施。因此，本发明对香水百合的脱毒需求具有巨大的进步和极大的产业化价值。
上述实例只是为说明本发明的技术构思以及技术特点，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明的实质所做的等效变换或修饰，都应该涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种香水百合的花药培养脱毒方法，其特征在于：该花药培养脱毒方法的详细步骤如下：
（1）配制香水百合花药诱导培养基
香水百合花药诱导培养基按每升蒸馏水中由以下物质配制而成：
大量元素：KNO3 2500～2700mg/L，NH4NO3 1600～1800mg/L，KH2PO4 440～480mg/L，MgSO4∙7H2O 350～390mg/L，CaCl2∙2H2O 820～860mg/L；
微量元素：MnSO4∙4H2O 20～25mg/L，ZnSO4∙7H2O 8.0～9.0mg/L，H3BO3 6.0～6.5mg/L，KI 0.8～0.85mg/L，CuSO4∙5H2O 0.02～0.03mg/L，CoCl∙6H2O 0.02～0.03mg/L，NaMoO4∙2H2O0.2～0.3mg/L；
铁盐：Na2-EDTA∙2H2O 35～40mg/L，FeSO4∙7H2O 25～30mg/L；
有机成分：肌醇 90～110mg/L，维生素B1 0.09～0.11mg/L，维生素B6 0.45～0.55mg/L，烟酸 0.45～0.55mg/L，甘氨酸 1.8～2.2mg/L，丝氨酸 0.75～0.85mg/L；
激素：2，4-D 3.2～3.6mg/L，KT 2.0～2.4mg/L；
凝固剂：植物凝胶 6.0～6.5g/L；
活性添加剂：椰乳14～16g/L，甘露醇20～24g/L，水解蛋白 0.8～1.0g/L，活性炭 0.35～0.45g/L；
碳源：蔗糖55～65g/L；
将大量元素、微量元素、铁盐、有机成分和激素分别配制成一定浓度倍数的母液贮备，配制时，预先量出配制培养基总量一半体积的蒸馏水，分别加入一定体积或质量的大量元素、微量元素、铁盐、有机成分、活性添加剂，定容，加热至60-80℃，然后加入碳源、凝固剂和激素，搅拌至沸腾后，培养基完全融解，停止加热，调节pH为5.8-6.0，然后将培养基分装于500ml的三角瓶中，每瓶盛120ml～150ml的培养基，密封后置于温度为121℃、压力为15kPa高压蒸汽条件下灭菌20min，自然冷却凝固；
（2）接种花药的选材
在香水百合正常现蕾开花季节，上午取材，用冰壶带回实验室；
（3）花药消毒与接种
将花蕾用自来水冲洗10～20min，在超净工作台无菌条件下，先用75%酒精消毒2min，再用0.1%升汞+2-3滴吐温-80消毒15min，无菌水冲洗3～4次后，从花蕾中取出带有花丝的花药，接种到步骤（1）的诱导培养基上；
（4）花药诱导培养
将接种花药后的培养基进行花药诱导培养，50-65d后诱导出花药胚性愈伤；
（5）胚性愈伤分化与继代培养
无菌条件下将诱导成功的胚性愈伤组织转接到分化培养基上，光照条件下分化培养25-40天至小芽长至0.6cm以上，将高于0.6cm的小芽切下，转接入继代培养基上继代培养，2-3个月后即可得到直径 0.8-2.0cm 的百合小鳞茎；
（6）香水百合鳞茎的炼苗与移栽
将香水百合小鳞茎的三角瓶封口膜打开炼苗，7～10d后将小鳞茎从三角瓶中取出，清洗掉根部的培养基残留，移栽入温室内，定期喷施百合壮苗营养液来壮苗；
（7）香水百合单倍体植株的剔除
采用根尖压片法观察所得香水百合植株的倍性，剔除仅含12条染色体的百合单倍体植株。
2.根据权利要求 1所述的香水百合的花药培养脱毒方法，其特征在于：所述步骤（1）的香水百合花药诱导培养基的最佳配方为：
按每升蒸馏水中由以下物质配制而成：
大量元素：KNO3 2600mg/L，NH4NO3 1700mg/L，KH2PO4 460mg/L，MgSO4∙7H2O 370mg/L，CaCl2∙2H2O 840mg/L；
微量元素：MnSO4∙4H2O 22.5mg/L，ZnSO4∙7H2O 8.5mg/L，H3BO3 6.25mg/L，KI 0.825mg/L，CuSO4∙5H2O 0.025mg/L，CoCl∙6H2O 0.025mg/L，NaMoO4∙2H2O 0.25mg/L；
铁盐：Na2-EDTA∙2H2O 37.5mg/L，FeSO4∙7H2O 27.5mg/L；
有机成分：肌醇 100mg/L，维生素B1 0.1mg/L，维生素B6 0.5mg/L，烟酸 0.5mg/L，甘氨酸 2.0mg/L，丝氨酸 0.8mg/L；
激素：2，4-D 3.4mg/L，KT 2.2mg/L；
凝固剂：植物凝胶 6.25g/L；
活性添加剂：椰乳15g/L，甘露醇22g/L，水解蛋白 0.9g/L，活性炭 0.4g/L；
碳源：蔗糖60g/L。
3.根据权利要求 1所述的香水百合的花药培养脱毒方法，其特征在于：所述步骤（2）中的筛选百合花蕾的标准为：按照花蕾长度为22～28mm、花蕾内花药中的小孢子大都处于单核期的标准选择花蕾。
4.根据权利要求 1所述的香水百合的花药培养脱毒方法，其特征在于：所述步骤（4）中花药诱导培养的培养条件控制为：温度控制为24℃-27℃，湿度控制为65%-80%，黑暗条件。
5.根据权利要求 1所述的香水百合的花药培养脱毒方法，其特征在于：所述步骤（5）中分化培养的培养基配方为：MS+6.5%蔗糖+0.8mg/L2，4-D+0.25mg/L NAA；培养条件控制为：温度25℃-28℃，湿度65%-80%，光照为1200-1800Lx，光周期为14h光/10h暗。
6.根据权利要求 1所述的香水百合的花药培养脱毒方法，其特征在于：所述步骤（5）中继代培养的培养基配方为：1/2MS+6.0%蔗糖+0.6mg/L6-BA +0.15mg/L NAA；培养条件控制为：温度25℃-28℃，湿度65%-80%，光照为1200-1800Lx，光周期为14h光/10h暗。
7.根据权利要求 1所述的香水百合的花药培养脱毒方法，其特征在于：所述步骤（6）中百合壮苗营养液的配方为：KH2PO4 0.3g/L，CaSO4 0.1g/L，MgSO4∙7H2O 0.1g/L，ZnSO4∙7H2O0.2mg/L，FeSO4∙7H2O 0.6mg/L，CuSO4 0.1mg/L，MnSO4∙4H2O 0.5mg/L，H3BO3 0.2mg/L；将以上个成分定量充分溶解在纯净水里即成营养液；
所述的百合壮苗营养液的用法为：百合鳞茎移栽时浇一次，以后每7-10天浇一次，每次用量为50-80ml/株百合。
8.根据权利要求 1所述的香水百合的花药培养脱毒方法，其特征在于：所述步骤（7）中香水百合单倍体植株的剔除在生产上的标准可以简化为：移栽后的香水百合生长到现蕾期时，根据植株高度差异，将群体植株高度后30%的植株剔除。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN108633743A (zh) * 2018-08-22 2018-10-12 江苏强农农业技术服务有限公司 一种美丽百合花药愈伤组织的诱导方法
CN108849527A (zh) * 2018-08-22 2018-11-23 江苏强农农业技术服务有限公司 一种用于美丽百合花药培养的分化培养基及其制备方法和应用
CN112470932A (zh) * 2020-12-14 2021-03-12 连云港市农业科学院 一种利用ems试剂诱变进行耐盐百合新品系选育的方法

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