CN108575761B - 橡胶树胚状体诱导培养基、胚性愈伤组织的诱导方法及抗性愈伤组织的培育方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种橡胶树胚状体诱导培养基、胚性愈伤组织的诱导方法及抗性愈伤组织植株再生的培育方法，属于植物组织培养技术领域。所述橡胶树胚状体诱导培养基，以改良MS培养基为基本培养基，包括Kt、NAA、6‑BA、水杨酸、亚精胺、酸水解酪蛋白、椰子液体胚乳椰子水、活性炭、蔗糖和植物凝胶。本发明提供的胚状体诱导培养基进行橡胶树花药体细胞胚诱导胚性愈伤组织的体细胞胚诱导率相较于花药脱分化愈伤组织的提高2.04～2.16倍。

Description

橡胶树胚状体诱导培养基、胚性愈伤组织的诱导方法及抗性 愈伤组织的培育方法

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种橡胶树胚状体诱导培养基、胚性愈伤组织的诱导方法及抗性愈伤组织的培育方法。

背景技术

巴西橡胶树(Hevea brasiliensis Müll.Arg.)隶属于大戟科(Euphorbiaceae)，橡胶树属(Hevea)，是多年生异花授粉乔木，又称橡胶树，在我国主要分布于海南、云南、广东和广西等省份，是天然橡胶的主要来源。天然橡胶作为一种国家战略资源，在工业发展和国防建设上的作用举足轻重，截止2016年，世界天然橡胶消费量连续7年增长。我国作为天然橡胶的第一大进口国和消费国，供需矛盾日益突出。橡胶树病害是橡胶生产中的一个突出问题，种植高产抗病橡胶树品种是维持橡胶树高产量的一项有效措施，但由于我国橡胶树抗病种质资源匮乏，且传统的育种过程由于受到橡胶树本身属性、生长过程长、育种早期受限等因素的影响，使得采用传统的育种方法进行品种改良十分困难。

随着基因工程和分子育种技术日渐成熟完善，缩短育种周期，拓展橡胶树的遗传范围，培育转基因抗病橡胶树将成为培育抗病橡胶树品种的有效途径。农杆菌转化法因具有操作简单、转化机理清晰、转化费用低、容易整合外源基因且变异率低、整合位点稳定、拷贝数低等特点而被植物遗传转化工作者广泛应用(Song GC,Lee S,Hong J,Choi HK,HongG.H,Bae DW,Ryu CM.Aboveground insect infestation attenuates belowgroundAgrobacterium-mediated genetic transformation.New Phytologist,2015,207(1):148-158.)。一个高效稳定的农杆菌介导的橡胶树遗传转化体系对于橡胶树品种改良和功能基因的研究至关重要(Leclercq et al.，2010)，但一个成功的农杆菌遗传转化体系需要具备较高的感染率和转化植株易于再生两方面的先决条件(李卫，郭光沁，2000)。而为了获得较高的遗传转化率并保证转化材料的再生效率，遗传转化受体的选择和处理非常重要。通过橡胶未受精子房、未受精胚珠、未成熟花药、幼芽等组织相继成功诱导出再生植株，但在橡胶树的遗传转化研究中，不同组织转化率各不相同，总体效率偏低。直至今日，也只有花药和内珠被作为外植体诱导的愈伤组织转化受体材料获得转基因植株的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种橡胶树胚状体诱导培养基、胚性愈伤组织的诱导方法及抗性愈伤组织的培育方法，所述诱导方法诱导率高，且发育形成的植株再生率高。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

橡胶树胚状体诱导培养基，以改良MS培养基为基本培养基，还包括以下含量组分：Kt 0.55～0.65mg/L、NAA0.14～0.16mg/L、6-BA0.04～0.06mg/L、水杨酸0.04～0.06mg/L、亚精胺4.5～5.5mg/L、酸水解酪蛋白290～310mg/L、椰子水体积浓度7～9％、活性炭质量浓度0.09～0.11％、蔗糖55～65g/L和植物凝胶2.2～2.4g/L；

所述改良MS培养基以水为溶剂，包括以下含量组分：硝酸铵825mg/L、硝酸钾950mg/L、二水氯化钙800mg/L、七水硫酸镁370mg/L、磷酸二氢钾340mg/L、碘化钾0.83mg/L、硼酸9mg/L、四水硫酸锰22.3mg/L、七水硫酸锌8.6mg/L、二水钼酸钠0.25mg/L、五水硫酸铜0.025mg/L、六水氯化钴0.025mg/L、乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L、七水硫酸亚铁27.8mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸1mg/L、盐酸硫胺素VB15.0mg/L、盐酸吡哆醇VB61.0mg/L、烟酸1mg/L和生物素VH 0.05mg/L；

所述诱导培养基的pH值为5.7～5.9。

本发明提供了一种基于橡胶树花药体细胞胚诱导胚性愈伤组织的方法，包括如下步骤：

1)选取颜色呈黄绿色，纵径2.81～3.20mm的雄花进行消毒，从消毒后的雄花中剥离花药，得到消毒花药体细胞；

2)将所述步骤1)的消毒花药体细胞接种于初代愈伤组织诱导培养基上，在26～28℃下暗培养44～46d，得到的愈伤组织接种至权利要求1所述的胚状体诱导培养基上，在26～28℃下诱导培养40～50d，得到球形或子叶形体细胞胚；

3)将所述步骤2)的体细胞胚划口后接种至胚性愈伤组织诱导培养基进行脱分化培养，得到胚性愈伤组织。

本发明提供了一种抗性愈伤组织的培育方法，包括如下步骤：

a.将上述方案所述方法制备的胚性愈伤组织接种至无钙增殖培养基上在25～27℃下预培养10～12d，得到预培养的胚性愈伤组织；

b.将GUS、GFP或HbCERK1-3HA的抗性基因采用农杆菌介导法转化到所述步骤a的预培养的胚性愈伤组织中，得到侵染后的胚性愈伤组织；

c.将所述步骤b的侵染后的胚性愈伤组织转接到共培养固体培养基上，在21～23℃下暗培养2.5～3.5d，得到共培养后的胚性愈伤组织；

d.将所述步骤c中共培养后的胚性愈伤组织转接到筛选培养基上进行抗性筛选培养，在25～27℃下暗培养30～40d，得到抗性愈伤组织。

优选的，所述步骤a中无钙增殖培养基以无钙改良MS培养基为基本培养基，还包括以下含量组分：2,4-D 1.0mg/L、6-BA 0.2mg/L、Zt 2mg/L、椰子水体积浓度5％、蔗糖70g/L和植物凝胶2.2g/L；

所述无钙改良MS培养基以水为溶剂，包括以下含量组分：硝酸铵1650mg/L、硝酸钾1900mg/L、七水硫酸镁370mg/L、磷酸二氢钾340mg/L、碘化钾0.83mg/L、硼酸9mg/L、四水硫酸锰22.3mg/L、七水硫酸锌8.6mg/L、二水钼酸钠0.25mg/L、五水硫酸铜0.025mg/L、六水氯化钴0.025mg/L、乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L、七水硫酸亚铁27.8mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸1mg/L、盐酸硫胺素VB15.0mg/L、盐酸吡哆醇VB61.0mg/L、烟酸1mg/L、生物素VH 0.05mg/L；

所述无钙增值培养基的pH值为5.7～5.9。

优选的，所述步骤b中的农杆菌介导法，包括以下步骤：

b1)将含有HbCERK1-3HA、GUS或GFP的重组质粒导入农杆菌中，将得到的重组农杆菌培养、离心和重悬，得到重组农杆菌菌液；

b2)将所述步骤a中的预培养的胚性愈伤组织与所述步骤b1)中的重组农杆菌菌液混合，在27～29℃下侵染20～30min，得到侵染后的胚性愈伤组织。

优选的，所述步骤b1)中的重组农杆菌菌液的OD值为0.6～1.0。

优选的，所述步骤b2)中预培养的胚性愈伤组织的质量与重组农杆菌菌液的体积比为1g：9～11mL。

优选的，所述步骤b2)中侵染时伴随振荡；所述振荡的转速为90～110rpm。

优选的，所述步骤d中抗性筛选培养基以改良MS培养基为基本培养基，还包括以下含量组分：2,4-D 1.0mg/L、6-BA 0.2mg/L、Zt 2mg/L、椰子水体积浓度5％、蔗糖70g/L、植物凝胶2.2g/L、潮霉素40mg/L和羧苄550mg/L；

所述改良MS培养基以水为溶剂，包括以下含量组分：硝酸铵1650mg/L、硝酸钾1900mg/L、二水氯化钙800mg/L、七水硫酸镁370mg/L、磷酸二氢钾340mg/L、碘化钾0.83mg/L、硼酸9mg/L、四水硫酸锰22.3mg/L、七水硫酸锌8.6mg/L、二水钼酸钠0.25mg/L、五水硫酸铜0.025mg/L、六水氯化钴0.025mg/L、乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L、七水硫酸亚铁27.8mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸1mg/L、盐酸硫胺素VB15.0mg/L、盐酸吡哆醇VB61.0mg/L、烟酸1mg/L和生物素VH 0.05mg/L；

所述抗性筛选培养基的pH值为5.7～5.9。

优选的，所述步骤c中共培养固体培养基以改良MS培养基为基本培养基，还包括以下含量组分：椰子水体积浓度5％、蔗糖70g/L、植物凝胶2.0g/L、乙酰丁香酮100μM；

所述改良MS培养基以水为溶剂，包括以下含量组分：硝酸铵1650mg/L、硝酸钾1900mg/L、二水氯化钙800mg/L+七水硫酸镁370mg/L、磷酸二氢钾340mg/L、碘化钾0.83mg/L、硼酸9mg/L、四水硫酸锰22.3mg/L、七水硫酸锌8.6mg/L、二水钼酸钠0.25mg/L、五水硫酸铜0.025mg/L、六水氯化钴0.025mg/L、乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L、七水硫酸亚铁27.8mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸1mg/L、盐酸硫胺素VB15.0mg/L、盐酸吡哆醇VB61.0mg/L、烟酸1mg/L和生物素VH 0.05mg/L；

所述共培养固体培养基的pH值为5.7～5.9。

本发明提供了一种橡胶树胚状体诱导培养基，利用饥饿法，在体细胞胚诱导时，调整硝酸铵至825mg/L、硝酸钾至950mg/L，营造细胞营养饥饿，以促进体细胞胚分化的同步性。本发明中将KH₂PO₄适当提高至340mg/L，旨在胚性细胞形成过程中，促进多肽类物质的体外磷酸化，调节细胞增殖速率；钙离子的增加，对胚性愈伤组织的细胞分离至易碎性以及提高胚性细胞膜抗氧化能力，同时钙是植物生长所必需的大量元素，也是植物细胞中重要第二信使，参与胚性细胞形成过程中的各种代谢反应。硼以硼酸分子(H₃BO₃)的形态被植物吸收利用，硼对植物受精形成胚胎过程有特殊作用，作物缺硼时，花药和花丝萎缩，花粉不能形成，表现出“花而不实”的病症或受精卵形成胚胎受阻。植物体细胞胚在离体培养下没有经过受精过程，但经过了胚胎发育类似过程，在细胞分化成体细胞胚过程中，对硼的需求类似合子胚形成所需。胚性愈伤组织体细胞胚分化时期，细胞生长代谢旺盛，将硼酸调整至9mg/L，利于促进胚性愈伤组织中体细胞胚胎诱导所需的首要内源激素生长素和细胞分裂素、可溶性糖、可溶性蛋白的合成和运输增强、提高呼吸强度，从而有利于胚性愈伤组织中主要内源激素和碳水化合物等形成球形胚或小子叶形体细胞胚必需的基本营养，保证体细胞胚的正常分化。B族维生素(B1硫胺素，B6吡哆醇)主要在电子传递方面起作用，影响植物细胞的分裂，如果缺乏则细胞分裂基本停止。胚性愈伤组织细胞在离体培养过程中，为了再分化必须加入各种激素或附加物，而这些物质多为富含氧化合物，更增加了这些培养细胞的氧化胁迫，从而产生更多的活性氧，造成愈伤组织褐化而丧失分化能力，以致死亡。适当增加B1硫胺素，可在胚性愈伤组织生长和分化中，使组织细胞能维持旺盛的呼吸强度，维持正常代谢。另硫胺素的胺基所带的正电荷可以直接中和DNA负电荷，从而稳定DNA结构，使胚性愈伤组织诱导和体细胞胚发生频率增加，实现植物细胞全能性表达。所述橡胶树胚状体诱导培养基中Kt能促进细胞分裂、调节体细胞胚分化等相关内源激素的协调作用，同时延缓蛋白质降解。NAA促进胚性愈伤组织的形成和内源激素相关激素的协调分配运输。6-BA配合激动素Kt进一步强化、稳定和完善细胞分裂素在胚性愈伤组织的体细胞胚再分化作用。水杨酸促进胚性细胞的分化。亚精胺抑制胚性愈伤组织中蛋白水解酶活性，从而延缓胚性愈伤组织的衰老，以维持胚性细胞的胚性，利于分化体细胞胚状体。酸水解酪蛋白总氮为80％左右，均为水解游离氨基酸，为胚性愈伤组织的分化不断提供有机氮素营养，保证细胞的正常生长和分裂，由于多种氨基酸的复合效应，可利用氨基酸对微量元素的结合能力，增强胚性愈伤组织对培养基中微量元素和其他营养物质的利用率，促进体细胞胚状体的诱导分化。

椰子水可纠正脱水和电解质紊乱，能使胚性细胞安全、活跃地分裂生长，在胚性细胞增殖和分化培养中，有保护胚性愈伤组织抗氧化和给予细胞组织天然、温和的营养供给作用。活性炭对细胞形态发生和器官形成有良好效应，对体细胞胚胎的发生有促进作用，且活性炭能够吸附胚性愈伤组织体胚分化过程中旺盛的代谢产生的有害物质，创造体胚正常发育所需的良好微环境，从而避免形成喇叭形的融合子叶等畸形体胚。

本发明提供了一种基于橡胶树花药体细胞胚诱导胚性愈伤组织的方法，将消毒花药体细胞经初代愈伤组织诱导、胚状体诱导得到体细胞胚，将体细胞胚划口后接种至胚性愈伤组织诱导培养基进行脱分化，得到胚性愈伤组织。在植物中类似动物的干细胞是胚性细胞(embryogenic cell)，包括了合子与早期胚胎细胞、顶端分生组织中的胚性细胞、成熟器官中遗留的胚性细胞等。本发明中，利用橡胶树早期的球形胚和子叶形体细胞胚状体作为再脱分化的外植体，是充分利用胚状体具有很多原胚性细胞的特点，将球形胚或小子叶形体细胞胚划伤后，利用胚状体局部受到创伤刺激后，在伤口表面新生的由原胚性细胞增殖形成的胚性愈伤组织，减少利用常规外植体诱导脱分化非胚性愈伤组织后还需进一步诱导才能形成胚性愈伤组织的环节，有效提高胚性愈伤组织生成效率。

本发明采用花药体细胞胚诱导胚性愈伤组织，体细胞胚分化诱导率高。本发明实施例结果表明，采用本发明提供的方法诱导率相较于花药脱分化愈伤组织体细胞胚诱导率提高2.04～2.16倍，每克愈伤组织诱导的体细胞胚总数和正常子叶胚数分别增加了69.20％～74.4％和1.68～1.71倍，植株再生率也增加了2.7～2.8倍，更适合作为橡胶树遗传转化的受体，可在一定程度上提高遗传转化的效率。

而且，本发明提供了一种抗性愈伤组织的培养方法，通过对胚性愈伤组织在无钙增殖培养基上培养，钙的不足可以改变胚性愈伤组织的细胞壁的结构，这种胚性愈伤组织的细胞壁结构的改变有利于农杆菌更易附着在胚性愈伤组织上，增强了农杆菌对胚性愈伤组织的侵染能力。同时以本发明提供的胚性愈伤组织具有较高的感染率和耐受菌液侵染时间更长(通常橡胶树愈伤组织侵染时间为几分钟，本发明可耐受菌液侵染20～30min)，进一步提高了转化率。

附图说明

图1为不同外植体诱导的脱分化愈伤组织；其中图1-A为花药脱分化愈伤组织；图1-B为花药体细胞胚脱分化愈伤组织；

图2为实施例6中花药体细胞胚状体诱导的胚性愈伤组织及该愈伤组织增殖、分化和再生植株；其中图2-A为花药体细胞胚为外植体诱导的胚性愈伤组织；图2-B为图2-A的胚性愈伤组织的增殖接种情况；图2-C为图2-B的增殖的愈伤组织生长情况；图2-D为图2-C的体细胞胚分化情况，图2-E为图2-D体细胞胚成熟后的植株再生情况；

图3为质粒pCAMBIA-99-1-HbCERK1-3HAT-DNA结构示意图；

图4为PCR检测实施例10的抗性愈伤组织的结果；

图5为PCR检测实施例11的抗性愈伤组织的结果；

图6为PCR检测实施例12的抗性愈伤组织的结果；

图7为PCR检测对比例2的抗性愈伤组织的结果；

图8为采用实施例10的抗性愈伤组织进行分化再生植株的情况；

图9为PCR检测抗性植株的结果；

图10为含有GFP基因的胚性愈伤组织、含有GUS基因的胚性愈伤组织及其分化的体细胞胚状体。

具体实施方式

本发明提供了一种橡胶树胚状体诱导培养基，以改良MS培养基为基本培养基，包括以下含量组分：Kt 0.55～0.65mg/L、NAA 0.14～0.16mg/L、6-BA0.04～0.06mg/L、水杨酸0.04～0.06mg/L、亚精胺4.5～5.5mg/L、酸水解酪蛋白290～310mg/L、椰子水体积浓度为7～9％、活性炭质量浓度为0.09～0.11％、蔗糖55～65g/L和植物凝胶2.2～2.4g/L；

所述改良MS培养基以水为溶剂，包括以下含量组分：硝酸铵825mg/L、硝酸钾950mg/L、二水氯化钙800mg/L、七水硫酸镁370mg/L、磷酸二氢钾340mg/L、碘化钾0.83mg/L、硼酸9mg/L、四水硫酸锰22.3mg/L、七水硫酸锌8.6mg/L、二水钼酸钠0.25mg/L、五水硫酸铜0.025mg/L、六水氯化钴0.025mg/L、乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L、七水硫酸亚铁27.8mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸1mg/L、盐酸硫胺素VB15.0mg/L、盐酸吡哆醇VB61.0mg/L、烟酸1mg/L和生物素VH 0.05mg/L；

所述诱导培养基的pH值为5.7～5.9。

本发明提供的橡胶树胚状体诱导培养基以改良MS培养基为基础培养基。所述改良MS培养基以水为溶剂，包括以下含量组分：硝酸铵825mg/L、硝酸钾950mg/L、二水氯化钙800mg/L、七水硫酸镁370mg/L、磷酸二氢钾340mg/L、碘化钾0.83mg/L、硼酸9mg/L、四水硫酸锰22.3mg/L、七水硫酸锌8.6mg/L、二水钼酸钠0.25mg/L、五水硫酸铜0.025mg/L、六水氯化钴0.025mg/L、乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L、七水硫酸亚铁27.8mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸1mg/L、盐酸硫胺素VB15.0mg/L、盐酸吡哆醇VB61.0mg/L、烟酸1mg/L和生物素VH 0.05mg/L。

本发明中，所述改良MS培养基与传统的MS培养基不同之处在于，将硝酸盐、钾和铵的含量降低一半，将磷酸盐和钙离子含量增加一倍；微量元素中将硼酸含量增加45％；有机成份中，除了甘氨酸含量降低一半，盐酸吡哆醇VB6、烟酸均增加一倍，盐酸硫胺素VB1大幅度增加，另外还额外增加了生物素VH 0.05mg/L。橡胶树愈伤组织通常体细胞胚状体分化程度很低，需要人为地通过矿物质营养、外源激素和生长环境的调整，才能提高其诱导率。橡胶树花药愈伤组织体细胞胚诱导培养普遍存在发育阶段不一致、同步性很小、大小差异较大等，导致体细胞胚成熟不一、再生植株的存活率很低、移栽管理繁琐等问题。利用饥饿法，即降低部分大量元素含量，在体细胞胚诱导时，调整硝酸铵至825mg/L、硝酸钾至950mg/L，营造细胞营养饥饿，以促进体细胞胚分化的同步性。本发明中将KH₂PO₄适当提高至340mg/L，旨在胚性细胞生长和分化过程中，促进多肽类物质的体外磷酸化，调节细胞增殖和分化速率；钙离子的增加，对胚性愈伤组织的细胞分离至易碎性以及提高胚性细胞膜抗氧化能力，同时钙是植物生长所必需的大量元素，也是植物细胞中重要第二信使，参与胚性细胞形成过程中的各种代谢反应。硼以硼酸分子(H₃BO₃)的形态被植物吸收利用，硼对植物受精形成胚胎过程有特殊作用，作物缺硼时，花药和花丝萎缩，花粉不能形成，表现出“花而不实”的病症或受精卵形成胚胎受阻。植物体细胞胚在离体培养下没有经过受精过程，但经过了胚胎发育类似过程，在细胞分化成体细胞胚过程中，对硼的需求类似合子胚形成所需。另缺硼会抑制内源激素的运输，尤其是生长素，以及抑制细胞分裂素的合成和碳水化合物的转化和运输。胚性愈伤组织体细胞胚分化时期，细胞生长代谢旺盛，将硼酸调整至9mg/L，利于促进胚性愈伤组织中体细胞胚胎诱导所需的首要内源激素生长素和细胞分裂素、可溶性糖、可溶性蛋白的合成和运输增强、提高呼吸强度，从而有利于胚性愈伤组织中主要内源激素和碳水化合物等形成球形胚或小子叶形体细胞胚必需的基本营养，保证体细胞胚的正常分化。B族维生素(B1硫胺素，B6吡哆醇)主要在电子传递方面起作用，影响植物细胞的分裂，如果缺乏则细胞分裂基本停止。胚性愈伤组织细胞在离体培养过程中，为了再分化必须加入各种激素或附加物，而这些物质多为富氧化合物，更增加了这些培养细胞的氧化胁迫，从而产生更多的活性氧，造成愈伤组织褐化而丧失分化能力，以致死亡。适当增加B1硫胺素，可在胚性愈伤组织生长和分化中，使组织细胞能维持旺盛的呼吸强度，维持正常代谢。另硫胺素的胺基所带的正电荷可以直接中和DNA负电荷，从而稳定DNA结构，使胚性愈伤组织诱导和体细胞胚发生频率增加，实现植物细胞全能性表达。

本发明提供的橡胶树胚状体诱导培养基包括Kt。所述橡胶树胚状体诱导培养基中Kt的浓度为0.55～0.65mg/L，优选为0.60mg/L。本发明中，所述Kt能促进细胞分裂、调节体细胞胚分化等相关内源激素的协调作用，同时延缓蛋白质降解，因此，利用其作为体细胞胚分化特殊时期(需要高蛋白含量)的促细胞分裂用的外源激素，同时还能够减缓胚性愈伤组织中蛋白质的降解，以维持足够的蛋白质用于胚性细胞有效积累形成胚性愈伤组织及促进其分化。本发明对所述Kt的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品即可。本发明实施例中所述Kt购自sigma公司。

本发明提供的橡胶树胚状体诱导培养基包括NAA。所述橡胶树胚状体诱导培养基中NAA的浓度为0.14～0.16mg/L，优选为0.15mg/L。本发明中，所述NAA能增加细胞内源色氨酸、内源吲哚乙酸(IAA)和内源细胞分裂素玉米素(ZR)等促进细胞生长的内源激素，从而有利于胚性愈伤组织的形成和内源激素相关激素的协调分配运输。本发明对所述NAA的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品即可。本发明实施例中所述NAA购自sigma公司。

本发明提供的橡胶树胚状体诱导培养基包括6-BA。所述橡胶树胚状体诱导培养基中6-BA的浓度为0.04～0.06mg/L，优选为0.05mg/L。本发明中，所述6-BA具有促进细胞分裂、促进非分化组织分化、促进生物体内物质的积累和防止老化等作用，本试验中配合激动素Kt一起使用，进一步强化、稳定和完善细胞分裂素在胚性愈伤组织的体细胞胚再分化作用。本发明对所述6-BA的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品即可。本发明实施例中所述6-BA购自sigma公司。

本发明提供的橡胶树胚状体诱导培养基包括水杨酸。所述橡胶树胚状体诱导培养基中水杨酸的浓度为0.04～0.06mg/L，优选为0.05mg/L。本发明中，所述水杨酸作为一种细胞信号物质，通过细胞信号系统调节与胚胎发生相关基因表达，从而促进胚性细胞的分化。本发明对所述水杨酸的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品即可。本发明实施例中所述水杨酸购自sigma公司。

本发明提供的橡胶树胚状体诱导培养基包括亚精胺。所述橡胶树胚状体诱导培养基中亚精胺的浓度为4.5～5.5mg/L，优选为5mg/L。本发明中，所述亚精胺能够抑制胚性愈伤组织中蛋白水解酶活性，从而延缓胚性愈伤组织的衰老，以维持胚性细胞的胚性，利于分化体细胞胚状体；同时添加适量的亚精胺有助于体细胞胚的发生。本发明对所述亚精胺的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品即可。本发明实施例中所述亚精胺购自sigma公司。

本发明提供的橡胶树胚状体诱导培养基包括酸水解酪蛋白。所述橡胶树胚状体诱导培养基中酸水解酪蛋白的浓度为290～310mg/L，优选为300mg/L。本发明中，所述酸水解酪蛋白，总氮为80％左右，均为水解游离氨基酸，为胚性愈伤组织的分化不断提供有机氮素营养，保证细胞的正常生长和分裂，由于多种氨基酸的复合效应，可利用氨基酸对微量元素的结合能力，增强胚性愈伤组织对培养基中微量元素和其他营养物质的利用率，促进体细胞胚状体的诱导分化。本发明对所述酸水解酪蛋白的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品即可。本发明实施例中所述酸水解酪蛋白购自sigma公司。

本发明提供的橡胶树胚状体诱导培养基包括椰子液体胚乳-椰子水。所述橡胶树胚状体诱导培养基中椰子水的体积浓度为7～9％，优选为8％。本发明中，所述椰子水为取自8～10个月嫩果期的天然椰子水。所述天然椰子水用纱布粗滤后再在超净工作台上经0.22μm过滤灭菌后使用。椰子在8～10个月嫩果期固体胚乳尚未完全形成，大多数的营养成份和活性物质集中在椰子水中，椰子水中含有大量天然营养成份和活性物质，尤其含丰富的氨基酸，锌、钙、铁等多种矿质元素和维生素(尤其是抗氧化物质维生素C和维生素E)，具有丰富的营养成分、抗氧化活性物质、内源生长激素等；其成分与细胞内液相似，可纠正脱水和电解质紊乱，能使胚性细胞安全、活跃地分裂生长，在胚性细胞增殖和分化培养中，有保护胚性愈伤组织抗氧化和给予细胞组织天然、温和的营养供给作用。本发明对所述椰子水的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品即可。本发明实施例中采用香水椰子的椰子水，所述香水椰子购自百果园公司。

本发明提供的橡胶树胚状体诱导培养基包括活性炭。所述橡胶树胚状体诱导培养基中活性炭的质量浓度为0.09％～0.11％，优选为0.10％。本发明中，所述活性炭能够吸附有害物质，降低组织受害至褐化死亡机率；同时还可以吸附发育体胚产生的生长素，创造体胚正常发育所需的低生长素环境，从而避免形成喇叭形的融合子叶的畸形体胚，另外活性炭对细胞形态发生和器官形成也有良好效应。本发明对所述活性炭的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品即可。本发明实施例中所述活性炭购自sigma公司。

本发明提供的橡胶树胚状体诱导培养基包括蔗糖。所述橡胶树胚状体诱导培养基中蔗糖的浓度为55～65g/L，优选为60g/L。蔗糖的用量不仅影响着培养物的生长速度和生长量，还影响其代谢水平、次生代谢物的合成以及细胞的形态和发生；过低的蔗糖浓度，脱分化诱导出愈伤组织会逐渐出现生长停滞现象，而过高浓度的蔗糖会抑制愈伤组织的形成和进一步分化体细胞胚，本体胚诱导培养基中，蔗糖55～65g/L，可作为培养基中的碳源，同时还有效调节培养基内的渗透压，而且还可以作为信号因子影响内源激素ABA等，进而调控体细胞胚的生长与发育。本发明对所述蔗糖的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品即可。本发明实施例中所述蔗糖购自天津市科密欧化学试剂有限公司。

本发明提供的橡胶树胚状体诱导培养基包括植物凝胶。所述橡胶树胚状体诱导培养基中植物凝胶的浓度为2.2～2.4g/L，优选为2.3g/L。本发明中，所述植物凝胶用来凝固培养基。本发明对所述植物凝胶的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品即可。本发明实施例中所述植物凝胶购自sigma公司。

本发明中，所述诱导培养基的pH值为5.7～5.9，优选为5.8。

本发明对所述诱导培养基的制备方法没有特殊限定，采用本领域所熟知的培养基的常规制备方法即可。

本发明提供了一种基于橡胶树花药体细胞胚诱导胚性愈伤组织的方法，包括如下步骤：

1)选取颜色呈黄绿色，长度为2.81～3.20mm的雄花进行消毒，从消毒后的雄花中分离花药，得到消毒花药体细胞；

2)将所述步骤1)的消毒花药体细胞接种于初代愈伤组织诱导培养基上，在26～28℃下暗培养44～46d，得到的愈伤组织转接种至入上述方案所述的胚状体诱导培养基上，在26～28℃下诱导培养40～50d，得到球形或子叶形体细胞胚；

3)将所述步骤2)的体细胞胚划口后接种至胚性愈伤组织诱导培养基进行脱分化培养，得到胚性愈伤组织。

本发明选取颜色呈黄绿色，长度为纵径2.81～3.20mm的雄花进行消毒，从消毒后的雄花进行花药分离，得到消毒花药体细胞。本发明中所述雄花的长度优选为3.0mm。本发明中，所述消毒的方法优选为依次采用体积浓度为75％的酒精和1mg/mL氯化汞溶液对雄花进行消毒，消毒后的雄花用无菌水清洗。用75％的酒精消毒的时间优选为43～47s，更优选为45s。用1mg/mL氯化汞溶液消毒的时间优选为12.5～13.5min，更优选为13min。所述无菌水清洗的次数优选为4～6次，更优选为5次。本发明中，本发明先采用体积浓度为75％的酒精消毒43～47s，既可以杀死材料表面的细菌，又不至于杀伤植物材料细胞，而因为酒精只能杀死细菌，不能杀死芽孢、病毒和真菌类，进而本发明用75％酒精消毒后，再使用1mg/mL氯化汞溶液进行雄花表面消毒，利用Hg²⁺可以与带负电荷的蛋白质结合，使蛋白质变性，从而杀死菌体。

得到消毒后的花药后，本发明将所述消毒后的花药接种于初代愈伤组织诱导培养基上，在26～28℃下暗培养44～46d，得到的愈伤组织转入上述方案所述的胚状体诱导培养基上，在26～28℃下诱导40～50d，得到体细胞胚。本发明中，所述初代愈伤组织诱导培养基以MS培养基为基本培养基，优选包括2,4-D 1.0mg/L、6-BA 0.2mg/L、椰子水体积浓度5％、蔗糖70g/L和植物凝胶2.2g/L，所述初代愈伤组织诱导培养基的pH值为5.8。所述初代愈伤组织诱导培养基的制备方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的培养基配制方案即可。本发明对所述接种的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的接种方法即可。所述接种量优选为0.1～0.2g/丛。本发明中，得到的体细胞胚呈球形或子叶形，纵径大小为1～1.2mm。

本发明中，所述暗培养的培养温度优选为27℃。所述暗培养的培养时间优选为45d。

本发明中，所述愈伤组织在胚状体诱导培养基上诱导的温度优选为27℃。所述在胚状体诱导培养基上诱导的时间优选为48d。本发明中，所述在胚状体诱导培养基上诱导时期，愈伤组织在前20d增殖速度很快，20d后逐呈浅黄色致密颗粒状,其表面有一层带光泽的粘质表皮,能陆续分化形成大小不一的白色略带透明的球状结构。之后，在相同培养基上可同时观察到包括以球形为主、心形及子叶形在内的一系列不同发育阶段的体细胞胚胎，同时伴随胚性愈伤组织的适量增殖。

得到球形或子叶形体细胞胚后，本发明将所述体细胞胚划口接种至胚性愈伤组织诱导培养基进行脱分化培养，得到胚性愈伤组织。本发明中，所述划口的方式为“一”字或“X”形。本发明中，所述胚性愈伤组织诱导培养基以MS培养基为基本培养基，包括以下含量组分：2,4-D 1.0mg/L、6-BA 0.2mg/L、Zt 2mg/L、椰子水体积浓度为5％、蔗糖70g/L和植物凝胶2.2g/L，所述培养基的pH值为5.8。所述胚性愈伤组织诱导培养基的制备方法没有特殊限定，采用本领域技术人员所熟知的培养基配制方案即可。本发明中，所述脱分化培养的温度优选为23～27℃，更优选为25℃。所述脱分化培养的时间优选为20～30d，更优选为28d。

本发明提供了一种抗性愈伤组织的培育方法，包括如下步骤：

a.将上述方案所述方法制备的胚性愈伤组织接种至无钙增殖培养基上在25～27℃下预培养10～12d，得到预培养的胚性愈伤组织；

b.将GFP、GUS或HbCERK1-3HA的抗性基因采用农杆菌介导法转化到所述步骤a的预培养的胚性愈伤组织中，得到侵染后的胚性愈伤组织；

c.将所述步骤b的侵染后的胚性愈伤组织转接到共培养固体培养基上，在21～23℃下暗培养2.5～3.5d，得到共培养后的胚性愈伤组织；

d.将所述步骤c中共培养后的胚性愈伤组织转接到抗性筛选培养基上进行筛选培养，在25～27℃下暗培养30～40d，得到抗性愈伤组织。

本发明将上述方案所述方法制备的胚性愈伤组织接种至无钙增殖培养基上在25～27℃下预培养10～12d，得到预培养的胚性愈伤组织。本发明中，所述无钙增殖培养基优选为以无钙改良MS培养基为基本培养基，还包括以下含量组分：2,4-D 1.0mg/L、6-BA0.2mg/L、Zt 2mg/L、椰子水体积浓度5％、蔗糖70g/L和植物凝2.2g/L。本发明中，所述无钙改良MS培养基的成分除不含有二水氯化钙外，其他成分与上述改良MS培养基完全相同。本发明中，所述无钙增值培养基的pH值优选为5.7～5.9，更优选为5.8。所述预培养的温度优选为26℃。所述预培养的时间优选为11d。本发明中，通过对胚性愈伤组织在无钙培养基上培养，钙的不足可以改变胚性愈伤组织的细胞壁的结构，这种胚性愈伤组织的细胞壁结构的改变有利于农杆菌更易附着在愈伤组织上，增强了农杆菌对愈伤组织的侵染能力。

本发明将含有GUS、GFP或HbCERK1-3HA的抗性基因采用农杆菌介导法转入预培养的胚性愈伤组织中，得到侵染后的胚性愈伤组织。

本发明中，所述农杆菌介导法优选包括以下步骤：b1)将含有GUS、GFP或HbCERK1-3HA的重组质粒导入农杆菌中，将得到的重组农杆菌培养、离心和重悬，得到重组农杆菌菌液；b2)将所述步骤a中的预培养的胚性愈伤组织与所述步骤b1)中的重组农杆菌菌液混合，在27～29℃下侵染20～30min，得到侵染后的胚性愈伤组织。

本发明中，所述重组质粒优选为pCAMBIA-99-1-HbCERK1-3HA。所述重组质粒的制备方法优选为：植物表达载体(pCAMBIA 99-1-HbCERK1-3HA)的构建：HbCERK1全长片段测序正确后，取HbCERK1片段30μL，加入10×Cutsmart Buffer(NEB)5μL，再加入Sac II和SpeI酶各1μL，补ddH₂O至50μL，混匀后置于37℃酶切6h，经PCR产物纯化回收试剂盒回收酶切完的HbCERK1-3HA片段。取pCAMBIA 99-1-3HA空载30μL，按同样的方式进行酶切，通过琼脂糖凝胶电泳回收载体。然后将HbCERK1-3HA片段和pCAMBIA载体按照3:1比例4℃连接过夜。第二天将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，菌落PCR鉴定后，摇菌小提质粒，经SacII和SpeI双酶切鉴定正确后保存菌种备用。

本发明对所述农杆菌的菌株类型没有特殊限定，采用本领域常规农杆菌菌株即可。本发明实施例中采用的农杆菌菌株GV3101购自上海泽叶生物科技有限公司。本发明对所述GUS、GFP或HbCERK1-3HA导入农杆菌的方法没有特殊限定，采用本领域常规方法导入，获得含有GUS、GFP或HbCERK1-3HA的重组农杆菌。

本发明中，所述重组农杆菌培养的方法优选为将重组农杆菌接种于含有50mg/L氯霉素和50mg/L利福平的培养基中倒置培养2d，将得到的重组农杆菌单菌落接种于LB液体培养基中振荡培养8～12h。本发明中，所述倒置培养的温度优选为27～30℃，更优选为28℃。所述振荡培养的转速优选为190～210rpm，更优选为200rpm。所述振荡培养的时间优选为10h。

本发明中，所述离心的转速优选为3900～4100rpm，更优选为4000rpm。所述离心的时间优选为9～11min，更优选为10min。所述离心的温度为常温。

本发明中，所述重悬方式优选为挑取单菌落于含氯霉素和利福平各50mg/L的7.5mL LB液体培养基中以200rpm，28℃振荡培养8～12h。再以1：50比例将菌液吸入到新鲜LB液体培养基中，并于相同条件下振荡培养6～8小时至OD₆₀₀≈0.6～1.0。培养完毕后，无菌条件下取新鲜菌液置以50mL离心管中，于高速离心机下常温，4000rpm，离心10min后，去除上清，收集菌体。之后以同体积未添加激素的改良MS悬浮液体培养基悬浮菌体，置于无菌锥形瓶中用于侵染转化。

所述改良MS悬浮液体培养基，以改良MS培养基为基本培养基，包括以下含量组分：椰子水体积浓度5％、蔗糖70g/L、乙酰丁香酮100μM；

所述改良MS培养基以水为溶剂，包括以下含量组分：硝酸铵1650mg/L、硝酸钾1900mg/L、二水氯化钙800mg/L、七水硫酸镁370mg/L、磷酸二氢钾340mg/L、碘化钾0.83mg/L、硼酸9mg/L、四水硫酸锰22.3mg/L、七水硫酸锌8.6mg/L、二水钼酸钠0.25mg/L、五水硫酸铜0.025mg/L、六水氯化钴0.025mg/L、乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L、七水硫酸亚铁27.8mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸1mg/L、盐酸硫胺素VB15.0mg/L、盐酸吡哆醇VB61.0mg/L、烟酸1mg/L和生物素VH 0.05mg/L；

所述改良MS悬浮液体培养基的pH值为5.7～5.9。

得到预培养的胚性愈伤组织和重组农杆菌菌液后，本发明将所述预培养的胚性愈伤组织和重组农杆菌菌液在27～29℃下混合，侵染20～30min，得到侵染后的胚性愈伤组织。

本发明中，所述预培养的胚性愈伤组织的质量和重组农杆菌菌液的体积比优选为1g：9～11mL，更优选为1g：10mL。所述重组农杆菌菌液的OD值优选为0.6～1.0，更优选为0.8。所述侵染时伴随振荡。所述振荡的转速优选为90～110rpm，更优选为100rpm。

得到侵染后的胚性愈伤组织后，本发明将所述侵染后的胚性愈伤组织转接到共培养固体培养基上，在21～23℃下暗培养2.5～3.5d，得到共培养后的胚性愈伤组织。本发明中，所述共培养固体培养基以改良MS培养基为基本培养基，还包括以下含量组分：椰子水体积浓度5％、蔗糖70g/L、植物凝胶2.0g/L、乙酰丁香酮(AS)100μM。所述共培养固体培养基的pH值优选为5.7～5.9，更优选为5.8。所述暗培养的培养温度优选为22℃。所述暗培养的培养时间优选为3d。

得到共培养后的胚性愈伤组织后，本发明将所述共培养后的胚性愈伤组织转接到抗性筛选培养基上进行筛选培养，在25～27℃暗培养条件下暗培养30～40d，得到抗性愈伤组织。本发明中，所述暗培养的温度优选为26℃。所述暗培养的时间优选为20～50d，更优选为40d。本发明中，所述筛选培养基以改良MS培养基为基本培养基，还包括以下含量组分：2,4-D 1.0mg/L、6-BA0.2mg/L、Zt 2mg/L、椰子水体积浓度5％、蔗糖70g/L、植物凝胶2.2g/L、潮霉素40mg/L和羧苄550mg/L。由于pCAMBIA-99-1-HbCERK1-3HA含有抗潮霉素抗性基因，能够抵抗潮霉素，所以经转化的愈伤组织在含有一定浓度的潮霉素的筛选培养基上能存活；而由于非转化愈伤组织不含有潮霉素抗性基因，所以无法抵抗潮霉素，导致其在含有一定浓度潮霉素的筛选培养基上死亡，从而有效筛选出抗性愈伤组织。

本发明得到的抗性愈伤组织在筛选培养基上进行筛选培养10d后，侵染愈伤组织表面呈现黑褐色，30d后抗性愈伤组织从组织块边缘长出，一开始呈黄白色小凸点，随着抗性细胞的增殖，呈现出鲜黄色的易碎性愈伤组织，部分与黑褐色侵染组织连接在一起，部分松散在侵染组织周围。诱导形成的抗性愈伤组织，通过继代20d即可用于PCR检测和体细胞胚分化。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

胚状体诱导培养基：以改良MS培养基为基本培养基，包括：Kt 0.55mg/L、NAA0.16mg/L、6-BA0.04mg/L、水杨酸0.06mg/L、亚精胺4.5mg/L、酸水解酪蛋白310mg/L、椰子水体积浓度为7％、活性炭质量浓度为0.11％、蔗糖55g/L和植物凝胶2.4g/L；所述诱导培养基的pH值为5.7。

实施例2

材料为巴西橡胶树(Hevea brasiliensis Müll.Arg.)品种热研7-33-97，橡胶花序采自中国热带农业科学院实验农场。选取呈黄绿色，长度为2.81mm的雄花，先用75％的酒精消毒43s，再用1mg/mL氯化汞溶液消毒13.5min后，用无菌水清洗4次，得到消毒后的花药。将消毒后的花药接种于初代愈伤组织诱导培养基上(初代愈伤组织诱导培养基以MS培养基为基本培养基，包括2,4-D 1.0mg/L、6-BA0.2mg/L、椰子水体积浓度5％、蔗糖70g/L和植物凝胶2.2g/L，pH值为5.8)，在26℃下暗培养46d，得到的愈伤组织转入实施例1的胚状体诱导培养基上，在26℃下诱导50d，得到大小在1～1.2mm的体细胞胚。

将得到的体细胞胚划“一”或“X”形伤口，接种至胚性愈伤组织诱导培养基)(胚性愈伤组织诱导培养基以MS培养基为基本培养基，包括：2,4-D1.0mg/L、6-BA 0.2mg/L、Zt2mg/L、椰子水体积浓度为5％、蔗糖70g/L和植物凝胶2.2g/L，pH值为5.8)在23℃下培养30d进行脱分化培养，得到胚性愈伤组织。

实施例3

胚状体诱导培养基：以改良MS培养基为基本培养基，包括：Kt 0.65mg/L、NAA0.14mg/L、6-BA0.06mg/L、水杨酸0.04mg/L、亚精胺5.5mg/L、酸水解酪蛋白290mg/L、椰子水体积浓度为9％、活性炭质量浓度为0.09％、蔗糖65g/L和植物凝胶2.2g/L；所述诱导培养基的pH值为5.9。

实施例4

材料为巴西橡胶树(Hevea brasiliensis Müll.Arg.)品种热研7-33-97，橡胶花序采自中国热带农业科学院实验农场。选取呈黄绿色，长度为3.20mm的雄花，先用75％的酒精消毒47s，再用1mg/mL氯化汞溶液消毒12.5min后，用无菌水清洗6次，得到消毒后的花药。

将消毒后的花药接种于初代愈伤组织诱导培养基上(初代愈伤组织诱导培养基以MS培养基为基本培养基，包括2,4-D 1.0mg/L、6-BA 0.2mg/L、椰子水体积浓度5％、蔗糖70g/L和植物凝胶2.2g/L，pH值为5.8)，在28℃下暗培养44d，得到的愈伤组织转入实施例3的胚状体诱导培养基上在28℃下诱导40d，得到大小为1～1.2mm，呈球形或小子叶形的体细胞胚。

将得到的体细胞胚划“一”或“X”形伤口，接种至胚性愈伤组织诱导培养基(胚性愈伤组织诱导培养基以MS培养基为基本培养基，包括：2,4-D1.0mg/L、6-BA0.2mg/L、Zt 2mg/L、椰子水体积浓度为5％、蔗糖70g/L和植物凝胶2.2g/L，pH值为5.8)在27℃下培养20d进行脱分化培养，得到胚性愈伤组织。

实施例5

胚状体诱导培养基：以改良MS培养基为基本培养基，包括：Kt 0.60mg/L、NAA0.15mg/L、6-BA 0.05mg/L、水杨酸0.05mg/L、亚精胺5.0mg/L、酸水解酪蛋白300mg/L、椰子水体积浓度为8％、活性炭质量浓度为0.10％、蔗糖60g/L和植物凝胶2.3g/L；所述诱导培养基的pH值为5.8。

实施例6

材料为巴西橡胶树(Hevea brasiliensis Müll.Arg.)品种热研7-33-97，橡胶花序采自中国热带农业科学院实验农场。选取呈黄绿色，长度为3.00mm的雄花，先用75％的酒精消毒45s，再用1mg/mL氯化汞溶液消毒13min后，用无菌水清洗5次，得到消毒后的花药。

将消毒后的花药接种于初代愈伤组织诱导培养基上(初代愈伤组织诱导培养基以MS培养基为基本培养基，包括2,4-D 1.0mg/L、6-BA 0.2mg/L、椰子水体积浓度5％、蔗糖70g/L和植物凝胶2.2g/L，pH值为5.8)，在27℃下暗培养45d，得到的愈伤组织转入实施例5的胚状体诱导培养基上，在27℃下诱导45d，得到大小为1～1.2mm，呈球形或小子叶形的体细胞胚。

将得到的体细胞胚划“一”或“X”形伤口，接种至胚性愈伤组织诱导培养基(胚性愈伤组织诱导培养基以MS培养基为基本培养基，包括：2,4-D1.0mg/L、6-BA0.2mg/L、Zt 2mg/L、椰子水体积浓度为5％、蔗糖70g/L和植物凝胶2.2g/L，pH值为5.8)在25℃下培养28d进行脱分化培养，得到胚性愈伤组织。

对比例1

采用实施例6制备的花药采用谭德冠等人(谭德冠,汪萌和孙雪飘等.橡胶树品种热研7-33-97花药愈伤组织形态发生和组织学研究.热带作物学报,2009,30(7):970-974.)提供的方法进行常规脱分化诱导愈伤组织。

材料为巴西橡胶树(Hevea brasiliensis Müll.Arg.)品种热研7-33-97，橡胶花序采自中国热带农业科学院实验农场。用浓度为0.2％的上海硫磺皂水浸没花序10min，流水冲洗干净。用灭菌小剪刀剪取未开、健康的橡胶树雄花蕾，用灭菌纱布包好，在超净工作台内，以灭过菌的烧杯为容器，先用70～75％酒精表面消毒40s，再用1mg/mL HgCl₂浸泡消毒12min，再用无菌水冲洗6次，然后在解剖镜下去除花萼，以单体雄芯为接种单位的接种方式，接种到花药愈伤组织脱分化诱导培养基上(花药脱分化愈伤组织诱导以改良MS培养基为基本培养基，包括以下含量组分：2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)1.0mg/L、激动素(Kt)1.0mg/L、萘乙酸(NAA)0.5mg/L、椰子水体积浓度5％、蔗糖90g/L和琼脂粉6.0g/L，pH5.8，)，在26℃条件下培养45d。

实施例7

以实施例2、4和6作为实验组，以对比例1及花药脱分化作为对照，将制备得到的胚性愈伤组织进行比较，具体结果如表1和附图1所示。

由附图1可以看出，花药体细胞胚脱分化诱导的胚性愈伤组织(如图1-B)长得松脆、形状规则呈小圆粒、鲜黄略带透明；而花药脱分化诱导的愈伤组织(图1-A)形状不规则、组织相对大块，质地紧密。

表1不同方法制备得到的脱分化愈伤组织的分化情况比较

注：表中数据为10个数值的平均值，3次重复。同列数据后不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

由表1可以看出，采用本发明提供的方法诱导率相较于花药脱分化愈伤组织体细胞胚诱导率提高2.04～2.16倍，每克愈伤组织诱导的体细胞胚总数和正常子叶胚数分别增加了69.20％～74.4％和1.68～1.71倍。

实施例8

将实施例6制备的胚性愈伤组织进行诱导、增殖、分化和植株再生，观察花药体细胞胚性愈伤组织的诱导、增殖、分化和再生植株，具体结果如附图2所示。由附图2可以看出，本发明采用花药体细胞能够诱导出胚性愈伤组织，且能够有效地进行增殖、分化和植株再生。

实施例9

农杆菌菌株GV3101，内含质粒pCAMBIA-99-1-HbCERK1-3HA，质粒如图3所示，由海南省热带生物资源可持续利用重点实验室(省部共建国家重点实验室培育基地)采用本领域常规方法构建和保存。将农杆菌菌株GV3101划线于含有50mg/L氯霉素和50mg/L利福平的培养基中在28℃下倒置培养2d后，挑取单菌落接种于含50mg/L氯霉素和50mg/L利福平的LB培养基中，200rpm，28℃振荡培养10h。再以1：50比例将菌液吸入到新鲜LB液体培养基中，并于相同条件下振荡培养6～8小时至OD₆₀₀≈0.6～1.0。培养完毕后，无菌条件下取新鲜菌液置以50mL离心管中，于高速离心机下，常温，4000rpm，离心10min后，去除上清，收集菌体。以同体积改良MS悬浮液体培养基悬浮菌体(所述改良MS悬浮液体培养基，以改良MS培养基为基本培养基，包括以下含量组分：椰子水体积浓度5％、蔗糖70g/L、乙酰丁香酮100μM；所述改良MS培养基以水为溶剂，包括以下含量组分：硝酸铵1650mg/L、硝酸钾1900mg/L、二水氯化钙800mg/L、七水硫酸镁370mg/L、磷酸二氢钾340mg/L、碘化钾0.83mg/L、硼酸9mg/L、四水硫酸锰22.3mg/L、七水硫酸锌8.6mg/L、二水钼酸钠0.25mg/L、五水硫酸铜0.025mg/L、六水氯化钴0.025mg/L、乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L、七水硫酸亚铁27.8mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸1mg/L、盐酸硫胺素VB15.0mg/L、盐酸吡哆醇VB61.0mg/L、烟酸1mg/L和生物素VH0.05mg/L；所述改良MS悬浮液体培养基的pH值为5.8)，得到重组农杆菌菌液，备用侵染。

实施例10

以0.2g/丛，将实施例6制备的胚性愈伤组织接种至无钙增殖培养基上(无钙培养基以改良MS培养基为基本培养基，还包括2,4-D 1.0mg/L、6-BA0.2mg/L、Zt 2mg/L、椰子水体积浓度5％、蔗糖70g/L和植物凝胶2.2g/L，pH值为5.7)在25℃下预培养12d，得到预培养的胚性愈伤组织。称取5g预培养的胚性愈伤组织与45mL实施例9制备的农杆菌菌液(OD值为1.0)混合在29℃下侵染20min(侵染时以90rpm的转速进行振荡)，得到侵染后的胚性愈伤组织。将得到的侵染后的胚性愈伤组织转接到共培养固体培养基上(共培养固体培养基以改良MS培养基为基本培养基，还包括椰子胚乳椰子5％、蔗糖70g/L、植物凝胶2.0g/L和，乙酰丁香酮100μM，pH值为5.9)，在21℃下暗培养3.5d，得到共培养后的胚性愈伤组织。将得到的共培养后的胚性愈伤组织转接到抗性筛选培养基(抗性筛选培养基以改良MS培养基为基本培养基，还包括2,4-D 1.0mg/L、6-BA 0.2mg/L、Zt 2mg/L、椰子液体胚乳椰子水5％、蔗糖70g/L、植物凝胶2.2g/L、潮霉素40mg/L和羧苄550mg/L，pH值为5.7)上进行筛选培养，在25℃暗培养2个月，得到抗性愈伤组织。

统计抗性愈伤组织的丛数和转化频率。转化频率(％)＝(长出抗性愈伤组织的丛数/接种胚性愈伤组织的总丛数)×100％。2个月后统计抗性愈伤组织的丛数为12丛。同时计算转化频率为5.1％。

抗性愈伤组织的检测方法：采用PCR法检测，使用HbCERK1-3HA基因的特异引物

HbCERK1-3HA-SQ-F：5'-ATTGTGCAAGGTCCACCATA-3'(SEQ ID No.1)

HbCERK1-3HA-SQ-R：5'-CAAGAGTTGCTTCCCACTCA-3'(SEQ ID No.2)

PCR程序为，95℃，2min；95℃，20sec，52℃，20sec，72℃，1min，30个循环；72℃，5min；16℃，保存。具体检测结果如附图4所示，由附图4可知，抗性愈伤系1～9、11和12均扩出与阳性对照一致的目标带，初步说明目的基因已整合到橡胶树基因组中，而抗性愈伤系10没有检测出相应条带，说明筛选培养得到的愈伤组织可能属于假阳性，有待采用PCR法进一步检测。

实施例11

以0.1g/丛，将实施例6制备的胚性愈伤组织接种至无钙增殖培养基上(无钙培养基以改良MS培养基为基本培养基，还包括2,4-D 1.0mg/L、6-BA0.2mg/L、Zt 2mg/L、椰子水体积浓度5％、蔗糖70g/L和植物凝胶2.2g/L，pH值为5.9)在27℃下预培养10d，得到预培养的胚性愈伤组织。称取5g预培养的胚性愈伤组织与55mL实施例9制备的农杆菌菌液(OD值为0.6)混合在27℃下侵染30min(侵染时以110rpm的转速进行振荡)，得到侵染后的胚性愈伤组织。将得到的侵染后的胚性愈伤组织转接到共培养固体培养基上(共培养固体培养基以改良MS培养基为基本培养基，还包括椰子胚乳椰子水5％、蔗糖70g/L、植物凝胶2.0g/L和，乙酰丁香酮100μM，pH值为5.7)，在23℃下暗培养2.5d，得到共培养后的胚性愈伤组织。将得到的共培养后的胚性愈伤组织转接到筛选培养基(抗性筛选培养基以改良MS培养基为基本培养基，还包括2,4-D 1.0mg/L、6-BA 0.2mg/L、Zt 2mg/L、椰子胚乳椰子水5％、蔗糖70g/L、植物凝胶2.2g/L、潮霉素40mg/L和羧苄550mg/L，pH值为5.9)上进行筛选培养，在27℃暗培养2个月。

2个月后统计抗性愈伤组织的丛数为5丛。同时计算转化频率为4.8％。

抗性愈伤组织的检测方法及转化频率的计算方法同实施例10。具体检测结果如附图5所示，由附图5可知，抗性愈伤系1～3均扩出与阳性对照一致的目标带，初步说明目的基因已整合到橡胶树基因组中，而抗性愈伤系4和5没有检测出相应条带，说明筛选培养得到的愈伤组织可能属于假阳性，有待进一步检测。

实施例12

以0.1g/丛，将实施例6制备的胚性愈伤组织接种至无钙增殖培养基上(无钙培养基以改良MS培养基为基本培养基，还包括2,4-D 1.0mg/L、6-BA0.2mg/L、Zt 2mg/L、椰子水体积浓度5％、蔗糖70g/L和植物凝胶2.2g/L，pH值为5.8)在26℃下预培养11d，得到预培养的胚性愈伤组织。称取5g预培养的胚性愈伤组织与50mL实施例9制备的农杆菌菌液(OD值为0.8)混合在28℃下侵染25min(侵染时以100rpm的转速进行振荡)，得到侵染后的胚性愈伤组织。将得到的侵染后的胚性愈伤组织转接到共培养固体培养基上(共培养固体培养基以改良MS培养基为基本培养基，还包括椰子液体胚乳椰子水5％、蔗糖70g/L、植物凝胶2.0g/L和乙酰丁香酮100μM，pH值为5.8)，在22℃下暗培养3d，得到共培养后的胚性愈伤组织。将得到的共培养后的胚性愈伤组织转接到筛选培养基上进行筛选培养(抗性筛选培养基以改良MS培养基为基本培养基，还包括2,4-D 1.0mg/L、6-BA 0.2mg/L、Zt 2mg/L、椰子液体胚乳椰子水5％、蔗糖70g/L、植物凝胶2.2g/L和，潮霉素40mg/L，羧苄550mg/L，pH值为5.8)，在26℃暗培养，2个月后统计抗性愈伤组织的丛数为4丛。同时计算转化频率为5.4％。

抗性愈伤组织的检测方法及转化频率的计算方法同实施例10。具体检测结果如附图6所示，由附图6可知，抗性愈伤系A、B、C和D均扩出与阳性对照一致的目标带，初步说明目的基因已整合到橡胶树基因组中。

对比例2

以0.1g/丛对比例1制备的胚性愈伤组织接种至无钙增殖培养基上(无钙培养基以改良MS培养基为基本培养基，还包括2,4-D 1.0mg/L、6-BA 0.2mg/L、Zt 2mg/L、椰子液体胚乳椰子水体积浓度5％、蔗糖70g/L和植物凝胶2.2g/L，pH值为5.8)在26℃下预培养11d，得到预培养的愈伤组织。称取5g预培养的胚性愈伤组织与50mL实施例9制备的农杆菌菌液(OD值为0.8)混合在28℃下侵染25min(侵染时以100rpm的转速进行振荡)，得到侵染后的愈伤组织。将得到的侵染后的愈伤组织转接到共培养固体培养基上(共培养固体培养基以改良MS培养基为基本培养基，还包括椰子液体胚乳椰子水5％、蔗糖70g/L、植物凝胶2.0g/L和乙酰丁香酮100μM，pH值为5.8))，在22℃下暗培养3d，得到共培养后的愈伤组织。将得到的共培养后的愈伤组织转接到筛选培养基上进行筛选培养，在26℃暗培养，2个月后统计抗性愈伤组织的丛数为5丛。同时计算转化频率为1.2％。

抗性愈伤组织的检测方法及转化频率的计算方法同实施例11。具体检测结果如附图7所示，由附图7可知，抗性愈伤系A和B与阳性对照一致的目标带，初步说明目的基因已整合到橡胶树基因组中，而抗性愈伤系C、D和E没有检测出相应条带，说明筛选培养得到的愈伤组织可能属于假阳性，有待进一步检测。

由实施例10～12及对比例2可以得出，采用本发明提供的花药体细胞胚诱导的胚性愈伤组织培育抗性愈伤组织，转化频率达到4.8～5.4％，采用花药进行常规脱分化诱导的愈伤组织培育抗性愈伤组织的转化频率为1.2％。本发明相较于采用花药进行常规脱分化诱导的愈伤组织培育抗性愈伤组织的转化频率提高3倍以上。

实施例13

将实施例10得到的抗性愈伤组织转化到分化筛选培养基上进行体细胞分化诱导培养，50d后分化出体细胞胚，筛选正常的子叶形体细胞胚继续诱导培养形成再生植株，具体结果如附图8所示。由附图8可知，采用本发明提供的方法诱导的抗性愈伤组织能够成功转化橡胶树HbCERK1-3HA基因，转化愈伤组织能够增殖且分化出转化植株。同时采用PCR法对抗性植株进行检测。具体结果如附图9所示。由附图9可知，抗性植株1～5均检测出目的条带，说明目的基因成功转化橡胶植株。

实施例14

除农杆菌菌株GV3101内含质粒分别为GUS或GFP外，其他操作条件与实施例9完全相同，制备重组农杆菌菌液。

将重组农杆菌菌液分别侵染实施例6制备的胚性愈伤组织。具体结果如图10所示。其中图10中D为抗性愈伤的GFP基因荧光检测；E和F分别为抗性愈伤和转化GUS体细胞胚状体的GUS染色。

由图10可以看出，利用体视显微镜观测转化GFP基因的胚性愈伤组织，在明场(Bright field)下，对照(Control，未转化GFP基因)和转化GFP基因胚性愈伤组织无显著显光差异，但在荧光视野下，转入GFP基因的胚愈伤组织可看到荧光均匀分布于愈伤组织块，而对照(Control，未转化GFP基因)胚性愈伤组织未见有荧光显示，表明GFP基因已成功导入橡胶树胚性愈伤组织，愈伤组织转化率4.1％，进而再次验证了体细胞胚诱导并看护哺育增殖的胚性愈伤组织适合作为遗传转化受体且该体系优化效果良好。以GUS基因转化橡胶树花药体胚诱导和看护哺育培养的胚性愈伤组织，待筛选、增殖抗性愈伤组织后，进行抗性愈伤GUS组织化学法检测，已转化GUS基因胚性愈伤组织与胚状体皆显示为蓝色，表明GUS已成功导入橡胶树的胚性愈伤组织，且成功分化出子叶形体细胞胚，说明经体细胞胚划伤诱导和看护哺育增殖的胚性愈伤组织适合作为遗传转化受体且遗传转化体系优化效果良好。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 海南大学

<120> 橡胶树胚状体诱导培养基、胚性愈伤组织的诱导方法及抗性愈伤组织的培育方法

<130> GW2018I0230

<141> 2018-06-06

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 1

attgtgcaag gtccaccata 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 2

caagagttgc ttcccactca 20

Claims (7)

1.橡胶树胚状体诱导培养基，其特征在于，以改良MS培养基为基本培养基，并添加以下含量组分：Kt 0.55～0.65mg/L、NAA 0.14～0.16mg/L、6-BA 0.04～0.06mg/L、水杨酸0.04～0.06mg/L、亚精胺4.5～5.5mg/L、酸水解酪蛋白290～310mg/L、椰子水体积浓度7～9％、活性炭质量浓度0.09～0.11％、蔗糖55～65g/L和植物凝胶2.2～2.4g/L；

所述改良MS培养基以水为溶剂，并添加以下含量组分：硝酸铵825mg/L、硝酸钾950mg/L、二水氯化钙800mg/L、七水硫酸镁370mg/L、磷酸二氢钾340mg/L、碘化钾0.83mg/L、硼酸9mg/L、四水硫酸锰22.3mg/L、七水硫酸锌8.6mg/L、二水钼酸钠0.25mg/L、五水硫酸铜0.025mg/L、六水氯化钴0.025mg/L、乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L、七水硫酸亚铁27.8mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸1mg/L、盐酸硫胺素VB1 5.0mg/L、盐酸吡哆醇VB6 1.0mg/L、烟酸1mg/L和生物素VH 0.05mg/L；

所述诱导培养基的pH值为5.7～5.9。

2.一种基于橡胶树花药体细胞胚诱导胚性愈伤组织的方法，包括如下步骤：

1)选取颜色呈黄绿色，纵径2.81～3.20mm的雄花进行消毒，从消毒后的雄花中剥离花药，得到消毒花药体细胞；

2)将所述步骤1)的消毒花药体细胞接种于初代愈伤组织诱导培养基上，在26～28℃下暗培养44～46d，得到的愈伤组织接种至权利要求1所述的胚状体诱导培养基上，在26～28℃下诱导培养40～50d，得到球形或子叶形体细胞胚；

3)将所述步骤2)的体细胞胚划口后接种至胚性愈伤组织诱导培养基进行脱分化培养，得到胚性愈伤组织；

所述初代愈伤组织诱导培养基以MS培养基为基本培养基，包括2,4-D 1.0mg/L、6-BA0.2mg/L、椰子水体积浓度5％、蔗糖70g/L和植物凝胶2.2g/L；

所述胚性愈伤组织诱导培养基以MS培养基为基本培养基，包括以下含量组分：2,4-D1.0mg/L、6-BA 0.2mg/L、Zt 2mg/L、椰子水体积浓度为5％、蔗糖70g/L和植物凝胶2.2g/L。

3.一种抗性愈伤组织的培育方法，包括如下步骤：

a.将权利要求2所述方法制备的胚性愈伤组织接种至无钙增殖培养基上在25～27℃下预培养10～12d，得到预培养的胚性愈伤组织；

b.将GUS、GFP或HbCERK1-3HA的抗性基因采用农杆菌介导法转化到所述步骤a的预培养的胚性愈伤组织中，得到侵染后的胚性愈伤组织；

c.将所述步骤b的侵染后的胚性愈伤组织转接到共培养固体培养基上，在21～23℃下暗培养2.5～3.5d，得到共培养后的胚性愈伤组织；

d.将所述步骤c中共培养后的胚性愈伤组织转接到抗性筛选培养基上进行筛选培养，在25～27℃下暗培养30～40d，得到抗性愈伤组织；

所述步骤a中无钙增殖培养基以无钙改良MS培养基为基本培养基，还包括以下含量组分：2,4-D 1.0mg/L、6-BA 0.2mg/L、Zt 2mg/L、椰子水体积浓度5％、蔗糖70g/L和植物凝2.2g/L；

所述无钙改良MS培养基以水为溶剂，包括以下含量组分：硝酸铵1650mg/L、硝酸钾1900mg/L、七水硫酸镁370mg/L、磷酸二氢钾340mg/L、碘化钾0.83mg/L、硼酸9mg/L、四水硫酸锰22.3mg/L、七水硫酸锌8.6mg/L、二水钼酸钠0.25mg/L、五水硫酸铜0.025mg/L、六水氯化钴0.025mg/L、乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L、七水硫酸亚铁27.8mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸1mg/L、盐酸硫胺素VB1 5.0mg/L、盐酸吡哆醇VB6 1.0mg/L、烟酸1mg/L、生物素VH0.05mg/L；

所述无钙增殖培养基的pH值为5.7～5.9；

所述步骤d中抗性筛选培养基以改良MS培养基为基本培养基，还包括以下含量组分：2,4-D 1.0mg/L、6-BA 0.2mg/L、Zt 2mg/L、椰子水体积浓度5％、蔗糖70g/L、植物凝胶2.2g/L、潮霉素40mg/L和羧苄550mg/L；

所述抗性筛选培养基的pH值为5.7～5.9；

所述步骤c中共培养固体培养基以改良MS培养基为基本培养基，还包括以下含量组分：椰子水体积浓度5％、蔗糖70g/L、植物凝胶2.0g/L、乙酰丁香酮AS 100μM；

所述共培养固体培养基的pH值为5.7～5.9；

所述改良MS培养基以水为溶剂，包括以下含量组分：硝酸铵1650mg/L、硝酸钾1900mg/L、二水氯化钙800mg/L、七水硫酸镁370mg/L、磷酸二氢钾340mg/L、碘化钾0.83mg/L、硼酸9mg/L、四水硫酸锰22.3mg/L、七水硫酸锌8.6mg/L、二水钼酸钠0.25mg/L、五水硫酸铜0.025mg/L、六水氯化钴0.025mg/L、乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L、七水硫酸亚铁27.8mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸1mg/L、盐酸硫胺素VB1 5.0mg/L、盐酸吡哆醇VB6 1.0mg/L、烟酸1mg/L和生物素VH 0.05mg/L。

4.根据权利要求3所述的培育方法，其特征在于，所述步骤b中的农杆菌介导法，包括以下步骤：

b1)将含有HbCERK1-3HA、GUS或GFP的重组质粒导入农杆菌中，将得到的重组农杆菌培养、离心和重悬，得到重组农杆菌菌液；

b2)将所述步骤a中的预培养的胚性愈伤组织与所述步骤b1)中的重组农杆菌菌液混合，在27～29℃下侵染20～30min，得到侵染后的胚性愈伤组织。

5.根据权利要求4所述的培育方法，其特征在于，所述步骤b1)中的重组农杆菌菌液的OD值为0.6～1.0。

6.根据权利要求4所述的培育方法，其特征在于，所述步骤b2)中预培养的胚性愈伤组织的质量与重组农杆菌菌液的体积比为1g：9～11mL。

7.根据权利要求4或6所述的培育方法，其特征在于，所述步骤b2)中侵染时伴随振荡；所述振荡的转速为90～110rpm。