CN117796323B - 一种橡胶树三倍体无性系品种体胚植株的培育方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种橡胶树三倍体无性系品种体胚植株的培育方法,其特征在于,包括以下步骤:S1:将橡胶树三倍体无性系品种的外植体接种在愈伤组织培养基中,进行第一暗培养,得到愈伤组织;S2:将所述愈伤组织转接至体胚分化培养基中,进行第二暗培养,得到成熟体细胞胚;S3:将所述成熟细胞胚转入植株再生培养基中继续培养,得到橡胶树三倍体无性系品种体胚植株;其中,步骤S1中,所述愈伤组织培养基由MS培养基添加蔗糖、琼脂、椰汁和外源激素2,4‑D、NAA以及TDZ制备得到;步骤S2中,所述体胚分化培养基由MS培养基添加蔗糖、琼脂、椰汁和外源激素6‑BA、ABA、NAA以及KT制备得到。本发明的培育方法能成功培育橡胶树优良三倍体无性系品种的体胚植株。
Description
技术领域
本发明涉及橡胶树种苗培育技术领域,具体是一种橡胶树三倍体无性系品种体胚植株的培育方法。
背景技术
橡胶树体胚植株因具有完整根系、定植后生长快、林相整齐度及产胶量高、抗逆性强等优势(陈雄庭等,2002;杨加伟等,2012)而被称为优势种植材料,是具有广阔应用前景的植胶材料(顾晓川等,2018),在天然橡胶产业发展中占有举足轻重的地位。
组织培养是繁育体胚植株的唯一途径,其中花药离体培养是橡胶树组织培养的主要技术途径之一(倪燕妹,2010)。橡胶树花药离体培养效果在无性系品种间存在较大差异(谭德冠等,2005;管艳等,2015),目前仅有少数无性系品种(如‘热研73397’及‘热研72059’)可通过体胚循环增殖技术实现体胚植株规模化繁殖(华玉伟等,2007;Hua et al,2010),大部分无性系品种(如‘热垦628’‘热研879’及‘云研80-1983’)的花药组织培养技术尚未成熟,不能规模化扩繁体胚植株供生产使用。特别是云南垦区自育抗寒高产的三倍体无性系品种(如‘云研77-4’、‘云研77-2’及‘云研73-46’)因体胚发生率极低,目前无法进行规模化繁殖体胚植株,这一技术瓶颈严重制约了云南自育抗寒高产三倍体无性系品种优势种植材料的繁育及推广。为了攻克这一技术难题,已有不少学者对橡胶树三倍体无性系品种的体胚植株繁育技术进行了研究(李玲等,2019;顾晓川等,2022),但均未获得体胚植株。据此,目前亟需一种橡胶树三倍体无性系品种的体胚植株繁育技术。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足,提供体胚植株的培育方法,以至少达到成功培育橡胶树三倍体无性系品种的体胚植株。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:
一种橡胶树三倍体无性系品种体胚植株的培育方法,包括以下步骤:
S1:将橡胶树三倍体无性系品种的外植体接种在愈伤组织培养基中,进行第一暗培养,得到愈伤组织;
S2:将所述愈伤组织转接至体胚分化培养基中,进行第二暗培养,得到成熟体胚;
S3:将所述成熟体胚转入植株再生培养基中继续培养,得到橡胶树三倍体无性系品种体胚植株;
其中,步骤S1中,所述愈伤组织培养基由MS培养基添加蔗糖、琼脂、椰汁和外源激素2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)、NAA(1-萘乙酸)以及TDZ(噻苯隆)制备得到;
步骤S2中,所述体胚分化培养基由MS培养基添加蔗糖、琼脂、椰汁和外源激素6-BA
(6-苄氨基嘌呤)、ABA(脱落酸)、NAA以及KT(植物激动素)制备得到。
进一步的,步骤S1中,所述橡胶树三倍体无性系品种为云研73-46。
进一步的,步骤S1中,所述橡胶树三倍体无性系品种的外植体为云研73-46的未成熟雄花。
进一步的,步骤S1中,所述愈伤组织培养基的制备方法为:在MS培养基中,额外添加70g/L的蔗糖、5.8g/L的琼脂、50mL/L的椰汁、1.0mg/L的2,4-D、0.8mg/L的NAA以及0.02mg/L的TDZ,调节培养基pH为至5.9±0.1,高温灭菌。
进一步的,步骤S1中,所述第一暗培养为:在暗环境中,25.5-26.5℃的温度条件下,培养50-60d。
进一步的,步骤S2中,所述体胚分化培养基的制备方法为:在MS培养基中,额外添加70g/L的蔗糖、5.8g/L的琼脂、50mL/L的椰汁、0.4mg/L的6-BA、0.2mg/L的ABA、0.2mg/L的NAA以及0.2mg/L的KT,调节培养基pH为至5.9±0.1,高温灭菌。
进一步的,步骤S2中,所述第二暗培养为:在暗环境中,23.5-24.5℃的温度条件下,培育45-55d。
进一步的,步骤S3中,所述植株再生培养基包括:80%的MS培养基、2.0mg/L的GA3(赤霉素)、0.4mg/L的VB2(维生素B2)、0.15mg/L的IAA(生长素)、0.5mg/L的KT(植物激动素)、50g/L的蔗糖以及5.8g/L的琼脂。
进一步的,步骤S3中,所述继续培养为:在光照强度为1000~1500lx、光照时间8h/d的光照条件以及25.5-26.5℃的温度条件下,培育35-45d。
本发明的有益效果是:
本发明的培育方法能成功培育橡胶树优良三倍体无性系品种的体胚植株,在愈伤组织诱导阶段,愈伤组织诱导率达91.50%,在体胚诱导阶段,体胚发生率达19.31%。
附图说明
图1为实施例1中橡胶树‘云研73-46’体胚植株的培育过程,其中图A为花序、B为雄花、C为雄蕊、D为雄蕊在愈伤组织培养基中暗培养20d时雄蕊脱分化形成的愈伤组织、E为雄蕊在愈伤组织培养基中暗培养40d时的成熟愈伤组织、F为体胚分化培养基中培养21d愈伤表面分化的白色球形小胚、G为M9中培养50d愈伤分化的小胚、H为植株再生培养基培养20d时的小苗、I为培育完成的完整体胚植株。
具体实施方式
下面结合附图进一步详细描述本发明的技术方案,但本发明的保护范围不局限于以下所述。
实施例
以优良三倍体无性系品种‘云研73-46’的未成熟雄花(黄绿色)为供试材料进行体胚植株培育,具体方法如下:
制备愈伤组织培养基:在MS培养基中,额外添加70g/L的蔗糖、5.8g/L的琼脂、50mL/L的椰汁、1.0mg/L的2,4-D、0.8mg/L的NAA以及0.02mg/L的TDZ,然后调节pH为至5.9±0.1;在121℃高温下灭菌28min。
制备体胚分化培养基:在MS培养基中,额外添加70g/L的蔗糖、5.8g/L的琼脂、50mL/L的椰汁、0.4mg/L的6-BA、0.2mg/L的ABA、0.2mg/L的NAA以及0.2mg/L的KT,然后调节pH为至5.9±0.1;在121℃高温下灭菌28min。
在‘云研73-46’的花序(图1-A)上选取黄绿色的雄花(图1-B)经常规灭菌后用解剖针挑出完整雄蕊(图1-C)接种至愈伤组织培养基中(重复4次,每瓶接种10个雄蕊),在26±0.5℃的恒温培养室中暗培养,培养14~21d,雄蕊脱分化形成肉眼可见的愈伤组织(图1-D),继续培养至第40~45d,可获得淡黄色、疏松的成熟愈伤组织(图1-E),暗培养至60d后,愈伤组织诱导率达91.50%,将形成的愈伤组织分别转接到体胚分化培养基中进行体胚诱导,在24±0.5℃的恒温培养室中暗培养,培养20~25d,部分愈伤组织再分化产生白色小胚(图1-F),暗培养55d后,体胚发生率达19.31%,将成熟体细胞胚转入植株再生培养基(80%MS+GA32.0 mg/L+VB20.4 mg/L+IAA0.15 mg/L+KT0.5 mg/L+蔗糖50g/L+琼脂5.8g/L)中,以1000~1500lx光照强度、8h/d光照时间以及25±0.5℃温度光照培养,35d后得到具有根茎叶的体胚植株小苗(图1-H),45d后共获得20株完整体胚植株(图1-I),体胚植株经流式细胞术测定确认为三倍体,染色体倍性与雄蕊供体植株一致。
对比例1-7
制备7种培养基,具体方法为:在MS培养基中,额外添加70g/L的蔗糖、5.8g/L的琼脂以及不同含量的外源激素,然后调节pH为至5.9±0.1;在121℃高温下灭菌28min。对比例1-7中外源激素的添加量如表1所示:
表1
实验例1
取对比例1-7及实施例的愈伤组织培养基,将云研73-46的完整雄蕊分别接种至8种愈伤培养基中,以不加入外源激素的基础培养基(MS+蔗糖、琼脂、椰汁)为空白对照,每种培养基接种8瓶,每瓶接种10个雄蕊,在26±0.5℃的恒温培养室中暗培养,暗培养60d后统计体愈伤组织诱导率,然后将上述8个处理中形成出的愈伤组织分别转接到体胚分化培养基(MS培养基+GA30.50 mg/L+6-BA1.0 mg/L+NAA0.20 mg/L+KT0.04 mg/L+ABA0.20mg/L+蔗糖50g/L+琼脂5.8g/L)中,每皿接种10块愈伤组织,暗培养55d后统计体胚分化率,重复4次,试验结果(平均值)如表2所示:
表2
组别 | 愈伤组织诱导率 | 体胚分化率 |
空白 | 0.00 | / |
对比例1 | 15.00±1.02 | 0.00 |
对比例2 | 26.56±1.20 | 0.00 |
对比例3 | 83.75±1.02 | 2.99±0.04 |
对比例4 | 80.31±2.13 | 0.00 |
对比例5 | 89.06±1.20 | 6.19±0.87 |
对比例6 | 83.44±2.13 | 8.61±0.63 |
对比例7 | 85.63±0.72 | 6.21±0.76 |
实施例愈伤培养基 | 91.56±1.20 | 6.14±0.72 |
均值 | 61.70±36.64 | 3.35±3.48 |
其中,愈伤组织形成率=脱分化形成愈伤组织的雄蕊总数/接种雄蕊总数×100。
体胚分化率=再分化出体胚的愈伤组织总块数/接种愈伤组织总块数×100。
可以看出,‘云研73-46’的雄蕊在无外源激素的培养基中不会脱分化产生愈伤组织(空白),培养10d后全部褐化死亡,而在附加一定浓度的外源激素处理中均能脱分化产生愈伤组织,但诱导率在处理间存在较大差异,变幅为15.00%~91.56%,极差高达76.56%,均值为69.41%。采用对比例的3、5~7的培养基,愈伤组织均具有胚性,在后续体胚诱导中能再分化产生体胚,但分化率普遍较低,变幅为2.99%~8.61%,均值仅为6.08%。而采用实施例愈的伤组织培养基时,愈伤组织诱导率显著提高,但是体胚分化率较低,证明了愈伤组织诱导率高的的植物激素组合并不一定适应后续体胚分化。
对比例8-15
制备8种培养基,具体方法为:在MS培养基中,额外添加70g/L的蔗糖、5.8g/L的琼脂以及不同含量的外源激素,然后调节pH为至5.9±0.1;在121℃高温下灭菌28min。对比例8-15中外源激素的添加量如表3所示:
表3
组别 | 6-BA(mg/L) | ABA(mg/L) | NAA(mg/L) | KT(mg/L) |
对比例8 | 0.2 | 0.05 | 0.1 | 0.2 |
对比例9 | 0.2 | 0.1 | 0.2 | 0.4 |
对比例10 | 0.2 | 0.2 | 0.3 | 0.6 |
对比例11 | 0.3 | 0.05 | 0.2 | 0.6 |
对比例12 | 0.3 | 0.1 | 0.3 | 0.2 |
对比例13 | 0.3 | 0.2 | 0.1 | 0.4 |
对比例14 | 0.4 | 0.05 | 0.3 | 0.4 |
对比例15 | 0.4 | 0.1 | 0.1 | 0.6 |
实验例2
取对比例8-15及实施例的体胚分化培养基,将实施例1中诱导出云研73-46的成熟愈伤组织分别接种至9种培养基中,每个处理接种9皿,每皿接种10块愈伤组织,24℃暗培养55d后统计体胚分化率,然后将成熟体胚转入植株再生培养基中(80%MS+GA32.0mg/L+VB20.4mg/L+IAA0.15mg/L+KT0.5mg/L+蔗糖50g/L+琼脂5.8g/L),重复3次,试验结果(平均值)如表4所示:
表4
表4说明,三倍体无性系品种‘云研73-46’愈伤组织在9种体胚分化培养基中均能再分化产生体胚,体胚分化率在处理间的差异较大,变幅为6.91%~19.31%,均值为10.58%;8个对比例的体胚分化率均极显著地(P<0.01)低于本发明体胚分化培养基,且分化出的体胚畸形率高,难以进一步发育形成完整体胚植株,而采用本发明体胚分化培养基不仅可显著提高体胚分化率,且获得的体胚畸形率相对较低,易进一步发育形成完整体胚植株。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式,不应看作是对其他实施例的排除,而可用于各种其他组合、修改和环境,并能够在本文所述构想范围内,通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围,则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。
Claims (4)
1.一种橡胶树三倍体无性系品种体胚植株的培育方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1:将橡胶树三倍体无性系品种的外植体接种在愈伤组织培养基中,进行第一暗培养,得到愈伤组织;
S2:将所述愈伤组织转接至体胚分化培养基中,进行第二暗培养,得到成熟体胚;
S3:将所述成熟体胚转入植株再生培养基中继续培养,得到橡胶树三倍体无性系品种体胚植株;
步骤S1中,所述橡胶树三倍体无性系品种的外植体为云研73-46的未成熟雄花的雄蕊;
步骤S1中,所述愈伤组织培养基的制备方法为:在MS培养基中,额外添加70g/L的蔗糖、5.8g/L的琼脂、50mL/L的椰汁、1.0mg/L的2,4-D、0.8mg/L的NAA以及0.02mg/L的TDZ;
步骤S2中,所述体胚分化培养基的制备方法为:在MS培养基中,额外添加70g/L的蔗糖、5.8g/L的琼脂、50mL/L的椰汁、0.4mg/L的6-BA、0.2mg/L的ABA、0.2mg/L的NAA以及0.2mg/L的KT;
步骤S3中,所述植株再生培养基为: 80%的MS培养基、2.0 mg/L的GA3、0.4mg/L的VB2、0.15 mg/L的IAA、0.5 mg/L的KT、50g/L的蔗糖以及5.8g/L的琼脂。
2.根据权利要求1所述的培育方法,其特征在于,步骤S1中,所述第一暗培养为:在暗环境中,25.5-26.5℃的温度条件下,培养50-60天。
3.根据权利要求1所述的培育方法,其特征在于,步骤S2中,所述第二暗培养为:在暗环境中,23.5-24.5℃的温度条件下,培育45-55天。
4.根据权利要求1所述的培育方法,其特征在于:步骤S3中,所述继续培养为:在光照强度为1000~1500lx、光照时间8h/d的光照条件以及25.5-26.5℃的温度条件下,培育35-45天。
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巴西橡胶树花药体胚发生类型及其培养条件的改良;谭德冠;孙雪飘;付莉莉;马帅;张家明;;热带作物学报;20110725(第07期);全文 * |
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