CN112841037B - 一种用于橡胶树的胚性愈伤组织诱导培养基、诱导橡胶树体细胞胚发生的方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于橡胶树的胚性愈伤组织诱导培养基、诱导橡胶树体细胞胚发生的方法和应用，属于植物组织培养技术领域。本发明提供的用于橡胶树的胚性愈伤组织诱导培养基，以MS培养基为基本培养基，通过调整MS培养基中原有各组分的浓度以及添加生物素、叶酸、天冬酰胺、水解酪蛋白、蔗糖、Phytagel、椰子水和激素组合物等组分，显著提高了橡胶树体细胞胚的发生效率，为橡胶树体胚苗的研发和应用奠定了技术基础。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种用于橡胶树的胚性愈伤组织诱导培养基、诱导橡胶树体细胞胚发生的方法和应用。
背景技术
天然橡胶是一种重要的工业原料和战略物资，其主要来源于橡胶树。目前生产上应用的主体种植材料为芽接苗，即实生苗嫁接优良品种接穗所培育的种苗。因砧木来源于自然授粉的种子，遗传来源不一致，导致植株间产量、生长存在显著差异。体胚苗是由体细胞胚直接发育而来的，具有自我根系的幼态化无性系，较目前生产上应用的种苗-芽接树，产量高10％～30％，生长快10％～20％，是天然橡胶产业新一代种植材料。但是，目前仍有许多品种的花药体细胞胚难以诱导，部分能诱导的品种体细胞胚发生率也偏低，只有个别品种体细胞胚发生率达到30％，严重制约了橡胶树体胚苗的研发和应用。因此，迫切需要提供一种提高橡胶树体细胞胚发生的方法。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种用于橡胶树的胚性愈伤组织诱导培养基、诱导橡胶树体细胞胚发生的方法和应用。本发明提供的用于橡胶树的胚性愈伤组织诱导培养基可显著提高橡胶树的花药体细胞胚发生效率，为橡胶树体胚苗的研发和应用奠定了技术基础。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了用于橡胶树的胚性愈伤组织诱导培养基，包括胚性愈伤组织诱导培养基；
所述胚性愈伤组织诱导培养基以MS培养基为基本培养基，调整硝酸铵的浓度为330～1800mg/L，五水硫酸铜浓度为0.1～0.3mg/L，烟酸浓度为2.5～7.5mg/L，VB 1浓度为0.25～0.75mg/L，添加生物素0.01～0.1mg/L，叶酸0.1～1mg/L，天冬酰胺100～600mg/L，水解酪蛋白100～600mg/L，蔗糖50～90g/L，Phytagel 2～3g/L，椰子水40～90ml/L和激素组合物，以胚性愈伤组织诱导培养基的体积计，所述激素组合物包括以下质量浓度的组分：2,4-D 0.2～2mg/L、Zeatin 0.2～2mg/L和Picloram 0.2～2mg/L；或者包括2,4-D 0.2～2mg/L、KT 0.2～2mg/L和Picloram 0.2～2mg/L。
本发明提供了一种基于上述技术方案中所述胚性愈伤组织诱导培养基的诱导橡胶树体细胞胚发生的方法，包括如下步骤：摘取绿色至黄色、完全未开放的雄花并消毒；从消毒后的雄花中将雄蕊剥出并接种到胚性愈伤组织诱导培养基进行诱导培养，得到胚性愈伤组织；将胚性愈伤组织转接到体细胞胚分化培养基，进行分化培养，得到体细胞胚。
优选的，所述消毒的方法包括如下步骤：将所述雄花用体积百分含量为70％～75％酒精水溶液表面消毒30～60s；酒精水溶液表面消毒后，用质量百分含量为0.1％氯化汞水溶液消毒10～15min；氯化汞水溶液消毒后，用无菌水冲洗。
优选的，所述诱导培养的条件为：温度26～28℃，相对湿度65％～75％，黑暗条件下培养40～60d。
优选的，所述分化培养的条件为：温度24～26℃，相对湿度65％～75％，黑暗条件下培养40～60d。
本发明提供了上述技术方案中所述的用于橡胶树的胚性愈伤组织诱导培养基或上述技术方案中所述的方法在橡胶树体胚苗培养中的应用。
本发明提供了上述技术方案中所述的用于橡胶树的胚性愈伤组织诱导培养基或上述技术方案中所述的方法在提高橡胶树体细胞胚发生率中的应用。
本发明提供了上述技术方案中所述的用于橡胶树的胚性愈伤组织诱导培养基或上述技术方案中所述的方法在提高橡胶树花药体细胞胚发生率中的应用。
有益效果：
本发明提供了一种用于橡胶树的胚性愈伤组织诱导培养基，所述胚性愈伤组织诱导培养基以MS培养基为基本培养基，通过调整MS培养基中原有各组分的浓度以及添加生物素、叶酸、天冬酰胺、水解酪蛋白、蔗糖、Phytagel、椰子水和激素组合物等组分，显著提高了橡胶树体细胞胚的发生效率，为橡胶树体胚苗的研发和应用奠定了技术基础。实施例的结果表明，本发明提供的用于橡胶树的胚性愈伤组织诱导培养基显著提高了多个橡胶树品种的花药体细胞胚发生率。
具体实施方式
本发明提供了用于橡胶树的胚性愈伤组织诱导培养基，所述胚性愈伤组织诱导培养基以MS培养基为基本培养基，调整硝酸铵的浓度为330～1800mg/L，五水硫酸铜浓度为0.1～0.3mg/L，烟酸浓度为2.5～7.5mg/L，VB 1浓度为0.25～0.75mg/L，添加生物素0.01～0.1mg/L，叶酸0.1～1mg/L，天冬酰胺100～600mg/L，水解酪蛋白100～600mg/L，蔗糖50～90g/L，Phytagel 2～3g/L，椰子水40～90ml/L和激素组合物，以胚性愈伤组织诱导培养基的体积计，所述激素组合物包括以下质量浓度的组分：2,4-D 0.2～2mg/L、Zeatin 0.2～2mg/L和Picloram 0.2～2mg/L；或者包括2,4-D 0.2～2mg/L、KT 0.2～2mg/L和Picloram0.2～2mg/L。
本发明用于橡胶树的胚性愈伤组织诱导培养基以MS培养基为基本培养基。本发明在MS培养基的基础上调整了硝酸铵、五水硫酸铜、烟酸和VB 1的浓度。在本发明中，所述硝酸铵的浓度为330～1800mg/L，进一步优选为660mg/L，该组分为植物细胞提供氮营养元素并作为缓冲剂调控培养基pH；所述五水硫酸铜的浓度为0.1～0.3mg/L，进一步优选为0.2mg/L，该组分是植物必要的微量元素，参与多种酶的氧化还原反应；所述烟酸的浓度为2.5～7.5mg/L，进一步优选为5mg/L，该组分为植物细胞生长必不可少的中间体和代谢催化剂；所述VB 1的浓度为0.25～0.75mg/L，进一步优选为0.5mg/L，该组分为植物细胞生长必不可少的中间体和代谢催化剂。本发明在MS培养基的基础上添加了生物素、叶酸、天冬酰胺、水解酪蛋白、蔗糖、Phytagel、椰子水和激素组合物。在本发明中，所述生物素的浓度为0.01～0.1mg/L，进一步优选为0.05mg/L；所述叶酸的浓度为0.1～1mg/L，进一步优选为0.5mg/L；所述天冬酰胺的浓度为100～600mg/L，进一步优选为300mg/L，该组分为植物细胞提供氨基酸；所述水解酪蛋白的浓度为100～600mg/L，进一步优选为100mg/L，该组分为植物细胞提供氨基酸；所述蔗糖的浓度为50～90g/L，进一步优选为70g/L，该组分为植物细胞提供碳源并作为渗透剂调节培养基渗透势；所述Phytagel的浓度为2～3g/L，进一步优选为2.5g/L，该组分作为凝固剂可半固化培养基以支撑培养的植物材料；所述椰子水的浓度为40～90ml/L，进一步优选为50ml/L，该组分为植物细胞提供植物激素、氨基酸、维生素等多种营养成分。在本发明中，以胚性愈伤组织诱导培养基的体积计，所述激素组合物包括以下质量浓度的组分：2,4-D 0.2～2mg/L、Zeatin 0.2～2mg/L和Picloram 0.2～2mg/L，进一步优选为2,4-D1mg/L、Zeatin 1mg/L和Picloram 1mg/L；或者包括2,4-D 0.2～2mg/L、KT 0.2～2mg/L和Picloram 0.2～2mg/L，进一步优选为2,4-D 0.5mg/L、KT 0.5mg/L和Picloram0.5mg/L，本发明特定的激素组合可以促进愈伤组织生长，诱导胚性愈伤组织形成，显著提高胚性愈伤组织的诱导率。
本发明对上述培养基各组分的来源没有特殊要求，采用常规市售产品即可。本发明以MS培养基为基本培养基，通过调整MS培养基中原有各组分的浓度以及添加生物素、叶酸、天冬酰胺、水解酪蛋白、蔗糖、Phytagel、椰子水和激素组合物等组分，显著提高了橡胶树体细胞胚的发生效率，为橡胶树体胚苗的研发和应用奠定了技术基础。
本发明提供了一种基于上述技术方案中所述用于橡胶树的胚性愈伤组织诱导培养基的诱导橡胶树体细胞胚发生的方法，包括如下步骤：摘取绿色至黄色、完全未开放的雄花并消毒；从消毒后的雄花中将雄蕊剥出并接种到胚性愈伤组织诱导培养基进行诱导培养，得到胚性愈伤组织；将胚性愈伤组织转接到体细胞胚分化培养基，进行分化培养，得到体细胞胚。
本发明摘取绿色至黄色、完全未开放的雄花并消毒。本发明选择绿色至黄色、完全未开放的雄花作为外植体可提高胚性愈伤组织的诱导率。在本发明中，所述消毒的方法优选包括如下步骤：将所述雄花用体积百分含量为70％～75％酒精水溶液表面消毒30～60s；酒精水溶液表面消毒后，用质量百分含量为0.1％氯化汞水溶液消毒10～15min；氯化汞水溶液消毒后，用无菌水冲洗；进一步优选为将所述雄花用体积百分含量为75％酒精水溶液表面消毒60s；酒精水溶液表面消毒后，用质量百分含量为0.1％氯化汞水溶液消毒10m；氯化汞水溶液消毒后，用无菌水冲洗。本发明的消毒方法不仅操作简单，而且消毒效果良好，防止外植体污染，提高胚性愈伤组织的诱导效率。
消毒后，本发明从消毒后的雄花中将雄蕊剥出并接种到胚性愈伤组织诱导培养基进行诱导培养，得到胚性愈伤组织。本发明对剥出雄蕊的方法没有特殊要求，采用本领域常规方法剥出即可。在本发明中，所述诱导培养的温度优选为温度26～28℃，进一步优选为27℃；所述诱导培养的相对湿度优选为65％～75％，进一步优选为70％。本发明优选在黑暗条件下培养40～60d得到胚性愈伤组织，进一步优选为黑暗条件下培养50d。本发明特定的诱导条件可促进愈伤组织生长，诱导胚性愈伤组织形成；偏离此培养条件，愈伤组织生长慢，胚性愈伤形成比例低，或者愈伤组织生长过快，营养物质消耗大，造成表层细胞生理活性降低，愈伤组织容易提前褐化。
得到胚性愈伤组织后，本发明将胚性愈伤组织转接到体细胞胚分化培养基，进行分化培养，得到体细胞胚。本发明对分化培养基没有特殊要求，采用本领域常规分化培养基即可。本发明实施例中的分化培养基优选以MS培养基为基本培养基，调整其大量元素至原来的4/5，添加蔗糖70g/L，Phytagel 2.2g/L，6-BA 0.5mg/L、KT 3mg/L、NAA0.05mg/L、GA30.5mg/L和ABA 1mg/L。在本发明中，所述分化培养的温度优选为24～26℃，进一步优选为25℃；所述分化培养的相对湿度优选为65％～75％，进一步优选为70％。本发明优选在黑暗条件下培养40～60d得到体细胞胚，进一步优选为黑暗条件下培养50d。本发明特定的分化条件可良好的促进体细胞胚分化，发育和成熟；偏离此培养条件，体细胞胚发育速度变慢，或者胚性愈伤褐化迅速而影响体胚分化效率。
本发明提供的诱导橡胶树体细胞胚发生的方法操作步骤简单，可显著提高多个橡胶树品种的体细胞胚发生率，通用性强，为橡胶树体胚苗的研发和应用奠定了技术基础。
本发明提供了上述技术方案中所述的用于橡胶树的胚性愈伤组织诱导培养基或上述技术方案中所述的方法在橡胶树体胚苗培养中的应用。
本发明提供了上述技术方案中所述的用于橡胶树的胚性愈伤组织诱导培养基或上述技术方案中所述的方法在提高橡胶树体细胞胚发生率中的应用。
本发明提供了上述技术方案中所述的用于橡胶树的胚性愈伤组织诱导培养基或上述技术方案中所述的方法在提高橡胶树体花药细胞胚发生率中的应用。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的用于橡胶树的胚性愈伤组织诱导培养基、诱导橡胶树体细胞胚发生的方法和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
胚性愈伤组织诱导培养基配方：
以MS培养基为基本培养基，调整其硝酸铵浓度为1500mg/L，五水硫酸铜浓度为0.2mg/L，烟酸浓度为5mg/L，VB 1浓度为0.5mg/L，添加生物素0.05mg/L，叶酸0.5mg/L，天冬酰胺300mg/L，水解酪蛋白100mg/L，蔗糖70g/L，Phytagel 2.5g/L，椰子水50ml/L，并添加2,4-D 1mg/L、Zeatin 1mg/L、Picloram 1mg/L。
诱导橡胶树体细胞胚发生的方法：
采集多数雄花处于绿色至微黄阶段的橡胶树花序，注意过程中防晒保湿。用流水冲洗采集的花序，然后用镊子摘取足量绿色至微黄、完全未开放的雄花，置超净工作台上，用体积分数含量为75％酒精水溶液表面消毒60s，之后用质量百分含量为0.1％氯化汞水溶液消毒15min，最后用无菌水冲洗6次，每次3min。用解剖针和镊子从消毒的雄花中将雄蕊剥出，然后将120粒雄蕊接种到胚性愈伤组织诱导培养基上，在27℃暗室中培养50d诱导得到愈伤组织。将诱导的愈伤组织接种到体细胞胚分化培养基上，在25℃暗室中培养50d诱导体细胞胚发生，其中体细胞胚分化培养基以MS培养基为基本培养基，调整其大量元素至原来的4/5，添加蔗糖70g/L，Phytagel 2.2g/L，6-BA 0.5mg/L、KT3mg/L、NAA 0.05mg/L、GA30.5mg/L和ABA 1mg/L。
实施例2
胚性愈伤组织诱导培养基配方：
以MS培养基为基本培养基，调整其硝酸铵浓度为330mg/L，五水硫酸铜浓度为0.2mg/L，烟酸浓度为5mg/L，VB 1浓度为0.5mg/L，添加生物素0.05mg/L，叶酸0.5mg/L，天冬酰胺300mg/L，水解酪蛋白100mg/L，蔗糖70g/L，Phytagel 2.5g/L，椰子水50ml/L，并添加2,4-D 0.5mg/L、KT 0.5mg/L、Picloram 0.5mg/L。
诱导橡胶树体细胞胚发生的方法：同实施例1，不同之处在于，将胚性愈伤组织诱导培养基替换为实施例2的培养基。
对比例1
胚性愈伤组织诱导培养基配方：
以MS培养基为基本培养基，添加蔗糖70g/L，Phytagel 2.5g/L，椰子水50ml/L，并添加2,4-D 1mg/L、KT 1mg/L、NAA 1mg/L。
诱导橡胶树体细胞胚发生的方法：同实施例1，不同之处在于，将胚性愈伤组织诱导培养基替换为对比例1的培养基。
对比例2
胚性愈伤组织诱导培养基配方：
以MS培养基为基本培养基，添加蔗糖70g/L，Phytagel 2.5g/L，椰子水50ml/L，并添加2,4-D 0.5mg/L、KT 0.5mg/L、NAA 0.5mg/L。
诱导橡胶树体细胞胚发生的方法：同实施例1，不同之处在于，将胚性愈伤组织诱导培养基替换为对比例2的培养基。
对比例3
胚性愈伤组织诱导培养基配方：
以MS培养基为基本培养基，添加蔗糖70g/L，Phytagel 2.5g/L，椰子水50ml/L，并添加2,4-D 1.5mg/L、KT 1.5mg/L、NAA 1.5mg/L。
诱导橡胶树体细胞胚发生的方法：同实施例1，不同之处在于，将胚性愈伤组织诱导培养基替换为对比例3的培养基。
实施例3
采用实施例1～2和对比例1～3的培养基和方法对14种不同品种的橡胶树进行体细胞胚的培养，每个处理重复3次，分别统计不同处理的愈伤组织诱导率和体细胞胚发生率。
其中，愈伤组织诱导率计算公式：愈伤组织诱导率＝诱导得到愈伤组织的雄蕊数/总接种雄蕊数×100％。
体细胞胚发生率计算公式：体细胞胚发生率＝诱导得到体细胞胚的愈伤组织数/总接种愈伤组织数×100％。
试验结果采用SPSS软件计算均值和标准差，具体的试验结果见表1～5。
表1实施例1不同品种橡胶树体细胞胚发生结果
表2实施例2不同品种橡胶树体细胞胚发生结果
表3对比例1不同品种橡胶树体细胞胚发生结果
备注：“-”表示未开展此处理实验，其他表格中的“-”同上。
表4对比例2不同品种橡胶树体细胞胚发生结果
表5对比例3不同品种橡胶树体细胞胚发生结果
由表1～5的结果可知，本发明实施例1～2，不同品种的橡胶树体细胞胚的发生率显著高于对比例1～3，本发明提供的诱导橡胶树体细胞胚发生的培养基优于对比例1～3。
上述实施例的结果表明，本发明提供的诱导橡胶树体细胞胚发生的培养基显著提高了多个橡胶树品种的花药体细胞胚发生率，为橡胶树体胚苗的研发和应用奠定了技术基础。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其它实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (8)
1.一种用于橡胶树的胚性愈伤组织诱导培养基，其特征在于，所述胚性愈伤组织诱导培养基以MS培养基为基本培养基，调整硝酸铵的浓度为330～1800mg/L，五水硫酸铜浓度为0.1～0.3mg/L，烟酸浓度为2.5～7.5mg/L，VB1浓度为0.25～0.75mg/L，添加生物素0.01～0.1mg/L，叶酸0.1～1mg/L，天冬酰胺100～600mg/L，水解酪蛋白100～600mg/L，蔗糖50～90g/L，Phytagel 2～3g/L，椰子水40～90ml/L和激素组合物，以胚性愈伤组织诱导培养基的体积计，所述激素组合物由以下质量浓度的组分组成：2,4-D 0.5～1mg/L、Zeatin 0.5～1mg/L和Picloram 0.5～1mg/L；或者2,4-D 0.5～1mg/L、KT 0.5～1mg/L和Picloram 0.5～1mg/L。
2.一种基于权利要求1所述胚性愈伤组织诱导培养基的诱导橡胶树体细胞胚发生的方法，其特征在于，包括如下步骤：摘取绿色至黄色、完全未开放的雄花并消毒；从消毒后的雄花中将雄蕊剥出并接种到胚性愈伤组织诱导培养基进行诱导培养，得到胚性愈伤组织；将胚性愈伤组织转接到体细胞胚分化培养基，进行分化培养，得到体细胞胚；所述分化培养基以MS培养基为基本培养基，调整其大量元素至原来的4/5，添加蔗糖70g/L，Phytagel 2.2g/L，6-BA 0.5mg/L、KT 3mg/L、NAA 0.05mg/L、GA3 0.5mg/L和ABA 1mg/L。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述消毒的方法包括如下步骤：将所述雄花用体积百分含量为70％～75％酒精水溶液表面消毒30～60s；酒精水溶液表面消毒后，用质量百分含量为0.1％氯化汞水溶液消毒10～15min；氯化汞水溶液消毒后，用无菌水冲洗。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述诱导培养的条件为：温度26～28℃，相对湿度65％～75％，黑暗条件下培养40～60d。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述分化培养的条件为：温度24～26℃，相对湿度65％～75％，黑暗条件下培养40～60d。
6.权利要求1所述的用于橡胶树的胚性愈伤组织诱导培养基或权利要求2～5任一项所述的方法在橡胶树体胚苗培养中的应用。
7.权利要求1所述的用于橡胶树的胚性愈伤组织诱导培养基或权利要求2～5任一项所述的方法在提高橡胶树体细胞胚发生率中的应用。
8.权利要求1所述的用于橡胶树的胚性愈伤组织诱导培养基或权利要求2～5任一项所述的方法在提高橡胶树花药体细胞胚发生率中的应用。
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2021
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