CN116530416B - 一种运用油菜素内酯促进橡胶树体胚发生的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种油菜素内酯在橡胶树体胚发生中的运用，涉及植物组织培养领域，具体方法包括以下步骤，将橡胶树易碎愈伤组织接种在含有油菜素内酯的培养基上进行预培养20‑30天，转接到出胚诱导培养基上进行培养，20‑30天后能观察到球形胚形成，再转接到体胚形成培养基上使球形胚进一步发育形成子叶形体胚。本发明利用橡胶树花药诱导获得的易碎胚性愈伤组织，经过油菜素内酯预处理诱导体系细胞胚的发生，提高了橡胶树易碎愈伤组织体胚发生效率，为橡胶树遗传转化提供技术支持。
Description
技术领域
本发明涉及植物培植领域，具体涉及一种运用油菜素内酯促进橡胶树体胚发生的方法，本发明提供了油菜素内酯在橡胶树易碎胚形愈伤组织诱导体胚发生的运用方法。
背景技术
天然橡胶是我国重要的战略物资，主要来源于橡胶树。我国已于2016年完成了橡胶树基因组测序，随后这几年科学家对橡胶树基因进行了大量的研究，因缺乏高效的遗传转化体系，都未实现在橡胶树本身进行验证。易碎胚性愈伤组织具有增殖快、再生效率高，通过易碎胚性愈伤组织是诱导体胚高效发生途径，同时，易碎胚性愈伤组织侵染效率高、再生植株纯合，是理想的遗传转化受体。但因橡胶树易碎胚性愈伤组织出胚效率不高，限制其在遗传转化用的运用。
现有橡胶树体胚发生技术中，华玉伟等人利用花药外植体诱导愈伤并获得初生体胚，再利用体胚诱导次生体胚发生，建立了循环增殖高效体胚发生技术，以此奠定了橡胶树体胚组培苗规模化繁育的基础。在近年来相关的发明专利中，顾晓川等公开了一种用橡胶树花萼诱导体细胞胚发生的方法(CN113331057B，2022)、一种用于橡胶树的胚性愈伤组织诱导培养基、诱导橡胶树体细胞胚发生的方法和应用(CN112841037B，2022)及一种橡胶树次生体胚高效发生方法及其应用(CN115500261B，2023)，黄天带等公开了一种采用橡胶树试管苗嫩叶诱导体胚发生和植株再生的方法(CN114467748B，2023)，以上方法主要以橡胶树体胚、花萼、嫩叶等作为外植体，进行体细胞胚的诱导。在长期继代的胚性愈伤诱导体胚方面，陈健妙等公开了橡胶树胚状体诱导培养基、胚性愈伤组织的诱导方法及抗性愈伤组织的培育方法(CN108575761B，2019)，该方法主要通过调整基本培养基、激素水平诱导体胚发生，但都未涉及油菜素内酯的使用。本申请提供了一种运用油菜素内酯促进橡胶树体胚发生的方法，大幅度提高了橡胶树易碎胚性愈伤组织的体胚发生效率。
发明内容
本发明的目的在于提供一种运用油菜素内酯促进橡胶树体胚发生的方法。将橡胶树易碎胚形愈伤组织接种到含有油菜素内酯的培养基上进行预处理，再转接到降低激素浓度的培养基诱导并进一步培养形成体胚，提高橡胶树体胚发生效率。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种运用油菜素内酯促进橡胶树体胚发生的方法，包括如下步骤：
S1:诱导预处理：将橡胶树易碎愈伤组织接种在含有油菜素内酯的诱导预处理培养基上，培养温度为25℃-28℃，时间为20-30天；
S2:出胚诱导：将经过预处理易碎愈伤组织转接到出胚诱导培养基上，进行培养，培养温度为25℃-28℃，时间为20-30天；
S3:体胚形成：易碎愈伤组织转接到体胚形成培养基上进一步发育形成体胚，培养温度为25℃-28℃，时间为30-50天。
优选地，所述步骤S1诱导预处理中，油菜素内酯的使用浓度为0.5mg。
优选地，所述步骤S1诱导预处理中，处理时长为20-30天。
优选地，所述步骤S2出胚诱导中，培养基除去2.4-D，增加phytagel至5.0g/L。
优选地，所述步骤S3体胚形成中，使用改良MS为基础的未添加激素的培养基。
本发明的有益效果为：
本发明运用油菜素内酯预处理橡胶树易碎胚形愈伤组织，再转接到降低激素浓度的培养基进行诱导并进一步形成体胚，提高了橡胶树体胚发生效率，为橡胶树遗传转化提供技术支持，加快橡胶树基因研究、转基因、基因编辑等分子育种的进程。
附图说明
图1是橡胶树易碎胚性愈伤组织经实施例1、对比例1-4预处理后诱导体胚发生获得的体胚，上左、中、右图依次为经实施例1、对比例1-2预处理30d后诱导形成的体胚，下左、右图分别为经实对比例3、对比例4预处理30d后诱导形成的体胚；
图2是橡胶树易碎胚性愈伤组织经实施例2、实施例3、对比例5和对比例6预处理后诱导体胚发生获得的体胚，从左至右依次为：实施例2、实施例3、对比例5和对比例6。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中本发明提供的一种运用油菜素内酯促进橡胶树体胚发生的方法中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径可购得。
实施例1
一种诱导预处理培养基，以改良MS为基本培养基，每升培养基中还含有2.4-D0.2mg、NAA0.2mg、KT0.5 mg、6-BA0.5mg、油菜素内酯0.5mg、蔗糖60g和phytagel 2.2g，调节pH值至5.8。
实施例2
一种橡胶树易碎胚性愈伤预处理方法，将易碎胚性愈伤组织接种在实施例1的培养基上，培养20d，培养条件为25℃-28℃，暗培养。
实施例3
一种橡胶树易碎胚性愈伤预处理方法，将易碎胚性愈伤组织接种在实施例1的培养基上，培养30d，培养条件为25℃-28℃，暗培养。
实施例4
一种出胚诱导培养基，以改良MS为基本培养基，每升培养基中还含有NAA0.2mg、KT0.5 mg、6-BA0.5mg、ABA0.5 mg、蔗糖60g和phytagel 5.0g，调节pH值至5.8。
实施例5
一种体胚形成培养基，以改良MS为基本培养基，每升培养基中还含有蔗糖70g和phytagel 2.2g，调节pH值至5.8。
对比例1
一种诱导预处理培养基，以改良MS为基本培养基，每升培养基中还含有2.4-D0.2mg、NAA0.2mg、KT0.5 mg、6-BA0.5mg、蔗糖60g和phytagel 2.2g，调节pH值至5.8。
对比例2
一种诱导预处理培养基，以改良MS为基本培养基，每升培养基中还含有2.4-D0.2mg、NAA0.2mg、KT0.5 mg、6-BA0.5mg、油菜素内酯0.05mg、蔗糖60g和phytagel 2.2g，调节pH值至5.8。
对比例3
一种诱导预处理培养基，以改良MS为基本培养基，每升培养基中还含有2.4-D0.2mg、NAA0.2mg、KT0.5 mg、6-BA0.5mg、油菜素内酯0.1mg、蔗糖60g和phytagel 2.2g，调节pH值至5.8。
对比例4
一种诱导预处理培养基，以改良MS为基本培养基，每升培养基中还含有2.4-D0.2mg、NAA 0.2mg、KT0.5 mg、6-BA 0.5mg、油菜素内酯1.0mg、蔗糖60g和phytagel 2.2g，调节pH值至5.8。
对比例5
一种橡胶树易碎胚性愈伤预处理方法，将易碎胚性愈伤组织接种在实施例1的培养基上，培养0d，培养条件为25℃-28℃，暗培养。
对比例6
一种橡胶树易碎胚性愈伤预处理方法，将易碎胚性愈伤组织接种在实施例1的培养基上，培养10d，培养条件为25℃-28℃，暗培养。
将橡胶树易碎胚性愈伤组织经过实施例1～3和对比例1-6的预处理培养，后转到实施例4、5培养基上进行体胚诱导和发育，统计获得明显变白的体胚，发育时期为鱼雷胚及之后。
油菜素内酯不同浓度和不同时长预处理对橡胶树易碎胚形愈伤体胚发生的影响见表1和表2。
表1实施例1和对比例1～4不同浓度油菜素内酯预处理对橡胶树易碎胚形愈伤体胚发生的影响一览表
表2实施例2～3和对比例5～6油菜素内酯不同预处理时长对橡胶树易碎胚形愈伤体胚发生的影响一览表
注：不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示处理间差异极显著(P<0.01)。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.一种运用油菜素内酯在橡胶树促进体胚发生的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1:诱导预处理：将橡胶树易碎愈伤组织接种在含有油菜素内酯浓度为0.5mg/L的培养基上，进行预培养，培养温度为25℃-30℃，时间为20-30天；
S2:出胚诱导：将经过预处理易碎愈伤组织转接到出胚诱导培养基上，进行培养，培养温度为25℃-30℃，时间为20-30天；
S3:体胚形成：易碎愈伤组织转接到体胚形成培养基上进一步发育形成体胚，培养温度为25℃-30℃，时间为30-50天。
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