CN102057869B - 棉花再生苗生根方法及其专用培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种棉花再生苗生根方法及其专用培养基。本发明提供的生根培养基，是由培养液、保水剂和基质组成；所述培养液是在MS1无机盐溶液中添加IAA得到的混合溶液，所述混合溶液中的IAA的终浓度为12-20mg/L。采用本发明提供的培养基进行生根实验发现：中091、中棉所24或冀合321等棉花的生根率可达80％。
Description
技术领域
本发明涉及植物组织培养技术领域，特别涉及一种诱导棉花再生苗生根的方法及其专用培养基。
背景技术
在棉花的组织培养技术中，获得再生苗后，要在专用培养基中，在无菌条件下培养，一般45天左右继代一次，直到准备定植为止。棉花组织培养后获得的再生苗，在美国、澳大利亚等国家是通过生根培养基进行生根培养，然后移栽定植的。我国由于组织培养用棉花品种(系)的原因，再生苗生根十分困难，国外的生根培养体系不适合我国的棉花组织培养用的品种材料。再生苗的定植中生根定植一直是困扰我国研究人员的一个难题。张慧军等(ZL200510012491)发明了棉花再生试管苗直接移栽的基质及方法。其基质由沙子和烟囱煤灰按1∶0.5-1的比例混合再进行高压灭菌后制得。李付广等棉花再生苗生根培养方法及其专用培养基(ZL200510088963.2)。国内外的棉花再生苗移栽技术，均需进行生根培养后，进行移栽，且管理困难。嫁接是我国在棉花再生苗的定植中应用最多、最广的方法。但嫁接需要培育砧木、嫁接和嫁接后管理等繁琐步骤。
发明内容
本发明的目的在于提供一种生根培养基。
本发明提供的生根培养基，是由培养液、保水剂和起支撑作用的基质组成；所述培养液是大量元素减半的MS培养基的无机盐溶液(简称MS1无机盐溶液)中添加IAA得到的混合溶液，所述混合溶液中的IAA的终浓度为12-20mg/L。
其中MS无机盐溶液的溶剂是水，溶质的组成见表1。
表1.MS1无机盐溶液的溶质
上述IAA的终浓度具体可为15mg/L。
所述培养液与保水剂的配比是2L∶2.0-2.5g。
所述培养液和保水剂混合后的体积与所述基质的体积的比为1∶(1-1.5)。
上述起支撑作用的基质疏松多孔，可为蛭石、珍珠岩或膨胀陶粒。
本发明的另一目的在于提供一种诱导棉花生根的方法。
本发明提供的诱导棉花生根的方法是将待生根的棉花材料置于上述的生根培养基质中培养。
上述待生根的棉花材料是通过将待生根棉花再生苗浸泡在促进生根的激素溶液中10-20小时后得到的材料；所述促进生根的激素溶液是在MS1无机盐溶液中添加IAA和KT的溶液，所述激素溶液中IAA的终浓度是12-20mg/L、KT的终浓度3-8mg/L。其中MS1无机盐溶液的溶剂是水，溶质的组成见表1。
所述激素溶液中，IAA的终浓度优选是15mg/L、KT的终浓度优选是5mg/L。
上述待生根苗是如下a)或b)：
a)将棉花通过组织培养得到的组培苗；
b)没有经过组培的带至少一个生长点或潜伏芽的营养体，如大田棉花的带至少一个生长点或潜伏芽的果枝或营养枝。
上述的棉花具体可为中091、中棉所24、冀合321、中棉所41或中棉所45。
上述培养的条件为：温度28-30℃、光照强度2000-4000lx、培养时间20-30天。
本发明的方法可以部分替代再生苗的无菌培养。棉花再生苗在嫁接或生根定植前，国内外均采用无菌培养，需要对培养基灭菌处理，并且45天左右要更换培养基，浪费财力人力。本发明用的基质不用无菌处理，扦插后基质可以保持70-80天，当70-80天后湿度低到影响再生苗生长时，可以视实际情况添加MS培养液(pH＝5.8-6.5)、1/2MS溶液(pH＝5.8-6.5)或自来水，而不需要定期更换培养基质。即使2-3个月仍然不生根的个别再生苗，也能在基质中生长良好而不死亡，因此可以替代再生苗的无菌培养，从而节约人力和物力成本。
本发明是将棉花再生苗不经过生根培养，将不带根系的再生棉直接扦插到基质中，让再生棉生根定植的新方法。实验证实：中091、中棉所24或冀合321等棉花用本发明提供的方法进行生根，生根率可达70-90％。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1、棉花生根苗的获得
一、待生根棉花材料的获得
1、待生根苗的获得
将中091、中棉所24、冀合321(均通过中国农业科学院棉花研究所科贸公司购买)进行组培，得到再生苗(也即待生根苗)。
组织培养步骤是：将种子剥去种壳，留下种仁，将种仁用0.1％的升汞灭菌3-5分钟，然后种到无菌苗培养基上，获得无菌苗；将苗龄5-7天的无菌苗下胚轴切成0.5厘米左右的切段，作为外植体，接到愈伤组织诱导培养基上诱导愈伤组织，45-50天后将愈伤组织转到分化培养基上，约60天，可获得大量胚性愈伤组织；将胚性愈伤组织转接到胚性愈伤增殖培养基上，约60天，可获得胚状体；将胚状体转接到胚状体萌发成苗培养基上，45天转接一次，经3次转接可获得再生苗，用于扦插生根。各阶段的培养基是：
(1)无菌苗培养基：MS培养基的大量元素+25g·L-1蔗糖+2.5g·L-1Gel，加自来水定容到1L。
(2)愈伤组织诱导培养基：MSB培养基附加IAA、KT、2，4-D各0.1mg·L-1，并附加25g·L-1的葡萄糖，2g·L-1Gel，pH＝6.5。
(3)分化培养基：MSB+0.05mg·L-1IAA+0.15mg·L-1KT+25g·L-1葡萄糖+2.5g·L-1Gel，pH＝6.5。
(4)胚性愈伤增殖培养基：MSB培养基，激素用量为0.1mg·L-1KT+0.15mg·L-16-BA，pH＝6.8。
(5)胚状体萌发成苗培养基：MSB培养基附加0.1mg·L-1KT+0.2mg·L-16-BA+25g·L-1蔗糖+2.5g·L-1Gel，pH＝6.8。
MSB培养基的溶剂是水，溶质的组成见表2。
表2.MSB培养基的溶质
组织培养条件是：A：将无菌苗培养基加到20×200mm的试管中，每试管约加5ml培养基，并在121℃、1.1kg·cm-2的压力下高温高压灭菌14min。室温冷却后接种4-5粒灭菌后的种子，均置于28±2℃，人工光照强度1800～2000Lx，每天光照培养14小时、暗培养10小时的条件下进行培养。B：培养基分装在100ml三角瓶中，每瓶60ml。各组织培养阶段所有激素在灭菌前加入培养基中，培养基灭菌前，用1N KOH将pH值调至合适范围，并在121℃、1.1kg·cm-2的压力下高温高压灭菌14min。所有培养物均置于28±2℃，人工光照强度1800～2000Lx，每天光照培养14小时、暗培养10小时的条件下进行培养。
2、待生根棉花材料的获得
1)将步骤1得到的待生根苗的基部用刀片切成1-2厘米长的楔型，得到基部带有楔型的待生根苗。这样有利于增大创伤面积，加大生根面。
2)将步骤1)得到的基部带有楔型的待生根苗的基部浸泡在促进生根的激素溶液中12小时，得到待生根的棉花材料。促进生根的激素溶液为：在MS1无机盐溶液中添加IAA和KT，使IAA的终浓度为12mg/L、KT的终浓度为3mg/L(pH＝6.0)，其中MS1无机盐溶液的溶剂是水，溶质的组成见表1。
二、棉花生根苗的获得及其生根率统计
1、棉花生根苗的获得
1)生根培养基的制备
a.在MS1无机盐溶液中添加IAA，使IAA的终浓度为12mg/L，调节pH＝6.0，得到生根的培养液，其中MS1无机盐溶液的溶剂是水，溶质的组成见表1。
b.将步骤a获得的培养液与大分子保水剂(北京汉力淼新技术有限公司的2101L号保水剂)混合，其比例是每2升培养液加大分子保水剂2.2g，将保水剂充分吸水(约浸泡10-15小时)，得到保水剂与剩余溶液的混合物。
c.将保水剂与剩余溶液的混合物(混合物的体积也即培养液和保水剂混合后的总体积)注入干燥的蛭石中，所述培养液和保水剂混合后的体积与所述基质的体积的比为1∶1.2，搅拌均匀，制备得到生根培养基质。
配制过程中注意：生根培养基湿度不能过高，过高容易造成再生苗基部水浸状坏死，从而使整个植株死亡。
2)棉花生根苗的获得
将生根培养基放入深20厘米的塑料盘中，厚度为4厘米。再将步骤一的步骤2的步骤2)得到的待生根的棉花材料插入生根培养基中，上面用透光性好的玻璃板盖好，密封程度以早晨能见到玻璃板上有露珠为佳。在28-30℃的组织培养架上用人工光照培养，光照强度为3000lx、光暗培养周期为14/10小时。20天后，再生苗陆续有根生出；40天后，可逐渐通风炼苗；经一周炼苗后，就可以在自然条件下生长，也可以定植到花盆中。
3)生根率的统计
实验重复3次，到60天后，统计在自然光下棉花再生苗的成活率(见表3)。
表3：不同材料再生苗扦插生根成活率
一、待生根棉花材料的获得
1、待生根苗的获得
将中091、中棉所24、冀合321进行组培，得到再生苗(也即待生根苗)。
其中组培的步骤是：与实施例1中组培的步骤相同。
2、待生根棉花材料的获得
1)将步骤1得到的待生根苗的基部用刀片切成1-2厘米长的楔型，得到基部带有楔型的待生根苗。这样有利于增大创伤面积，加大生根面。
2)将步骤1)得到的基部带有楔型的待生根苗的基部浸泡在促进生根的激素溶液中12小时，得到待生根的棉花材料。促进生根的激素溶液为：在MS1无机盐溶液中添加IAA、KT，使IAA的终浓度为15mg/L、KT的终浓度为5mg/L(pH＝5.8)。
二、棉花生根苗的获得及其生根率统计
1、棉花生根苗的获得
1)生根培养基的制备
a.在MS1无机盐溶液中添加IAA，使IAA的终浓度为15mg/L，调节pH＝5.8，得到生根的培养液；
b.将步骤a获得的培养液与大分子保水剂(北京汉力淼新技术有限公司的2101L号保水剂)混合，其比例是每2升培养液加大分子保水剂2.0g，将保水剂充分吸水(约浸泡10-15小时)，得到保水剂与剩余溶液的混合物；
c.将保水剂与剩余溶液的混合物(混合物的体积也即培养液和保水剂混合后的总体积)倒入干燥的蛭石中，所述培养液和保水剂混合后的体积与所述基质的体积的比为1∶1，搅拌均匀，制备得到生根培养基。
配制过程中注意：生根培养基湿度不能过高，过高容易造成再生苗基部水浸状坏死，从而使整个植株死亡。
2)棉花生根苗的获得
将生根培养基放入深15厘米的塑料盘中，厚度为3厘米。再将步骤一的步骤2的步骤2)得到的待生根的棉花材料插入生根培养基中，上面用透光性好的玻璃板盖好，密封程度以早晨能见到玻璃板上有露珠为佳。在28-30℃的组织培养架上用人工光照培养，光照强度为2000lx、光暗培养周期为14/10小时。20天后，再生苗陆续有根生出；40天后，可逐渐通风炼苗；经一周炼苗后，就可以在自然条件下生长，也可以定植到花盆中。
3)生根率的统计
实验重复3次，到60天后，统计在自然光下棉花再生苗的成活率(见表4)。
表4：不同材料再生苗扦插生根成活率
实施例3、棉花生根苗的获得
一、待生根棉花材料的获得
1、待生根苗的获得
大田中棉花的带生长点或潜伏芽的果枝或营养枝均可作为实验材料，本实施例中用的材料是将大田棉花的果枝截成带有一个潜伏芽的小段，长约5-10cm，并保留1片叶片，作为待生根苗。
本实验用的棉花品种是中棉所41、中棉所45(中国农业科学院棉花研究所科贸公司出售)。
2、待生根棉花材料的获得
1)将步骤1得到的待生根苗的基部用刀片切成1-2厘米长的楔型，得到基部带有楔型的待生根苗。这样有利于增大创伤面积，加大生根面。
2)将步骤1)得到的基部带有楔型的待生根苗的基部浸泡在促进生根的激素溶液中12小时，得到待生根的棉花材料。促进生根的溶液为：在MS1无机盐溶液中添加IAA和KT，使IAA的终浓度为20mg/L、KT的终浓度为8mg/L(pH＝6.5)。
二、棉花生根苗的获得及其生根率统计
1、棉花生根苗的获得
1)生根培养基的制备
a.在MS1无机盐溶液中添加IAA，使IAA的终浓度为20mg/L，调节pH＝6.5，得到生根的培养液；
b.将步骤a获得的培养液与大分子保水剂(北京汉力淼新技术有限公司的2101L号保水剂)混合，其比例是每2升培养液加大分子保水剂2.5g，将保水剂充分吸水(约浸泡10-15小时)，得到保水剂与剩余溶液的混合物；
c.将保水剂与剩余溶液的混合物(混合物的体积也即培养液和保水剂混合后的总体积)倒入干燥的蛭石中，所述培养液和保水剂混合后的体积与所述基质的体积的比为1∶1.5，搅拌均匀，制备得到生根培养基。
配制过程中注意：生根培养基湿度不能过高，过高容易造成再生苗基部水浸状坏死，从而使整个植株死亡。
2)棉花生根苗的获得
将生根培养基放入深25厘米的塑料盘中，厚度为5厘米。再将步骤一的步骤2的步骤2)得到的待生根的棉花材料插入生根培养基中，上面用透光性好的玻璃板盖好，密封程度以早晨能见到玻璃板上有露珠为佳。在28-30℃的组织培养架上用人工光照培养，光照强度为2000lx、光暗培养周期为14/10小时。20天后，再生苗陆续有根生出；40天后，可逐渐通风炼苗；经一周炼苗后，就可以在自然条件下生长，也可以定植到花盆中。
3)生根率的统计
实验重复3次，到60天后，统计在自然光下棉花再生苗的成活率(见表5)。
表5：不同材料再生苗扦插生根成活率
Claims (10)
1.一种生根培养基，是由培养液、保水剂和起支撑作用的基质组成；所述培养液是在MS1无机盐溶液中添加IAA得到的混合溶液，所述混合溶液中IAA的终浓度为12-20mg/L，所述MS1无机盐溶液溶剂是水，溶质的组成如下：
所述培养液与保水剂的配比是2L∶(2.0-2.5)g；所述培养液和保水剂混合后的体积与所述基质的体积的比为1∶(1-1.5)。
2.如权利要求1所述的生根培养基，其特征在于：所述IAA的终浓度为15mg/L。
3.如权利要求1或2所述的生根培养基，其特征在于：所述起支撑作用的基质为蛭石、珍珠岩或膨胀陶粒。
4.一种诱导棉花生根的方法，是将待生根的棉花材料置于权利要求1-3任一所述的生根培养基中培养。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述待生根的棉花材料是通过将待生根苗浸泡在促进生根的激素溶液中10-20小时后得到的材料；所述促进生根的激素溶液是在MS1无机盐溶液中添加IAA和KT得到的溶液，所述激素溶液中IAA的终浓度是12-20mg/L、KT的终浓度3-8mg/L，所述MS1无机盐溶液溶剂是水，溶质的组成如下：
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述激素溶液中，IAA的终浓度是15mg/L、KT的终浓度5mg/L。
7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述待生根苗是如下a)或b)：
a)将棉花通过组织培养得到的组培苗；
b)没有经过组织培养的至少带一个生长点或潜伏芽的营养体。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述待生根苗是大田棉花的至少带一个生长点或潜伏芽的果枝或营养枝。
9.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述棉花为中091、中棉所24、冀合321、中棉所41或中棉所45。
10.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述培养的条件为：温度28-30℃、光照强度2000-4000lx、培养时间20-30天。
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