CN108575751B - 棉花胚性愈伤组织与胚状体的培养方法 - Google Patents

棉花胚性愈伤组织与胚状体的培养方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108575751B
CN108575751B CN201810409355.4A CN201810409355A CN108575751B CN 108575751 B CN108575751 B CN 108575751B CN 201810409355 A CN201810409355 A CN 201810409355A CN 108575751 B CN108575751 B CN 108575751B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cotton
callus
culturing
light
solute
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201810409355.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108575751A (zh
Inventor
李付广
于娅
张朝军
王晔
杨召恩
葛晓阳
秦文强
王鹏
王玉芬
李艺
杨作仁
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Original Assignee
Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences filed Critical Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority to CN201810409355.4A priority Critical patent/CN108575751B/zh
Publication of CN108575751A publication Critical patent/CN108575751A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108575751B publication Critical patent/CN108575751B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/001—Culture apparatus for tissue culture
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/008—Methods for regeneration to complete plants

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了棉花胚性愈伤组织与胚状体的培养方法。本发明公开的棉花胚性愈伤组织的培养方法，包括：将棉花外植体于红光下培养，得到棉花愈伤组织；愈伤组织为胚性愈伤组织；红光的光量子通量密度为40‑65μmol/m2.s；所用培养基由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及在培养基中的浓度分别为IAA 0.02mg/L，KT 0.06mg/L，蔗糖30g/L，Gelrite 2g/L，MgCl2 0.5g/L，pH 5.8。本发明的方法，可以对棉花各个时期进行精确调控，可以大幅度的提高各个时期的分化效率，缩短分化周期，极大的提高了棉花再生体系的效率，为棉花遗传转化方法提高了转化效率。

Description

棉花胚性愈伤组织与胚状体的培养方法
技术领域
本发明涉及生物技术组织培养领域中，棉花胚性愈伤组织与胚状体的培养方法。
背景技术
棉花的高效再生体系对于棉花遗传转化和生物技术研究至关重要，而棉花再生体系中，胚性愈伤组织的分化和正常胚状体发育是其再生的主要两个瓶颈，现在的培养体系中，胚性愈伤组织分化耗时长，一般需要2个月以上的时间；且胚性愈伤组织状态不均一，大小颜色差异比较大。胚状体发育阶段存在的问题是，胚状体分化时间长，一般需要3个月以上的继代，胚状体分化才达50％；且畸形胚偏多，常见的畸形胚状体有双生胚状体或多生胚状体、玻璃化胚、子叶畸形胚；白化胚状体等。畸形胚一般都不能发育成正常植株，严重影响了再生植株的再生。
光对植物的生长发育起着重要的调控作用。植物在长期的进化过程中，形成了极其精细的、完善的光感受系统；植物可以感受光的有无、光的方向和质量、光的强度和光周期的长度，以便更好的适应环境。太阳光谱大部分位于300-2600nm，可见光多为380-720nm，而植物的光合的有效辐射是400-700nm，一般波长小于400nm的紫外光及波长700-800nm远红光不能直接作用于光合作用，却作为一种环境信号来调节植物的生长发育进程和代谢。因此，光照不仅作为一种能源，控制着光合作用；还作为一种触发信号影响着植物的生长发育，即光形态建成。
植物组织培养需要可控光源，传统的光源主要是荧光灯，大部分能量会变成热能，增加了温控系统的负担；而LED光源为冷光源，可近距离补光，光能利用效率高达80％-90％。合理的光源配制使得波长与植物光合作用及形态建成需光谱范围一致，这样能够极大的缩短植物组织培养时间，提高再生效率。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何提高棉花再生效率，即如何提高棉花愈伤组织和棉花胚状体的获得率。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了棉花愈伤组织的培养方法，所述方法包括：将棉花外植体于红光下培养，得到棉花愈伤组织。
上述棉花愈伤组织的培养方法中，所述愈伤组织可为胚性愈伤组织。
上述棉花愈伤组织的培养方法中，所述红光的光量子通量密度可为40-65μmol/m2.s。所述红光的光量子通量密度具体可为60-65μmol/m2.s。
上述棉花胚性愈伤组织的培养方法中，所述培养所用培养基(将其记为培养基1)由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质及在所述培养基中的浓度分别为IAA0.005-0.02mg/L，KT 0.03-0.06mg/L，蔗糖15-30g/L，Gelrite 2g/L，MgCl2 0.3-0.5g/L，pH 5.6-5.8。所述培养基1中所述溶质的浓度具体可为IAA 0.02mg/L，KT 0.06mg/L，蔗糖30g/L，Gelrite 2g/L，MgCl2 0.5g/L，pH 5.8。
上述棉花愈伤组织的培养方法中，所述外植体可为下胚轴或叶柄。
上述棉花愈伤组织的培养方法中，所述培养可在温度为25-28℃的环境中进行。所述培养可在湿度不超过70％的环境(如湿度为60-70％的环境)中进行。
本发明还提供了棉花胚状体的培养方法，所述方法包括：利用所述棉花愈伤组织的培养方法得到愈伤组织；将所述愈伤组织在红光下进行培养，得到棉花胚状体。
上述棉花胚状体的培养方法中，所述愈伤组织可为胚性愈伤组织。
上述棉花胚状体的培养方法中，所述红光的光量子通量密度可为40-65μmol/m2.s。所述红光的光量子通量密度具体可为60-65μmol/m2.s。所述愈伤组织可为胚性愈伤组织。
上述棉花胚状体的培养方法中，将所述愈伤组织在红光下进行培养所用培养基(将其记为培养基2)由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质及其在所述培养基中的浓度分别为IAA 0.010-0.025mg/L，KT 0.005-0.01mg/L，蔗糖15-30g/L，Gelrite 2g/L。所述培养基2的pH为5.8-6.5。所述培养基2中所述溶质的浓度具体可为IAA 0.025mg/L，KT0.01mg/L，蔗糖30g/L，Gelrite 2g/L。所述培养基2的pH具体可为6.2。
上述棉花胚状体的培养方法中，所述培养可在温度为25-28℃的环境中进行。所述培养可在湿度为不超过70％的环境(如湿度为60-70％的环境)中进行。
在将所述愈伤组织在红光下进行培养的过程中可根据愈伤组织的生长状况进行继代。所述继代的次数可为1-3次，如2次。在所述棉花愈伤组织呈嫩黄色、颗粒状，生长最旺盛时(培养时间约为20-30天)，需要进行继代。
本发明还提供了棉花植株再生的方法，所述方法包括X1)或X2)：
X1)利用所述棉花愈伤组织的培养方法得到棉花愈伤组织，培养所述棉花愈伤组织得到棉花再生植株；
X2)利用所述棉花胚状体的培养方法得到棉花胚状体，培养所述棉花胚状体得到棉花再生植株。
上述方法中，所述培养可在温度为25-28℃的环境中进行。所述培养可在湿度为不超过70％的环境(如湿度为60-70％的环境)中进行。
在本发明的一个实施例中，所述棉花为中棉所24。
本发明具有下述优点：目前国内外的棉花组织培养体系传统的光源主要是荧光灯，大部分能量会变成热能，增加了温控系统的负担；且各个阶段分化率偏低。导致棉花再生体系耗时偏长。本发明建立了棉花光质调控再生体系的方法，可以对棉花各个时期进行精确调控，可以大幅度的提高各个时期的分化效率(如胚性愈伤组织、胚状体等)，缩短分化周期，极大的提高了棉花再生体系的效率，为棉花遗传转化方法提高了转化效率。
附图说明
图1为不同组别胚性愈伤组织的分化情况。60d、50d和40d分别表示培养60天、50天和40天。
图2为不同组别胚性愈伤组织的分化情况。30d、25d和20d分别表示培养30天、25天和20天。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的2号愈伤诱导培养基由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及其浓度分别为IAA 0.02mg/L，KT 0.06mg/L，蔗糖30g/L，Gelrite 2g/L，MgCl2 0.5g/L，pH 5.8。
实施例1、光质可以调控棉花胚性愈伤组织的分化
所用材料：中棉所24
一、外植体的准备
选取棉花脱绒的种子，将其放入0.1％(质量百分比)HgCl2水溶液中浸泡4～5分钟灭菌，之后用灭菌蒸馏水冲洗5遍，以彻底清除残余的HgCl2，得到灭菌种子；将灭菌种子置于无菌苗培养基(MS培养基)中进行培养，得到棉花无菌苗；
二、胚性愈伤组织的分化
1、与白光的比较
取步骤一得到的7天(从种子接入培养基开始计算)棉花无菌苗的下胚轴，将其切成0.5cm长的切段，然后将得到的切段接入2号愈伤诱导培养基中后，每个培养基中接5-6段，间距为均匀，约1cm即可；得到接有切段的愈伤诱导培养基，将其随机分为六组，每组三个培养基，然后在不同光质下进行培养，其余培养条件均相同，为温度25℃±2℃，湿度60％-70％。实验重复三次。不同组所用光质如下：
对照组(白光，荧光灯)：光量子通量密度为40μmol/m2.s。
红光组：只有红光(LED灯)，光量子通量密度为65μmol/m2.s。
3:1组(红蓝＝3:1，LED灯)：红光(R)与蓝光(B)的光量子通量密度比(即PPFD比)为45μmol/m2.s:15μmol/m2.s，即3:1。
1:1组(红蓝＝1:1，LED灯)：红光(R)与蓝光(B)的PPFD比为30μmol/m2.s:30μmol/m2.s，即1:1。
1:3组(红蓝＝1:3，LED灯)：红光(R)与蓝光(B)的PPFD比为15μmol/m2.s:45μmol/m2.s，即1:3。
蓝光组：只有蓝光(LED灯),光量子通量密度为65μmol/m2.s。
分别在培养40、50和60天(d)时统计胚性愈伤组织的分化率，胚性愈伤组织的分化率＝分化成胚性愈伤组织的切段数/总切段数×100％。结果如图1和表1所示。胚性愈伤组织呈嫩黄色、颗粒状。
表1、不同组别胚性愈伤组织的分化率(％)
组别 培养40天 培养50天 培养60天
对照组 15.8±2.1 26.3±2.4 31.6±1.1
红光组 77.2±3.2 85.3±2.1 94±1.2
3:1组 16.8±2.2 16.8±2.2 16.8±1.0
1:1组 0±0 6.3±1.1 6.6±0.5
1:3组 4.2±1.1 21.1±2.2 21.8±1.1
蓝光组 0±0 7.3±1.0 7.7±0.6
结果显示，光质对棉花胚性愈伤组织的影响有着重要的影响。红光能显著促进棉花胚性愈伤组织的分化，不仅能缩短分化时间，还可以提高分化率，在培养40、50和60天时的胚性愈伤组织的分化率均显著高于其他各组。表明，可以利用红光提高棉花胚性愈伤组织的分化率。
2、与白光与黑暗的比较
按照步骤1的方法，将接有切段的愈伤诱导培养基，随机分为四组，每组三个培养基，然后在不同光质下进行培养，其余培养条件均相同，为温度25℃±2℃，湿度不超过65％。实验重复三次。不同组所用光质如下：
对照组(White)：白光，荧光灯，光量子通量密度为40μmol/m2.s。
红光组(Red)：只有红光(LED灯)，光量子通量密度为65μM/m2.s。
蓝光组(Blue)：只有蓝光(LED灯),光量子通量密度为65μM/m2.s。。
黑暗组(Dark)：黑暗下，无光。
分别在培养20、25和30天(d)时统计胚性愈伤组织的分化率，胚性愈伤组织的分化率＝分化成胚性愈伤组织的切段数/总切段数×100％。结果如图2和表2所示。
表2、不同组别胚性愈伤组织的分化率(％)
组别 培养20天 培养25天 培养30天
对照组 1.1±1.0 11.6±2.1 35.6±1.0
红光组 5.3±1.1 30.9±1.5 78.8±2.1
蓝光组 0±0 0±0 5.4±1.0
黑暗组 0±0 7.4±1.0 11.9±1.6
结果显示，红光能显著促进棉花胚性愈伤组织的分化。
实施例2、光质可以调控棉花胚状体的分化与成苗
1、胚状体的分化
选取实施例1中得到的质地基本相同的胚性愈伤组织置于MSB培养基(该培养基由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及其浓度分别为IAA 0.025mg/L，KT 0.01mg/L，蔗糖30g/L，Gelrite 2g/L，pH 6.2，每个培养基中接50mg，均匀平铺接种，间距约5-8mm；得到接有愈伤组织的培养基，将其随机分为两组，每组三个培养基，然后在不同光质下进行培养，其余培养条件均相同，为温度25±2℃，湿度65％。实验重复三次。20-25天继代一次，一般继代2-3次。继代条件为：在胚性愈伤组织呈现嫩黄色、颗粒状(培养时间约为20-30天时)，需要进行继代。不同组所用光质如下：
对照组(White)：白光，荧光灯，光量子通量密度为40μmol/m2.s。
红光组(Red)：只有红光(LED灯)，光量子通量密度为65μM/m2.s。
在继代时统计胚状体的分化率，胚状体的分化率＝分化成胚状体的愈伤组织数/愈伤组织团×100％。结果如表3所示。
表3、不同组别胚状体的分化率(％)
Figure BDA0001647570170000051
结果显示，红光能够促进胚状体的增殖和分化，能够使胚性愈伤组织分化为胚状体的时间缩短，可以缩短1个月。白光下，胚性愈伤组织需要经历三次的继代，3个月的时间，才能有50％的胚状体分化出来。而红光下，胚性愈伤组织的继代时间缩短，一般15天左右需要继代，约2个月即可分化出胚状体，分化率也可以达到70％。

Claims (1)

1.棉花胚状体的培养方法，包括：将胚性愈伤组织在光量子通量密度为40-65µmol/m2.s的红光下进行培养，得到棉花胚状体；培养所用培养基由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质及其在所述培养基中的浓度分别为IAA 0.010-0.025mg/L，KT 0.005-0.01mg/L，蔗糖 15-30 g/L，Gelrite 2 g/L，pH 5.8-6.5；
所述胚性愈伤组织按照包括如下步骤的方法培养：将棉花下胚轴或叶柄于光量子通量密度为40-65µmol/m2.s的红光下培养，得到棉花胚性愈伤组织；所述述培养所用培养基由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质及在所述培养基中的浓度分别为IAA 0.005-0.02mg/L，KT 0.03-0.06mg/L，蔗糖 15-30 g/L，Gelrite 2 g/L，MgCl2 0.3-0.5 g/L，pH5.6-5.8；所述培养在温度为25-28℃的环境中进行；所述培养在湿度不超过70%的环境中进行。
CN201810409355.4A 2018-05-02 2018-05-02 棉花胚性愈伤组织与胚状体的培养方法 Active CN108575751B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810409355.4A CN108575751B (zh) 2018-05-02 2018-05-02 棉花胚性愈伤组织与胚状体的培养方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810409355.4A CN108575751B (zh) 2018-05-02 2018-05-02 棉花胚性愈伤组织与胚状体的培养方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108575751A CN108575751A (zh) 2018-09-28
CN108575751B true CN108575751B (zh) 2021-08-20

Family

ID=63620411

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810409355.4A Active CN108575751B (zh) 2018-05-02 2018-05-02 棉花胚性愈伤组织与胚状体的培养方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108575751B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115777538B (zh) * 2022-12-07 2023-08-29 河北省农林科学院棉花研究所（河北省农林科学院特种经济作物研究所） 一种棉花短周期培育方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1864477A (zh) * 2006-06-27 2006-11-22 中国农业科学院棉花研究所 棉花叶柄组织培养与高分化率材料选育方法
CN106305415A (zh) * 2016-07-18 2017-01-11 山西省农业科学院棉花研究所 一种棉花愈伤快速诱导增殖的处理方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1864477A (zh) * 2006-06-27 2006-11-22 中国农业科学院棉花研究所 棉花叶柄组织培养与高分化率材料选育方法
CN106305415A (zh) * 2016-07-18 2017-01-11 山西省农业科学院棉花研究所 一种棉花愈伤快速诱导增殖的处理方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN108575751A (zh) 2018-09-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102577959B (zh) 巫山淫羊藿的组培快繁方法和繁育的巫山淫羊藿
CN105075863B (zh) 一种紫斑牡丹快速繁殖方法
Marsolais et al. The influence of anther cold pretreatments and donor plant genotypes on in vitro androgenesis in wheat (Triticum aestivum L.)
CN105475137A (zh) 一种兼顾荷花增殖与生根的组培方法
CN110476818B (zh) 一种物理辅促油桐带芽茎段再生植株的方法
CN103798140B (zh) 显著提高野生百合胚性愈伤组织继代增殖率的培养方法
CN108575751B (zh) 棉花胚性愈伤组织与胚状体的培养方法
CN102511391B (zh) 风信子离体快速繁殖方法
CN106857251A (zh) 一种闽楠体细胞胚及不定芽诱导方法
CN110476807B (zh) 一种建立油用牡丹‘凤丹’成熟种胚无菌培养体系的方法
CN115633640B (zh) 一种美人蕉试管苗叶鞘不定芽再生的方法及其应用
CN109526745B (zh) 一种以七叶一枝花叶片繁殖种苗的方法
CN103125392A (zh) 一种铁皮石斛无菌子播超快繁殖方法
CN111557243B (zh) 一种岩青兰的组织培养方法及其应用
KR20080073388A (ko) 체세포배 세포 급속증식을 이용한 나리류의 자구 대량생산방법
CN110024694B (zh) 一种快速诱导花生幼叶再分化形成不定芽的方法
CN102934613A (zh) 利用60Co r射线辐射诱变红叶石楠体细胞育种的方法
CN102577978A (zh) 一种绿棉胚性愈伤组织的诱导和培养方法
CN103563740B (zh) 一种利用百合根诱导愈伤组织及胚状体的方法
CN101147467A (zh) 提高草坪草胚性愈伤组织诱导率的方法
CN104920210A (zh) 一种简易高效的牡丹试管苗生根方法
CN117796323B (zh) 一种橡胶树三倍体无性系品种体胚植株的培育方法
CN116616179B (zh) 一种高栀子苷含量的江栀子优良无性系的组培快繁方法
CN109744146B (zh) 一种杉木组培苗瓶内生根方法
CN116472964B (zh) 一种桉树分化培养基及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant