CN104719169B - 一种高效地诱导粳稻花药培养的诱导培养基配方 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种高效地诱导粳稻花药培养的诱导培养基，该培养基的配方由一定比例的KNO3、(NH4)2SO4、KH2PO4、CaCl2∙2H2O、MgSO4∙7H2O、Na2‑EDTA、FeSO4∙7H2O、MnSO4∙4H2O、ZnSO4∙7H2O、H3BO3、KI、丙三醇、二水柠檬酸钠、叶酸、甘氨酸、丙氨酸、赖氨酸、维生素B1、维生素B6、烟酸、氯化2‑羟乙基三甲铵、蔗糖、植物凝胶、2，4‑D、NAA、复酞核酸、水解蛋白、活性炭、牛磺酸、生物素和植物硫化激动素PSKα所组成。本发明所述的培养基具有高效率地诱导粳稻花药愈伤组织、降低褐化的优点，可以大幅度地提高粳稻花药培养效率。
Description
技术领域
本发明涉及一种粳稻花药培养培养基配方，具体涉及一种可以显著降低褐化、高效率地诱导粳稻花药诱导培养的培养基配方，属于农业科学技术领域。
背景技术
花药是植物的雄性器官，花药培养是利用植物组织培养技术，把发育到一定阶段的花药。通过无菌操作接种在培养基上，在一系列条件诱导下改变花药的发育程序，进行有丝分裂，经过脱分化后形成细胞团，进而形成愈伤组织，经历再分化发育成完整的单倍体植株的过程。
1964年，印度德里大学的两位植物学家Guha和Maheshwari发现，他们培养的毛叶曼陀罗花药中长出的胚状体是来源于花粉的单倍体植株。1968年，日本的Niizeki和Oono通过花药培养得到了单倍体水稻植株。随着研究的不断深入，花药培养技术逐步得以进步，并应用于水稻遗传育种。
水稻花药培养育种是育种学发展的趋势之一，它集成了杂交育种、诱变育种、细胞学、遗传学等各种生物科学的内容。利用花药培养可以明显的加快育种进程、缩短育种年限。花药培养形成的单倍体植株加倍后每个基因均以纯合体的形式存在，各种优良和不良的性状在早期世代表现出来，便于进行筛选和淘汰。
我国水稻花药培养技术研究始于20世纪70年代，在水稻育种研究中得到了不断的改良和完善，花药培养的效率得以提高，也带动了其他作物的花药培养的进度，有大量通过利用该技术培育出的籼粳稻品种已经通过了审定，并且得到了大面积的推广。自1975年中国科学院北京植物研究所、黑龙江省农业科学院作物育种研究所和松花江地区农业科学研究所水稻实验站组成的单倍体育种协作组首次育成粳稻品种“单丰1号”以及1976年中国科学院遗传所和天津市农科所育成了“花育1号”和“花育2号”以来，我国实现了花培育种从理论到应用的突破，也促进了国内外的花培育种技术的发展。常规育种与花药培养技术结合起来育成了大量水稻新品种通过审定，比较有代表性的有20世纪8O年代的中国农科院的“中花”系列，其中中花8号、中花9号和中花10号年种植面积曾达到2万hm。90年代的江西农科院选育的“赣籼”系列，黑龙江省农业科学院水稻研究所选育出了龙粳系列品种，2000年后又有不同的中花品种和龙粳品种被成功选育。经过30多年来全国各地育种研究队伍的潜心研究，目前我国已有一大批通过花培育种的品种产生，并且大面积推广应用。随着花药培养的遗传特性、生理生化等不断深入研究，现在水稻花药培养已经成为当今生物技术育种中较为实用、有效的育种新技术，我国水稻花药培养育种的应用研究在国际上一直保持领先地位。
从品种选育的角度看，花药培养获得的再生植株越多，获得优良基因型的概率越大。水稻的生长发育是由自身基因与环境因素共同决定的，由于受培养基组分、材料的差异性以及培养环境等的影响，目前花培效率还不够理想，获得的再生植株群体小，花培后代的表现型不充足，这使选择、利用受到较大的限制。提高花药培养的诱导频率和花培绿苗频率，增大花培后代的群体，是水稻花培技术在遗传育种上扩大应用的前提和基础。为此，仍然需要进行不懈的努力。
培养基是花药培养的物质基础，直接关系到培养物的生长与分化，培养基组分是影响花培效率的一个很重要的因素。培养基各组分的合适用量，以及它们之间一定的组合关系，可导致花培效率的大幅度提高。继续筛选和优化基本培养基，提高培养基选用的针对性，是提高花药培养力的有效措施；大量的研究发现一些有机附加物可以显著提高花药培养力，发现和优化组合花药培养有机附加物质，可进一步提高花药培养力。
水稻花药培养的过程需要进行三个步骤：诱导培养，即将花药剥离在诱导培养基上先脱分化诱导出花药愈伤组织；分化培养，即将花药愈伤组织转移到分化培养基上再分化生出具有根和芽的绿苗的过程；继代培养，即将分化出的幼小植株转移至继代培养基上生长成健壮植株的过程。其中，花药诱导培养是水稻花药培养过程的重点也是难点，水稻花药愈伤组织诱导的频率和质量直接决定着花药培养的成败，因此，组合和优化培养基组分，摸索出高效的水稻花药诱导培养基配方是提高花药培养诱导频率的关键。
通过多年粳稻花药培养的摸索和实践，我们进一步优化了基本培养基配方，并且不断尝试加入一些提高粳稻药诱导力的有机添加物并组合其种类搭配及浓度，最终摸索出了一种可以显著降低培养材料和培养基的褐化反应、高效率地诱导粳稻花药诱导培养的培养基配方。我们的研究结果对于进一步推广和应用水稻单倍体育种和理论研究无疑有较大的现实意义和实用价值。
发明内容
本发明提供了一种高效地诱导粳稻花药培养的诱导培养基，其特征在于该培养基的配方如下：
KNO3 2200～2600mg/L，(NH4)2SO4 370～430mg/L，KH2PO4 330～370mg/L，CaCl2∙2H2O 130～150mg/L，MgSO4∙7H2O 150～170mg/L，Na2-EDTA 30～35mg/L，FeSO4∙7H2O 22～26mg/L，MnSO4∙4H2O 3.6～4.2mg/L，ZnSO4∙7H2O 1.2～1.4mg/L，H3BO3 1.3～1.5mg/L，KI0.6～0.7mg/L，丙三醇 6～7mg/L，二水柠檬酸钠 0.45～0.55mg/L，叶酸 0.45～0.55mg/L，甘氨酸 2.7～3.3mg/L，丙氨酸 2.2～2.8mg/L，赖氨酸 1.8～2.2mg/L，维生素B1 1.8～2.2mg/L，维生素B6 0.9～1.1mg/L，烟酸 0.9～1.1 mg/L，氯化2-羟乙基三甲铵 220～280mg/L，蔗糖 50～60g/L，植物凝胶 5～6g/L；
2，4-D 3.6～4.4mg/L，NAA 3.6～4.4mg/L，复酞核酸0.45～0.55mg/L，水解蛋白0.45～0.55g/L，活性炭 2.5～3.0g/L，牛磺酸 0.07～0.08mg/L，生物素 0.07～0.08mg/L，植物硫化激动素PSKα 27～33pmol/L，pH 5.8-6.0。
本发明所述的培养基具有高效率地诱导粳稻花药愈伤组织、降低褐化的优点，可以大幅度地提高粳稻花药培养效率。下面的实施例以及对比实验可以清楚地反映本发明所述培养基的特点。
具体实施方式
实施例1
配制如下配方的培养基：
KNO3 2400mg/L，(NH4)2SO4 400mg/L，KH2PO4 350mg/L，CaCl2∙2H2O 140mg/L，MgSO4∙7H2O 160mg/L，Na2-EDTA 32.5mg/L，FeSO4∙7H2O 24mg/L，MnSO4∙4H2O 3.9mg/L，ZnSO4∙7H2O1.3mg/L，H3BO3 1.4mg/L，KI 0.65mg/L，丙三醇 6.5mg/L，二水柠檬酸钠 0.5mg/L，叶酸0.5mg/L，甘氨酸 3.0mg/L，丙氨酸 2.5mg/L，赖氨酸 2.0mg/L，维生素B1 2.0mg/L，维生素B6 1mg/L，烟酸 1mg/L，氯化2-羟乙基三甲铵 250mg/L，蔗糖 55g/L，植物凝胶 5.5g/L；
2，4-D 4.0mg/L，NAA 4.0mg/L，复酞核酸0.5mg/L，水解蛋白 0.5g/L，活性炭2.75g/L，牛磺酸 0.075mg/L，生物素 0.075mg/L，植物硫化激动素PSKα 30pmol/L，pH 5.9。
选取粳稻品种通科粳和黑壳紫粳作为花药培养花药供体，采集单核晚期花药作为供试材料，表面消毒后，4℃下低温预处理3天。预处理后，外植体灭菌（0.1%升汞溶液，15min），抖药法接种花药于该诱导培养基中诱导愈伤组织，每个三角瓶接种50枚花药，在温度为28℃、湿度为60%-70%的环境下暗培养。愈伤组织形成后（长到2mm左右），计算愈伤组织诱导率。
实施例2
配制如下配方的培养基（丙氨酸添加浓度的优选）：
KNO3 2400mg/L，(NH4)2SO4 400mg/L，KH2PO4 350mg/L，CaCl2∙2H2O 140mg/L，MgSO4∙7H2O 160mg/L，Na2-EDTA 32.5mg/L，FeSO4∙7H2O 24mg/L，MnSO4∙4H2O 3.9mg/L，ZnSO4∙7H2O1.3mg/L，H3BO3 1.4mg/L，KI 0.65mg/L，丙三醇 6.5mg/L，二水柠檬酸钠 0.5mg/L，叶酸0.5mg/L，甘氨酸 3.0mg/L，赖氨酸 2.0mg/L，维生素B1 2.0mg/L，维生素B6 1mg/L，烟酸1mg/L，氯化2-羟乙基三甲铵 250mg/L，蔗糖 55g/L，植物凝胶 5.5g/L；
2，4-D 4.0mg/L，NAA 4.0mg/L，复酞核酸0.5mg/L，水解蛋白 0.5g/L，活性炭2.75g/L，牛磺酸 0.075mg/L，生物素 0.075mg/L，植物硫化激动素PSKα 30pmol/L，pH 5.9。
丙氨酸的添加浓度设置以下10种：0；0.5 mg/L；1 mg/L；1.5 mg/L；2 mg/L；3mg/L；3.5 mg/L；4 mg/L，5 mg/L；8 mg/L。
同样选取该两个粳稻品种作为花药供体，操作方法、培养方法同实施例1，计算愈伤组织诱导率。
实施例3
配制如下配方的培养基（凝固剂的优选）：
KNO3 2400mg/L，(NH4)2SO4 400mg/L，KH2PO4 350mg/L，CaCl2∙2H2O 140mg/L，MgSO4∙7H2O 160mg/L，Na2-EDTA 32.5mg/L，FeSO4∙7H2O 24mg/L，MnSO4∙4H2O 3.9mg/L，ZnSO4∙7H2O1.3mg/L，H3BO3 1.4mg/L，KI 0.65mg/L，丙三醇 6.5mg/L，二水柠檬酸钠 0.5mg/L，叶酸0.5mg/L，甘氨酸 3.0mg/L，丙氨酸 2.5mg/L，赖氨酸 2.0mg/L，维生素B1 2.0mg/L，维生素B6 1mg/L，烟酸 1mg/L，氯化2-羟乙基三甲铵 250mg/L，蔗糖 55g/L；
2，4-D 4.0mg/L，NAA 4.0mg/L，复酞核酸0.5mg/L，水解蛋白 0.5g/L，活性炭2.75g/L，牛磺酸 0.075mg/L，生物素 0.075mg/L，植物硫化激动素PSKα 30pmol/L，pH 5.9。
凝固剂设置为以下2种：植物凝胶 2.75g/L，琼脂 3.5g；琼脂 7g。
同样选取该两个粳稻品种作为花药供体，操作方法、培养方法同实施例1，计算愈伤组织诱导率。
实施例4
配制如下配方的培养基（氯化2-羟乙基三甲铵添加浓度的优选）：
KNO3 2400mg/L，(NH4)2SO4 400mg/L，KH2PO4 350mg/L，CaCl2∙2H2O 140mg/L，MgSO4∙7H2O 160mg/L，Na2-EDTA 32.5mg/L，FeSO4∙7H2O 24mg/L，MnSO4∙4H2O 3.9mg/L，ZnSO4∙7H2O1.3mg/L，H3BO3 1.4mg/L，KI 0.65mg/L，丙三醇 6.5mg/L，二水柠檬酸钠 0.5mg/L，叶酸0.5mg/L，甘氨酸 3.0mg/L，丙氨酸 2.5mg/L，赖氨酸 2.0mg/L，维生素B1 2.0mg/L，维生素B6 1mg/L，烟酸 1mg/L，蔗糖 55g/L，植物凝胶 5.5g/L；
2，4-D 4.0mg/L，NAA 4.0mg/L，复酞核酸0.5mg/L，水解蛋白 0.5g/L，活性炭2.75g/L，牛磺酸 0.075mg/L，生物素 0.075mg/L，植物硫化激动素PSKα 30pmol/L，pH 5.9。
氯化2-羟乙基三甲铵的添加浓度设置为以下10种：0；50；100；150mg/L；200mg/L；300mg/L；350mg/L；400mg/L；450 mg/L，500 mg/L。
同样选取该两个粳稻品种作为花药供体，操作方法、培养方法同实施例1，计算愈伤组织诱导率。
实施例5
配制如下配方的培养基（激素组合以及配比浓度的优选）：
KNO3 2400mg/L，(NH4)2SO4 400mg/L，KH2PO4 350mg/L，CaCl2∙2H2O 140mg/L，MgSO4∙7H2O 160mg/L，Na2-EDTA 32.5mg/L，FeSO4∙7H2O 24mg/L，MnSO4∙4H2O 3.9mg/L，ZnSO4∙7H2O1.3mg/L，H3BO3 1.4mg/L，KI 0.65mg/L，丙三醇 6.5mg/L，二水柠檬酸钠 0.5mg/L，叶酸0.5mg/L，甘氨酸 3.0mg/L，丙氨酸 2.5mg/L，赖氨酸 2.0mg/L，维生素B1 2.0mg/L，维生素B6 1mg/L，烟酸 1mg/L，氯化2-羟乙基三甲铵 250mg/L，蔗糖 55g/L，植物凝胶 5.5g/L；
水解蛋白 0.5g/L，活性炭 2.75g/L，牛磺酸 0.075mg/L，生物素 0.075mg/L，植物硫化激动素PSKα 30pmol/L，pH 5.9。
激素组合以及配比浓度设置为以下两类：
一类含复酞核酸0.5mg/L，2，4D、NAA组合方式设置以下10种：2，4D 1mg/L，NAA4mg/L；2，4D 2mg/L，NAA 4mg/L；2，4D 3mg/L，NAA 4mg/L；2，4D 5mg/L，NAA 4mg/L；2，4D8mg/L，NAA 4mg/L；2，4D 4mg/L，NAA 1mg/L；2，4D 4mg/L，NAA 2mg/L；2，4D 4mg/L，NAA 3mg/L；2，4D 4mg/L，NAA 5mg/L；2，4D 4mg/L，NAA 8mg/L。
二类含2，4-D 4mg/L，NAA 4mg/L，复酞核酸添加浓度设置以下7种：0；0.1 g/L；0.2g/L ；0.3g/L；0.4 g/L；0.6 g/L；0.8 g/L。
同样选取该两个粳稻品种作为花药供体，操作方法、培养方法同实施例1，计算愈伤组织诱导率。
实施例6
配制如下配方的培养基（水解蛋白添加浓度的优选）：
KNO3 2400mg/L，(NH4)2SO4 400mg/L，KH2PO4 350mg/L，CaCl2∙2H2O 140mg/L，MgSO4∙7H2O 160mg/L，Na2-EDTA 32.5mg/L，FeSO4∙7H2O 24mg/L，MnSO4∙4H2O 3.9mg/L，ZnSO4∙7H2O1.3mg/L，H3BO3 1.4mg/L，KI 0.65mg/L，丙三醇 6.5mg/L，二水柠檬酸钠 0.5mg/L，叶酸0.5mg/L，甘氨酸 3.0mg/L，丙氨酸 2.5mg/L，赖氨酸 2.0mg/L，维生素B1 2.0mg/L，维生素B6 1mg/L，烟酸 1mg/L，氯化2-羟乙基三甲铵 250mg/L，蔗糖 55g/L，植物凝胶 5.5g/L；
2，4-D 4.0mg/L，NAA 4.0mg/L，复酞核酸0.5mg/L，活性炭 2.75g/L，牛磺酸0.075mg/L，生物素 0.075mg/L，植物硫化激动素PSKα 30pmol/L，pH 5.9。
水解蛋白添加浓度设置以下7种：0；0.1 g/L；0.2g/L ；0.3g/L；0.4g/L；0.6g/L；0.8g/L。
同样选取该两个粳稻品种作为花药供体，操作方法、培养方法同实施例1，计算愈伤组织诱导率。
实施例7
配制如下配方的培养基（植物硫化激动素PSKα的优选）：
KNO3 2400mg/L，(NH4)2SO4 400mg/L，KH2PO4 350mg/L，CaCl2∙2H2O 140mg/L，MgSO4∙7H2O 160mg/L，Na2-EDTA 32.5mg/L，FeSO4∙7H2O 24mg/L，MnSO4∙4H2O 3.9mg/L，ZnSO4∙7H2O1.3mg/L，H3BO3 1.4mg/L，KI 0.65mg/L，丙三醇 6.5mg/L，二水柠檬酸钠 0.5mg/L，叶酸0.5mg/L，甘氨酸 3.0mg/L，丙氨酸 2.5mg/L，赖氨酸 2.0mg/L，维生素B1 2.0mg/L，维生素B6 1mg/L，烟酸 1mg/L，氯化2-羟乙基三甲铵 250mg/L，蔗糖 55g/L，植物凝胶 5.5g/L；
2，4-D 4.0mg/L，NAA 4.0mg/L，复酞核酸0.5mg/L，水解蛋白 0.5g/L，活性炭2.75g/L，牛磺酸 0.075mg/L，生物素 0.075mg/L，pH 5.9。
植物硫化激动素PSKα添加浓度设置以下7种：0；10pmol/L；20pmol/L；40pmol/L；50pmol/L；60pmol/L；80pmol/L。
同样选取该两个粳稻品种作为花药供体，操作方法、培养方法同实施例1，计算愈伤组织诱导率。
培养基对比实验
将实施例2-6分别与实施例1进行对比，对比的结果如下表所示：
从表1-7可以看出，使用本发明所提供的培养基比使用其它任何对比培养基诱导粳稻花药愈伤组织的效率更高，表明本发明提供的培养基配方是经过大量单因子、多因子试验所筛选的最优组合，多年来我们亦围绕本发明的组合配比做了小范围单因子改变优化组合试验，大量的实验研究亦得出本发明的组分配比是最优的。使用本发明所提供的培养基可以显著降低培养材料和培养基的褐化反应，对粳稻品种通科粳、黑壳紫粳的愈伤组织诱导率高达34.7%和36.2%，充分说明了本发明提供的培养基是一种优良的粳稻花药诱导培养基。
实施例8
为了比较本发明所提供的培养基与前人采用的培养基诱导粳稻花药愈伤效果的差异，我们从相关文献查找了6个粳稻花药愈伤诱导培养基配方，配制成花药愈伤诱导培养基，同样选取粳稻品种通科粳和黑壳紫粳作为花药供体诱导花药愈伤，操作方法、培养方法同实施例1，计算愈伤组织诱导率。
其它6个诱导培养基为：
MS基本培养基+3％蔗糖、3％麦芽糖+2，4-D（2mg/L）、NAA（2mg/L）+琼脂（7g/L），pH为5.8（对比文件来自于汪庆等《高花药培养效率粳稻杂交组合的筛选》）；
N6基本培养基+3％蔗糖、3％麦芽糖+2，4-D（2mg/L）、NAA（2mg/L）+琼脂（7g/L），pH为5.8（对比文件来自于汪庆等《高花药培养效率粳稻杂交组合的筛选》）；
改良N6培养基配方：KNO3 2830mg/L，(NH4)2SO4 463mg/L，KH2PO4 400mg/L，MgSO4∙7H2O 185mg/L，CaCl2∙2H2O 166mg/L，MnSO4∙4H2O 4.4mg/L，ZnSO4∙7H2O 1.55mg/L，H3BO31.6mg/L，KI 0.8mg/L，CuSO4∙5H2O 0.025mg/L，CoCl2∙6H2O 0.025mg/L，Na2MoO4∙2H2O0.25mg/L，Fe-EDTA 5.57mg/L，甘氨酸 2mg/L，维生素B1 1mg/L，维生素 B6 0.5mg/L，烟酸0.5mg/L，蔗糖 50g/L，葡萄糖醇 100 mg/L，LH 500mg/L，2，4-D 2mg/L，琼脂6g，pH为5.8（对比文件来自于孙之荣等《粳稻花药培养基优化试验研究》）；
SK3基本培养基+2，4-D（2mg/L）、NAA（1mg/L）、KT（1mg/L）、LH（0.5 g/L）+蔗糖（50g/L）+琼脂（4.2g/L），pH为5.8（对比文件来自于苗立新等《北方粳稻不同基因型花药培养特性比较》）；
M8基本培养基+3％蔗糖、3％麦芽糖+2，4-D（2mg/L）、NAA（2mg/L）+琼脂（7g/L），pH为5.8（对比文件来自于汪庆等《高花药培养效率粳稻杂交组合的筛选》）；
B5基本培养基+3％蔗糖、3％麦芽糖+2，4-D（2mg/L）、NAA（2mg/L）+琼脂（7g/L），pH为5.8（对比文件来自于汪庆等《高花药培养效率粳稻杂交组合的筛选》）。
培养基对比实验
将实施例8与实施例1进行对比，对比的结果如下表所示：
从不同培养基的诱导效果来看，本发明培养基对粳稻花药愈伤组织平均诱导率为35.5%，MS、N6、改良N6、SK3、M8、B5培养基则为3.2%、16.1%、22.7%、15.6%、9.2%、4.8%，可以发现本发明对粳稻花药愈伤组织的诱导率要显著高于其他6种诱导培养基。
以上8个实施例可以说明本发明提供的培养基配方的组分配比是最优组合，本发明提供的培养基对粳稻花药愈伤组织的诱导比前人发现的粳稻花药诱导培养基具有明显优势。我们的研究结果对于进一步推广和应用单倍体育种无疑有较大的现实意义和实用价值。
本领域技术人员可以根据本发明公开的内容和所掌握的本领域技术对本发明内容作出替换或变型，但是这些替换或变型都不应视为脱离本发明构思的，这些替换或变型均在本发明要求保护的权利范围内。
Claims (1)
1.一种高效地诱导粳稻花药培养的诱导培养基，其特征在于该培养基的配方如下：
KNO3 2200～2600mg/L，(NH4)2SO4 370～430mg/L，KH2PO4 330～370mg/L，CaCl2∙2H2O130～150mg/L，MgSO4∙7H2O 150～170mg/L，Na2-EDTA 30～35mg/L，FeSO4∙7H2O 22～26mg/L，MnSO4∙4H2O 3.6～4.2mg/L，ZnSO4∙7H2O 1.2～1.4mg/L，H3BO3 1.3～1.5mg/L，KI 0.6～0.7mg/L，丙三醇 6～7mg/L，二水柠檬酸钠 0.45～0.55mg/L，叶酸 0.45～0.55mg/L，甘氨酸 2.7～3.3mg/L，丙氨酸 2.2～2.8mg/L，赖氨酸 1.8～2.2mg/L，维生素B1 1.8～2.2mg/L，维生素B6 0.9～1.1mg/L，烟酸 0.9～1.1 mg/L，氯化2-羟乙基三甲铵 220～280mg/L，蔗糖 50～60g/L，植物凝胶 5～6g/L；
2，4-D 3.6～4.4mg/L，NAA 3.6～4.4mg/L，复酞核酸0.45～0.55mg/L，水解蛋白 0.45～0.55g/L，活性炭 2.5～3.0g/L，牛磺酸 0.07～0.08mg/L，生物素 0.07～0.08mg/L，植物硫化激动素PSKα 27～33pmol/L，pH 5.8-6.0。
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