CN110250008A

CN110250008A - 一种花生游离小孢子诱导培养基

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Publication number: CN110250008A
Application number: CN201910680298.8A
Authority: CN
Inventors: 林祥艳
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2019-07-26
Filing date: 2019-07-26
Publication date: 2019-09-20

Abstract

本发明提供了一种花生游离小孢子诱导培养基，该培养基的配方包括KNO₃、NH₄NO₃、MgSO₄·7H₂O、KH₂PO₄、CaCl₂·2H₂O、铁盐及络合物、KI、H₃BO₃、MnSO₄·4H₂O、ZnSO₄·7H₂O等微量元素、肌醇、烟酸、盐酸吡哆醇、盐酸硫胺素、甘氨酸、精氨酸、水解干酪素、泛酸钙、TDZ、6‑BA、4‑碘苯氧乙酸、腐殖酸钠、亚精胺、水杨酸、1‑甲基‑3‑硝基‑1‑亚硝基胍、1‑戊基环丙烯、蔗糖和活性炭。该培养基能够显著提高花生小孢子愈伤组织的诱导率，降低褐化率，对于建立高效、稳定的花生小孢子培养体系具有重要意义。

Description

一种花生游离小孢子诱导培养基

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种诱导花生游离小孢子形成愈伤组织的诱导培养基。

背景技术

花生（Arachis hypogaea Linn.）原名落花生，是一种产量丰富、食用广泛的豆科植物，主要分布于亚洲、非洲和美洲，主要生产国有中国、印度、美国等。花生一直以来都是世界重要的油料作物和经济作物，在中国更是重要的食用植物油和食用蛋白来源。目前，在油料作物中，花生出油率高达45%~50%，远高于其他油料作物，种植面积仅次于油菜，居第二位，总产量居第一位。花生是世界公认的健康食品，素有“长生果”、“植物肉”、“素中之荤”、“绿色牛乳”等诸多美称。花生具有非常高的营养价值，花生仁含脂肪50%左右，其脂肪酸组成中含量最多是油酸和亚油酸，共占总量的80%左右。油酸和亚油酸均为不饱和脂肪酸，在人和动物的新陈代谢过程中起着重要作用，尤其是亚油酸是公认的一种必需脂肪酸，具有降低血脂、软化血管、降低血压、促进微循环的作用，可预防或减少心血管病的发病率，特别是对高血压、高血脂、心绞痛、冠心病、动脉粥样硬化、老年性肥胖症等的防治极为有利。花生仁含有24%~36%的蛋白质，营养价值可与动物性食品鸡蛋、牛奶、瘦肉等媲美，且易于被人体吸收利用。花生仁中含有人体必需的8种氨基酸，且比例适宜，同时含有丰富的卵磷脂、维生素A、维生素B、维生素E、维生素K，以及钙、磷、铁等元素。花生仁中还富含类黄酮及白藜芦醇等功能活性物质，经常食用花生确能起到滋补益寿作用。

我国是世界上最大的花生生产国，全国花生种植面积约占世界花生种植面积的1/5，花生年均产量约占世界花生年均总产量的40%。我国也是世界上最大的花生消费国，国内年消费量占花生总产量的90%左右，其中约46%~48% 用于榨油，因此提高花生产量和含油量一直是花生育种的重要目标。随着中国花生贸易范围的扩大以及花生产品加工技术的不断改进，花生的消费需求也越来越多样化。为适应国际和国内市场的需求变化，中国花生育种不论在育种技术还是育种目标上都面临着新的发展形势。培育高产、早熟、优质、多抗、适于出口以及适于机械化栽培和加工的花生新品种将是今后中国花生育种的发展方向。与其他农作物一样，由于在育种中大量使用遗传背景相同或相似的亲本，导致栽培花生品种基因大量流失，使其遗传基础日益狭窄、遗传变异率低，对其产量的提高和品质的改良起到一定的限制作用。传统的引种驯化、系统选种、杂交育种等方法，已不能很好满足当前花生生产的需要，同时花生用种量大，繁殖系数低，良种推广速度慢，因此需要更多的新技术在花生育种中推广应用。

在花生育种中，优良纯合的自交系是配制杂交种所不可缺少的材料。若通过常规育种手段，选育纯合优良的自交系需要7~8代，存在着育种周期长、效率低、难度大、遗传性状不稳定等缺点。而通过单倍体技术能够获得遗传上完全纯合的双单倍体植株，利用该方法与传统育种相结合不仅能够缩短花生育种年限，提高其育种效率，双单倍体还能用于诱变育种以改良品种，加速新品种的选育和纯化，同时也便于隐性性状和突变体的选择。产生单倍体的方法主要有花药培养和游离小孢子培养，前者为器官培养，后者为单细胞培养。花药培养相对于小孢子培养技术要求较简单，容易成活，出愈率高，但其最大的弊端就在于花药培养存在花药壁、花丝、药隔等体细胞组织的干扰，会形成体细胞植株而非单倍体植株。而游离小孢子具有天然的分散性，数量大，发育整齐，容易获得，获得的植株完全由单倍体单细胞发育而来，避免了嵌合体的发生，在染色体加倍后，能获得遗传上完全纯合的后代；便于进行各种有关雄核发育的研究，也适宜做离体诱变处理和抗性突变体筛选；小孢子培养还可用于观察核发育的全过程，进行遗传发育研究。

1973年Nitsch和Noireel首次用毛曼陀罗的小孢子进行离体培养。20世纪80年代后期，在十字花科的作物上小孢子培养技术被广泛应用。近年来，游离小孢子培养已经在大白菜、胡萝卜、青花菜、辣椒、茄子、小麦、大麦等作物上获得了再生的单倍体植株，但是在花生上的研究还很少。游离小孢子培养受到供体植株基因型、供体植株生理状况、预处理、小孢子发育时期、培养基种类、培养基成分、培养条件等诸多因素的影响，因此小孢子出胚（愈）率受到很大限制，成为实际应用中的一大难题。培养基的营养物质对维持小孢子活力、促进生长发育有重要作用，因此培养基在很大程度上决定了小孢子培养方法的有效性。到目前为止，花生游离小孢子培养的效果较差，愈伤组织诱导率还很低，因此，研发能够提高花生游离小孢子出愈率的方法，对于建立高效的花生游离小孢子培养体系具有至关重要的作用。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种花生游离小孢子诱导培养基，该培养基显著提高了花生小孢子愈伤组织的诱导率，为建立稳定、高效的花生游离小孢子培养体系提供物质基础。

本发明提供的技术方案是：

一种花生游离小孢子诱导培养基，其特征在于，所述培养基的配方为：KNO₃600~700mg/L，NH₄NO₃500~580mg/L，MgSO₄·7H₂O 360~380mg，KH₂PO₄ 155~175mg/L，CaCl₂·2H₂O450~470mg/L，Na₂-EDTA 37~38mg/L，FeSO₄·7H₂O 27.4~28.2mg/L，H₃BO₃ 15~18mg/L，KI0.72~0.78mg/L， MnSO₄·4H₂O 9.7~10.3mg/L，ZnSO₄·7H₂O 1.9~2.5mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O0.2~0.3mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.02~0.03mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.02~0.03mg/L，肌醇90~110mg/L，烟酸1.4~1.8mg/L，盐酸吡哆醇0.8~1.0mg/L，盐酸硫胺素0.6~0.8mg/L，甘氨酸2.0~3.0mg/L，精氨酸19~23mg/L，水解干酪素950~1050mg/L，泛酸钙0.8~1.0mg/L， TDZ 0.08~0.12mg/L，6-BA 0.4~0.6mg/L，4-碘苯氧乙酸1.8~2.2mg/L，腐殖酸钠7.6~8.2mg/L，亚精胺18.5~21.5mg/L，水杨酸8~12μmol/L，1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍1.1~1.3mg/L，1-戊基环丙烯1.8~2.2μl/L，蔗糖55~65g/L，活性炭0.7~0.9g/L。

所述培养基的最佳配方为：KNO₃650mg/L，NH₄NO₃540mg/L，MgSO₄·7H₂O 370mg，KH₂PO₄ 165mg/L，CaCl₂ ·2H₂O 460mg/L，Na₂-EDTA 37.5mg/L，FeSO₄·7H₂O 27.8mg/L，H₃BO₃16.5mg/L，KI 0.76mg/L，MnSO₄·4H₂O 10.0mg/L，ZnSO₄·7H₂O 2.2mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O0.25mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.025mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.025mg/L，肌醇100mg/L，烟酸1.6mg/L，盐酸吡哆醇0.9mg/L，盐酸硫胺素0.7mg/L，甘氨酸2.5mg/L，精氨酸21mg/L，水解干酪素1000mg/L，泛酸钙0.9mg/L，TDZ 0.1mg/L，6-BA 0.5mg/L，4-碘苯氧乙酸2.0mg/L，腐殖酸钠7.9mg/L，亚精胺20mg/L，水杨酸10μmol/L，1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍1.2mg/L，1-戊基环丙烯2.0μl/L，蔗糖60g/L，活性炭0.8g/L。

所述培养基的pH值为5.8~6.2。

本发明相比现有技术有如下优点：

在花生游离小孢子培养过程中，培养基对小孢子发育至关重要，其影响涉及培养基中大量元素、微量元素、有机成分、碳源、激素、添加物的种类和含量等因素，本发明所提供的花生游离小孢子诱导培养基，是在现有的研究基础上的创新和优化的结果。根据花生游离小孢子的发育特性，本发明的诱导培养基降低了无机氮源KNO₃和NH₄NO₃的浓度而提高了有机氮源水解干酪素的浓度，提高了硼酸与蔗糖的浓度，均有利于花生小孢子愈伤组织的形成；本发明的诱导培养基采用TDZ、6-BA、4-碘苯氧乙酸作为激素进行复配，并且添加了一定浓度的精氨酸、泛酸钙、腐殖酸钠、亚精胺、水杨酸、1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍、1-戊基环丙烯和活性炭，这些物质的添加有利于提高花生小孢子愈伤组织的诱导率，降低培养过程的褐化率，从而提高花生游离小孢子培养的成功率。

具体实施方式

为使本发明的目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

实施例1

1材料

供试材料为大田种植的2个花生栽培品种‘徐花13号’和‘丰花5号’。

2方法

在花生的盛花期，从健壮植株上采摘花蕾，经染色镜检筛选出小孢子发育时期处于单核靠边期的花蕾，放入4℃冰箱预处理12h。将预处理后的花蕾用70%酒精消毒30s，然后用0.1%升汞消毒10min，最后用无菌水冲洗3~4次。沥干水分后，在B₅洗涤培养基中用玻璃棒碾压花蕾使小孢子释放出来，再用200目细胞筛过滤，滤液以1000r/min、5min低速离心，弃上清液。重复离心3次至上清液无色透明，弃上清液，沉淀即为纯化的小孢子。按2.0×10⁵个/mL的接种密度，将纯化的小孢子接种于诱导培养基中，先置于33℃暗培养24h，再置于28℃暗培养21d左右，统计小孢子愈伤组织诱导率。愈伤组织诱导率= （产生愈伤组织块数/接种花蕾数）×100%。

3培养基中添加物对花生小孢子愈伤组织诱导率影响的研究：

诱导培养基采用以下配方：KNO₃650mg/L，NH₄NO₃540mg/L，MgSO₄·7H₂O 370mg，KH₂PO₄165mg/L，CaCl₂ ·2H₂O 460mg/L，Na₂-EDTA 37.5mg/L，FeSO₄·7H₂O 27.8mg/L，H₃BO₃16.5mg/L，KI 0.76mg/L， MnSO₄·4H₂O 10.0mg/L，ZnSO₄·7H₂O 2.2mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O0.25mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.025mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.025mg/L，肌醇100mg/L，烟酸1.6mg/L，盐酸吡哆醇0.9mg/L，盐酸硫胺素0.7mg/L，甘氨酸2.5mg/L，精氨酸21mg/L，水解干酪素1000mg/L，泛酸钙0.9mg/L，TDZ 0.1mg/L，6-BA 0.5mg/L，4-碘苯氧乙酸2.0mg/L，腐殖酸钠7.9mg/L，1-戊基环丙烯2.0μl/L，蔗糖60g/L，活性炭0.8g/L，pH值为6.0，以此培养基作为对照，另添加不同浓度的亚精胺、水杨酸、1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍作为处理培养基。

3.1亚精胺对花生小孢子愈伤组织诱导率的影响：

设置4个亚精胺浓度，分别为10mg/L、20mg/L、30mg/L、40mg/L，以不添加亚精胺为对照，将‘徐花13号’和‘丰花5号’的游离小孢子接种于以上诱导培养基中培养，统计小孢子愈伤组织诱导率，结果如表1所示。

亚精胺是一种多胺类物质，在植物体内普遍存在，是生物代谢过程中产生的一类具有生物活性的低分子量脂肪族含氮碱，广泛作用于植物生长、形态建成、衰老和对逆境胁迫的响应。从表1可以看出，诱导培养基中添加亚精胺能够提高花生小孢子愈伤组织的诱导率，说明亚精胺对愈伤组织的形成具有促进作用。通过亚精胺浓度的优化试验，结果表明在10~40mg/L浓度范围内，添加亚精胺的培养效果优于不添加的，当亚精胺浓度为20mg/L时，徐花13号和丰花5号都能获得较高的愈伤组织诱导率，而继续增加亚精胺浓度，愈伤组织诱导率没有进一步提高，因此最佳的亚精胺浓度为20mg/L。

3.2水杨酸对花生小孢子愈伤组织诱导率的影响：

设置5个水杨酸浓度，分别为5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L、25μmol/L，以不添加水杨酸为对照，将‘徐花13号’和‘丰花5号’的游离小孢子接种于以上诱导培养基中培养，统计小孢子愈伤组织诱导率，结果如表2所示。

水杨酸是一类由植物产生的酚类物，是植物体内普遍存在的内源信号分子之一。大量研究发现，外源水杨酸能影响植物多种生理过程，如蒸腾作用、气孔关闭、种子萌发、果实成熟、开花、植物产热、植物抗病等。从表2可以看出，诱导培养基中添加不同浓度的水杨酸对花生小孢子愈伤组织的诱导效果差异显著。与对照组相比，添加试验浓度的水杨酸均可以提高花生小孢子愈伤组织诱导率，当水杨酸浓度为10μmol/L时，徐花13号和丰花5号的愈伤组织诱导率最高，分别为19.4%和25.1%，说明此浓度对愈伤组织形成的促进作用最好，随着水杨酸浓度的继续提高，这种促进作用逐渐降低，浓度为25μmol/L，徐花13号和丰花5号的愈伤组织诱导率分别为10.9%和16.3%，略高于对照组，因此最佳的水杨酸浓度为10μmol/L。

3.3 1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍对花生小孢子愈伤组织诱导率的影响：

设置5个1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍浓度，分别为0.4mg/L、0.8mg/L、1.2mg/L、1.6mg/L、2.0mg/L，以不添加1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍为对照，将‘徐花13号’和‘丰花5号’的游离小孢子接种于以上诱导培养基中培养，统计小孢子愈伤组织诱导率，结果如表3所示。

1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍是一种化学诱变剂，而化学诱变在小孢子离体培养过程中可能对细胞脱分化与再分化产生一定影响。从表3可以看出，诱导培养基中添加不同浓度的1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍对花生小孢子愈伤组织的诱导效果差异显著。与对照组相比，添加0.4~1.6mg/L的1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍可以提高花生小孢子愈伤组织诱导率，当1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍浓度为1.2mg/L时，徐花13号和丰花5号的愈伤组织诱导率最高，分别为19.6%和24.7%，说明此浓度对愈伤组织形成的促进作用最好，随着1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍浓度的继续提高，愈伤组织诱导率急剧下降，当1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍浓度为2.0mg/L时，徐花13号和丰花5号的愈伤组织诱导率分别为9.2%和13.9%，低于对照组，说明此浓度对愈伤组织的形成产生了抑制作用，因此最佳的1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍浓度为1.2mg/L。

实施例2

根据实施例1中的研究结果，本发明的花生游离小孢子诱导培养基的最佳配方为：KNO₃650mg/L，NH₄NO₃540mg/L，MgSO₄·7H₂O 370mg，KH₂PO₄ 165mg/L，CaCl₂ ·2H₂O 460mg/L，Na₂-EDTA 37.5mg/L，FeSO₄·7H₂O 27.8mg/L，H₃BO₃ 16.5mg/L，KI 0.76mg/L， MnSO₄·4H₂O 10.0mg/L，ZnSO₄·7H₂O 2.2mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.025mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.025mg/L，肌醇100mg/L，烟酸1.6mg/L，盐酸吡哆醇0.9mg/L，盐酸硫胺素0.7mg/L，甘氨酸2.5mg/L，精氨酸21mg/L，水解干酪素1000mg/L，泛酸钙0.9mg/L，TDZ0.1mg/L，6-BA 0.5mg/L，4-碘苯氧乙酸2.0mg/L，腐殖酸钠7.9mg/L，亚精胺20mg/L，水杨酸10μmol/L，1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍1.2mg/L，1-戊基环丙烯2.0μl/L，蔗糖60g/L，活性炭0.8g/L；同时制备《花生（Arachis hypogaea L.）游离小孢子培养获得愈伤组织研究》中提供的花生游离小孢子诱导培养基：MS液体培养基（蔗糖60g/L）+ 2，4-D 4mg/L+6-BA 3mg/L+NAA 0.3mg/L作为对照培养基，比较本发明与前人研究的诱导培养基对花生小孢子愈伤组织诱导率的差异。试验材料与方法均与实施例1中相同，统计小孢子愈伤组织诱导率，结果如表4所示。

从表4可以看出，在试验材料与方法相同的情况下，本发明所提供的诱导培养基对花生品种‘徐花13号’和‘丰花5号’的小孢子愈伤组织诱导率分别为24.3%和30.6%，而对照培养基对这两个品种的诱导率分别为7.9%和11.4%，表明本发明的诱导培养基具有更好的诱导培养效果，能够提高愈伤组织诱导率。与对照培养基相比，本发明的诱导培养基降低了无机氮源KNO₃和NH₄NO₃的浓度而提高了有机氮源水解干酪素的浓度，提高了硼酸的浓度，采用TDZ、6-BA、4-碘苯氧乙酸作为激素进行复配，并且添加了一定浓度的精氨酸、泛酸钙、腐殖酸钠、亚精胺、水杨酸、1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍、1-戊基环丙烯和活性炭，这些因素均有利于提高花生小孢子愈伤组织的诱导率，降低培养过程的褐化率，从而提高花生游离小孢子培养的成功率。

以上实施例仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明保护范围之内；本发明未涉及的技术均可通过现有技术加以实现。

Claims

1.一种花生游离小孢子诱导培养基，其特征在于，所述培养基的配方为：KNO₃600~700mg/L，NH₄NO₃500~580mg/L，MgSO₄·7H₂O 360~380mg，KH₂PO₄ 155~175mg/L，CaCl₂·2H₂O450~470mg/L，Na₂-EDTA 37~38mg/L，FeSO₄·7H₂O 27.4~28.2mg/L，H₃BO₃ 15~18mg/L，KI0.72~0.78mg/L， MnSO₄·4H₂O 9.7~10.3mg/L，ZnSO₄·7H₂O 1.9~2.5mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O0.2~0.3mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.02~0.03mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.02~0.03mg/L，肌醇90~110mg/L，烟酸1.4~1.8mg/L，盐酸吡哆醇0.8~1.0mg/L，盐酸硫胺素0.6~0.8mg/L，甘氨酸2.0~3.0mg/L，精氨酸19~23mg/L，水解干酪素950~1050mg/L，泛酸钙0.8~1.0mg/L， TDZ 0.08~0.12mg/L，6-BA 0.4~0.6mg/L，4-碘苯氧乙酸1.8~2.2mg/L，腐殖酸钠7.6~8.2mg/L，亚精胺18.5~21.5mg/L，水杨酸8~12μmol/L，1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍1.1~1.3mg/L，1-戊基环丙烯1.8~2.2μl/L，蔗糖55~65g/L，活性炭0.7~0.9g/L。

2.根据权利要求1所述的一种花生游离小孢子诱导培养基，其特征在于，所述培养基的最佳配方为：KNO₃650mg/L，NH₄NO₃540mg/L，MgSO₄·7H₂O 370mg，KH₂PO₄ 165mg/L，CaCl₂ ·2H₂O 460mg/L，Na₂-EDTA 37.5mg/L，FeSO₄·7H₂O 27.8mg/L，H₃BO₃ 16.5mg/L，KI 0.76mg/L，MnSO₄·4H₂O 10.0mg/L，ZnSO₄·7H₂O 2.2mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg/L，CuSO₄·5H₂O0.025mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.025mg/L，肌醇100mg/L，烟酸1.6mg/L，盐酸吡哆醇0.9mg/L，盐酸硫胺素0.7mg/L，甘氨酸2.5mg/L，精氨酸21mg/L，水解干酪素1000mg/L，泛酸钙0.9mg/L，TDZ0.1mg/L，6-BA 0.5mg/L，4-碘苯氧乙酸2.0mg/L，腐殖酸钠7.9mg/L，亚精胺20mg/L，水杨酸10μmol/L，1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍1.2mg/L，1-戊基环丙烯2.0μl/L，蔗糖60g/L，活性炭0.8g/L。

3.根据权利要求1和2所述的一种花生游离小孢子诱导培养基，其特征在于，所述培养基的pH值为5.8~6.2。