CN111903526A

CN111903526A - 一种用于荞麦游离小孢子培养的分化培养基及其应用

Info

Publication number: CN111903526A
Application number: CN202010904638.3A
Authority: CN
Inventors: 夏建材; 徐海梅
Original assignee: Jiangsu Runzhi Agricultural Technology Service Co ltd
Current assignee: Jiangsu Runzhi Agricultural Technology Service Co ltd
Priority date: 2020-09-01
Filing date: 2020-09-01
Publication date: 2020-11-10

Abstract

本发明提供了一种用于荞麦游离小孢子培养的分化培养基，其配方包括KNO₃、NH₄NO₃、KH₂PO₄·H₂O、MgSO₄·7H₂O、CaCl₂·2H₂O、Fe‑EDDHA、H₃BO₃、KI、MnSO₄·4H₂O、ZnSO₄·7H₂O、CuSO₄·5H₂O、CoCl₂·6H₂O、Na₂MoO₄·2H₂O、维生素B1、维生素B6、烟酸、维生素A、维生素C、肌醇、甘氨酸、水解干酪素、姜黄素、延胡索酸、茉莉酸甲酯、6‑BA、NAA、KT、泊洛沙姆、氯化镧、香蕉泥、冬青提取液、麦芽糖、植物凝胶。将该分化培养基应用于荞麦游离小孢子培养的植株再生，绿苗产量平均可达83.65株/100mg，经过生根培养可获得完整再生植株，再生植株驯化后移栽成活。本发明为游离小孢子培养技术在荞麦育种和遗传研究等方面的应用奠定基础。

Description

一种用于荞麦游离小孢子培养的分化培养基及其应用

技术领域

本发明涉及一种用于荞麦游离小孢子培养的分化培养基及其应用，属于作物育种技术领域。

背景技术

荞麦起源于中国和亚洲北部地区，为蓼科（Polygonaceae）荞麦属（FagopyrumMill）一年生草本双子叶植物，有耐旱、适应性强和生育期短等特点。荞麦在全世界，尤其是东亚及东欧地区广泛栽植。全球目前荞麦属大约有23个种、2个亚种和3个变种，栽培品种有2个，即甜荞（F. esculentum，也称普通荞麦）和苦荞（F. tataricum，也称鞑靼荞麦）。我国是世界上荞麦种类最多的国家，栽培历史也最为悠久，栽培面积和总产量居世界第2位。

自古以来荞麦都作为主要的粮食产物之一，其营养丰富，富含蛋白质，维生素和矿质元素等，淀粉含量高达65%~80%，与一般谷类淀粉比较，荞麦淀粉食用后易于人体消化吸收。荞麦还含有独特的活性成分生物类黄酮，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤以及降低“三高”（高血压、高血脂、高血糖）等功效，是天然的健康食品。

荞麦属于小宗作物，20世纪80年代初，随着国家农作物品种资源的征集、研究工作的开展，我国开始了荞麦新品种选育研究工作。育种方法主要采用系统育种和辐射诱变育种等方法，曾取得了一定的进展，培育出了一批新品种。但是由于我国荞麦在作物中的地位不高，投入的人、财、物资源不足，研究水平低，导致了荞麦育种滞后、产量低而不稳。随着人们生活水平的提高，荞麦由于独特的平衡营养和保健作用，近年来得到广泛关注。荞麦产业规模和需求呈现逐步增大的趋势。尽快培育出适应不同类型地区的高产、优质、抗逆性强的荞麦新品种，积极研究其先进的育种技术，是进一步发展我国荞麦生产的当务之急。

单倍体育种是植物育种手段之一，即利用植物组织培养技术诱导产生单倍体植株，再通过某种手段使染色体组加倍（如用秋水仙素处理），从而使植物恢复正常染色体数。单倍体育种已与常规杂交育种、远缘杂交育种、诱变育种以及转基因技术相结合，是生物技术在农作物育种中应用最广泛、最有成效的方法之一，在在传统农业向高新技术农业的转型中发挥着纽带作用，是一种快速有效的育种方法。与常规有性杂交育种技术相比，利用单倍体植株进行单倍体育种可以缩短育种年限、提高后代的选择效率、加快育种进程，已成为作物常规育种的有力补充。另外，单倍体植株在遗传基础研究和基因工程等方面也有重要的应用。

花药培养和小孢子培养是获得单倍体植株的主要途径。小孢子培养一般采用游离培养的方式，即不经任何形式的花药预培养，直接从花蕾或花药获取游离状态的新鲜小孢子培养最终形成完整植株，从而得到单倍体的一种技术。相比较花药培养，游离小孢子培养具有以下优点：1）可以避免花药中药壁、药隔、花丝等组织的干扰，从小孢子中获得的材料是纯合的；2）小孢子能均质地接受多种物理或是化学的胁迫和诱变处理，能够较好地调节雄核发育的方向，不仅是进行遗传转化也是研究遗传和胚胎发育的理想材料；3）基因型限制问题在小孢子培养中表现的不像花药培养那样严重。

近年来，游离小孢子培养取得了很大进步，在小麦、水稻、玉米等大宗作物上都建立了高效再生系统。与花药培养比较，小孢子培养涉及小孢子的分离、纯化以及培养方法的选择，培养条件如渗透压、接种密度，培养前预处理和培养基的组成及成分等要求都相对苛刻，影响因素也相对较多。就荞麦而言，目前已有花药培养成功获得再生植株的报道，但关于游离小孢子培养的报道还没有，尚未建立起有效的荞麦小孢子培养体系。因此对荞麦游离小孢子培养技术及其影响因素进行深入的研究是非常有必要的。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，我们通过多年的实践，摸索出适用于荞麦游离小孢子培养的分化培养基，以及从愈伤组织到再生植株的培养方法，为建立荞麦游离小孢子培养体系以及今后开荞麦单倍体育种工作提供理论依据。

为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：

一种用于荞麦游离小孢子培养的分化培养基，其特征在于，所述培养基的配方如下：KNO₃ 1380~1520mg/L，NH₄NO₃ 920~960mg/L，KH₂PO₄·H₂O 115-145mg/L，MgSO₄·7H₂O 230~260mg/L，CaCl₂·2H₂O 264~292mg/L，Fe-EDDHA 27.5~32.5mg/L，H₃BO₃ 5.7~6.3mg/L，KI0.8~0.9mg/L，MnSO₄·4H₂O 18.3~22.5mg/L，ZnSO₄·7H₂O 7.9~8.5mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.02~0.03mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.02~0.03mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.3~0.4mg/L，维生素B1 0.3~0.5mg/L，维生素B6 0.8~1.0mg/L，烟酸0.5~0.7mg/L，维生素A 0.8~1.0mg/L，维生素C 2.1~2.5mg/L，肌醇120~150mg/L，甘氨酸1.0~2.0mg/L，水解干酪素180~210mg/L，姜黄素4.4~4.8mg/L，延胡索酸40~70mg/L，茉莉酸甲酯0.3~0.5mmol/L，6-BA 0.4~0.6mg/L，NAA 0.04~0.06mg/L，KT 1.4~1.6mg/L，泊洛沙姆 7~13mg/L，氯化镧1.0~2.0mg/L，香蕉泥20~25g/L，冬青提取液80~120ml/L，麦芽糖26~34g/L，植物凝胶7.5~8.5g/L，pH值5.8~6.2。

所述冬青提取液的制备方法为，称取冬青叶片50g粉碎，加1000ml水，放入50℃温水浴中浸泡12h后再煮沸30min，过滤去渣，1000ml容量瓶定容，得到冬青提取液原液，4℃保存备用。

所述培养基用于荞麦游离小孢子培养的植株再生，具体步骤如下：

1）愈伤组织的分化：将由荞麦游离小孢子诱导出的愈伤组织接种于含有分化培养基的光照培养瓶中，于25±1℃、自然散射光条件下培养5~7d，再于日光灯光照条件下培养40~50d，愈伤组织上可分化出绿苗；

2）生根培养：待分化形成的绿苗长到1.0~2.0cm时，将其从基部切下，去除愈伤组织，转入增殖培养基中使其增殖，当得到大量健壮无根苗后，单株切下，再转入生根培养基中诱导生根；

3）驯化移栽：把培养瓶从培养室移出，松开瓶盖，室温条件下炼苗4~5d；从瓶中小心取出试管苗，洗净根部粘连的培养基，用800~1000倍百菌清浸泡基部2~3min，取出晾干表面水分，栽种于装有灭菌基质的营养钵中，白色透明塑料膜覆盖保湿7~10d，最后定植于日光温室，进行常规栽培管理。

所述步骤1）中，光照条件为：光照周期12~14h/d，光照强度1500~2500lx。

所述步骤2）中，增殖培养基的配方为：MS+三十烷醇0.5mg/L+NAA 0.2mg/L+6-BA0.01mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.0g/L，pH值5.6~6.0。

所述步骤2）中，生根培养基的配方为：1/2MS +矮壮素3.0mg/L+NAA 0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.0g/L，pH值5.6~6.0。

所述步骤2）中，增殖和生根的培养条件为：光照周期14~16h/d，光照强度1500~2500lx，温度25±2℃。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供的用于荞麦游离小孢子培养的分化培养基，是在常规培养基的基础上，根据荞麦小孢子培养特性，对大量元素、微量元素、有机物、碳源等进行适当的调整来达到最佳效果，生长调节剂选用了6-BA、NAA、KT进行组合对愈伤组织分化效果最好，附加成分选用了姜黄素、延胡索酸、茉莉酸甲酯、泊洛沙姆、氯化镧、香蕉泥和冬青提取液，有利于植株再生。使用该分化培养基，绿苗产量平均达到83.65株/100mg。

本发明成功获得了荞麦游离小孢子培养的再生植株，为小孢子培养技术在荞麦中的应用提供理论依据，并为今后开展荞麦单倍体育种、分子标记研究、遗传图谱构建等奠定基础。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。

实施例1

1 材料与方法

1.1材料

供试材料为荞麦品种‘平荞2号’和‘北早生’经游离小孢子培养诱导出的愈伤组织，由发明人前期试验所得。

1.2方法

1）愈伤组织的分化：将由荞麦游离小孢子诱导出的愈伤组织接种于含有分化培养基的光照培养瓶中，于25℃、自然散射光条件下培养5~7d，再于日光灯光照条件下（光照周期13h/d，光照强度2000lx）培养40~50d，愈伤组织上可分化出绿苗，统计绿苗产量（每100mg愈伤组织分化出的绿苗数，单位：株/100mg）。

2）生根培养：待分化形成的绿苗长到1.0~2.0cm时，将其从基部切下，去除愈伤组织，转入增殖培养基中使其增殖，当得到大量健壮无根苗后，单株切下，再转入生根培养基中诱导生根，30d左右进行生根率的统计；增殖和生根的培养条件为：光照周期15h/d，光照强度2000lx，温度25℃。

3）驯化移栽：把培养瓶从培养室移出，松开瓶盖，室温条件下炼苗4~5d；从瓶中小心取出试管苗，洗净根部粘连的培养基，用800~1000倍百菌清浸泡基部2~3min，取出晾干表面水分，栽种于装有灭菌基质的营养钵中，白色透明塑料膜覆盖保湿7~10d，最后定植于日光温室，进行常规栽培管理，观察再生植株生长势、农艺性状等，并进行成活率的统计。

1.3培养基

分化培养基：KNO₃ 1450mg/L，NH₄NO₃ 940mg/L，MgSO₄·7H₂O 245mg/L，CaCl₂·2H₂O278mg/L，Fe-EDDHA 30.0mg/L，H₃BO₃ 6.0mg/L，KI 0.85mg/L，MnSO₄·4H₂O 20.4mg/L，ZnSO₄·7H₂O 8.2mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.025mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.025mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O0.35mg/L，维生素B1 0.4mg/L，维生素B6 0.9mg/L，烟酸0.6mg/L，维生素A 0.9mg/L，维生素C 2.3mg/L，肌醇135mg/L，甘氨酸1.5mg/L，水解干酪素195mg/L，姜黄素4.6mg/L，延胡索酸55mg/L，茉莉酸甲酯0.4mmol/L，6-BA 0.5mg/L，NAA 0.05mg/L，KT 1.5mg/L，泊洛沙姆10mg/L，氯化镧1.5mg/L，香蕉泥23g/L，冬青提取液100ml/L，麦芽糖30g/L，植物凝胶8.0g/L，pH值6.0。

冬青提取液的制备方法为，称取冬青叶片20g粉碎，加1000ml水，放入50℃温水浴中浸泡12h后再煮沸30min，过滤去渣，1000ml容量瓶定容，得到冬青提取液原液，4℃保存备用。

增殖培养基：MS+三十烷醇0.5mg/L+NAA 0.2mg/L+6-BA 0.01mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.0g/L，pH值5.8。

生根培养基：1/2MS +矮壮素3.0mg/L+NAA 0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.0g/L，pH值5.8。

2 结果与分析

2.1茉莉酸甲酯对荞麦游离小孢子绿苗分化的影响

将由荞麦游离小孢子诱导出的愈伤组织接种于添加不同浓度（0、0.2、0.4、0.6、0.8mmol/L）茉莉酸甲酯的分化培养基上，于25℃、自然散射光条件下培养5~7d，再于日光灯光照条件下培养40~50d，统计绿苗产量，每个浓度设3个重复，结果如表1所示。

表1的结果表明，随着茉莉酸甲酯浓度的增加，2种供试材料的绿苗产量呈现先上升后下降的趋势，其中当茉莉酸甲酯浓度为0.4mmol/L时，2种供试材料的绿苗产量达到最大值，分别为‘平荞2号’71.29株/100mg，‘北早生’96.88株/100mg；当茉莉酸甲酯浓度为0.8mmol/L时，2种供试材料的则绿苗产量显著下降，说明茉莉酸甲酯浓度过高会抑制愈伤组织的分化，因此茉莉酸甲酯的适宜浓度为0.4mmol/L。

2.2氯化镧对荞麦游离小孢子绿苗分化的影响

将由荞麦游离小孢子诱导出的愈伤组织接种于添加不同浓度（0、0.5、1.0、1.5、2.0mg/L）氯化镧的分化培养基上，于25℃、自然散射光条件下培养5~7d，再于日光灯光照条件下培养40~50d，统计绿苗产量，每个浓度设3个重复，结果如表2所示。

表2的结果表明，在培养基中添加不同浓度的氯化镧对绿苗产量有着显著的影响。随着氯化镧浓度的增加，2种供试材料的绿苗产量明显增加，当氯化镧浓度在1.5mg/L时，2种供试材料的绿苗产量达到最大值，分别为‘平荞2号’69.73株/100mg，‘北早生’94.50株/100mg；当氯化镧浓度在2.0mg/L时，2种供试材料的绿苗产量有所下降，因此氯化镧浓度为1.5mg/L时最有利于荞麦小孢子愈伤组织分化绿苗。

2.3泊洛沙姆对荞麦游离小孢子绿苗分化的影响

将由荞麦游离小孢子诱导出的愈伤组织接种于添加不同浓度（0、5、10、15、20mg/L）泊洛沙姆的分化培养基上，于25℃、自然散射光条件下培养5~7d，再于日光灯光照条件下培养40~50d，统计绿苗产量，每个浓度设3个重复，结果如表3所示。

表3的结果表明，在培养基中添加5~20mg/L的泊洛沙姆，均可以提高绿苗产量，当泊洛沙姆浓度在10mg/L时，2种供试材料的绿苗产量达到最大值，分别为‘平荞2号’69.82株/100mg，‘北早生’95.34株/100mg；当洛沙姆浓度在20mg/L时，2种供试材料的绿苗产量虽然与10mg/L时相比有所下降，但仍然显著高于对照组。此可见分化培养基中添加适量的泊洛沙姆可以提高绿苗产量，可以分化出更多的绿苗，而泊洛沙姆的最适宜浓度为10mg/L。

2.4不同培养基对荞麦游离小孢子绿苗分化的影响

将由荞麦游离小孢子诱导出的愈伤组织分别接种于本发明的分化培养基和现有技术的分化培养基上，于25℃、自然散射光条件下培养5~7d，再于日光灯光照条件下培养40~50d，统计绿苗产量，结果如表4所示。

现有技术的分化培养基：B₅+NAA+6-BA+蔗糖0.1%（宋英凯等.《普通荞麦花药培养植株再生获得成功》）。

表4的结果表明，‘平荞2号’的绿苗产量在本发明的分化培养基上高达72.01株/100mg，是现有技术的2.5倍，‘北早生’的绿苗产量在本发明的分化培养基上高达95.29株/100mg，是现有技术的3倍，说明本发明的分化培养基对绿苗的再生具有极大的促进作用。

2.5再生植株的生根与移栽

将无根苗单株切下，转入生根培养基中诱导生根，7d后可观察到根部有白色毛状物出现，15d后开始生根，30d左右就能长成根系发达的再生植株，2种供试材料的生根率分别为‘平荞2号’90.3%，‘北早生’87.5%。这些根系发达的再生植株经过驯化后移栽至日光温室，成活率在90%以上。

以上所述的具体实施例方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种用于荞麦游离小孢子培养的分化培养基，其特征在于，所述培养基的配方如下：KNO₃ 1380~1520mg/L，NH₄NO₃ 920~960mg/L，KH₂PO₄·H₂O 115-145mg/L，MgSO₄·7H₂O 230~260mg/L，CaCl₂·2H₂O 264~292mg/L，Fe-EDDHA 27.5~32.5mg/L，H₃BO₃ 5.7~6.3mg/L，KI0.8~0.9mg/L，MnSO₄·4H₂O 18.3~22.5mg/L，ZnSO₄·7H₂O 7.9~8.5mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.02~0.03mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.02~0.03mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.3~0.4mg/L，维生素B1 0.3~0.5mg/L，维生素B6 0.8~1.0mg/L，烟酸0.5~0.7mg/L，维生素A 0.8~1.0mg/L，维生素C 2.1~2.5mg/L，肌醇120~150mg/L，甘氨酸1.0~2.0mg/L，水解干酪素180~210mg/L，姜黄素4.4~4.8mg/L，延胡索酸40~70mg/L，茉莉酸甲酯0.3~0.5mmol/L，6-BA 0.4~0.6mg/L，NAA 0.04~0.06mg/L，KT 1.4~1.6mg/L，泊洛沙姆 7~13mg/L，氯化镧1.0~2.0mg/L，香蕉泥20~25g/L，冬青提取液80~120ml/L，麦芽糖26~34g/L，植物凝胶7.5~8.5g/L，pH值5.8~6.2。

2.根据权利要求1所述的一种用于荞麦游离小孢子培养的分化培养基，其特征在于，所述冬青提取液的制备方法为，称取冬青叶片50g粉碎，加1000ml水，放入50℃温水浴中浸泡12h后再煮沸30min，过滤去渣，1000ml容量瓶定容，得到冬青提取液原液，4℃保存备用。

3.一种用于荞麦游离小孢子培养的分化培养基的应用，其特征在于，所述培养基用于荞麦游离小孢子培养的植株再生，具体步骤如下：

4.根据权利要求3所述的一种用于荞麦游离小孢子培养的分化培养基的应用，其特征在于，所述步骤1）中，光照条件为：光照周期12~14h/d，光照强度1500~2500lx。

5.根据权利要求3所述的一种用于荞麦游离小孢子培养的分化培养基的应用，其特征在于，所述步骤2）中，增殖培养基的配方为：MS+三十烷醇0.5mg/L+NAA 0.2mg/L+6-BA0.01mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.0g/L，pH值5.6~6.0。

6.根据权利要求3所述的一种用于荞麦游离小孢子培养的分化培养基的应用，其特征在于，所述步骤2）中，生根培养基的配方为：1/2MS +矮壮素3.0mg/L+NAA 0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.0g/L，pH值5.6~6.0。

7.根据权利要求3所述的一种用于荞麦游离小孢子培养的分化培养基的应用，其特征在于，所述步骤2）中，增殖和生根的培养条件为：光照周期14~16h/d，光照强度1500~2500lx，温度25±2℃。