CN108265075A - 一种提高大豆组培丛生芽伸长率和遗传转化效率的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种新的芽伸长培养基，以及提高丛生芽伸长率和遗传转化效率的大豆遗传转化方法，其中所述培养基包含：0.9‑1.1mg/L的赤霉素和0.08‑0.12mg/L的生长素。本发明所述培养基和方法可以提高大豆组培丛生芽的伸长率和大豆遗传转化效率，为今后大豆基因功能的研究和大豆分子育种提供技术支撑。

Description

一种提高大豆组培丛生芽伸长率和遗传转化效率的方法
技术领域
本发明涉及农作物遗传转化领域，具体涉及一种能够显著提高大豆组培丛生芽伸长率和遗传转化效率的方法。
背景技术
大豆是世界上公认的较难进行遗传转化的农作物之一。已报导的大豆遗传转化体系包括农杆菌介导法、花粉管通法、基因枪法、电激法、PEG法、显微注射法等，其中农杆菌介导法为大豆常用的方法。85％的转基因植物的获得都是通过农杆菌介导法(Yu etal.2011)。
农杆菌介导的大豆遗传转化体系中根据外植体的不同，主要可分为大豆子叶节法、胚尖法、下胚轴法等，其中子叶节法应用最为广泛。子叶节法具有取材不受时间限制、成苗周期短、再生植株遗传稳定等优点。
1988年Hinchee等就是通过以子叶节为外植体进行的大豆遗传转化获得的最早的转基因大豆植株(Hinchee et al.1988；Paz et al.2006)。此后国内外多个研究者同样以子叶节为外植体获得了转基因大豆再生植株(Clemente et al.2000；Rong et al.1996；Zhang et al.1999)。为完善和改进子叶节受体系统，Paz等在此基础上发展了一种新的转化方法-半粒法，以浸泡24h的大豆半种子作为外植体，平均转化效率为3.8％(Paz etal.2006)。这种方法不但简化了试验流程，而且因萌动的种子分生组织活力强，其转化效率比用常规子叶节转化提高约1.5倍(Zia et al.2010)。但是和其他作物的转化效率相比，例如水稻23％(Ge et al.2006；Lin and Zhang 2005)、玉米30％-40％(Ishida et al.1996；Yang et al.2006)，大豆的遗传转化效率还是较低。
很多因素如大豆受体品种、农杆菌菌株及侵染活性、筛选剂类型、培养基成分和激素配比等都影响大豆转化效率，而且，目前在大豆组培过程中，丛生芽的诱导和根的再生之后，仅有少数丛生芽可以伸长(Song et al.2013)，因此，丛生芽的伸长率是提高大豆遗传转化效率的瓶颈。
发明内容
针对上述现有技术存在的问题，本发明提供一种新的芽伸长培养基，以及提高丛生芽伸长率和遗传转化效率的大豆遗传转化方法，本发明所述培养基和方法可以提高大豆组培丛生芽的伸长率和大豆遗传转化效率，为今后大豆基因功能的研究和大豆分子育种提供技术支撑。
本发明目的之一是提供一种芽伸长培养基(SEM)，其特征在于，所述培养基包含：0.9-1.1mg/L的赤霉素和0.08-0.12mg/L的生长素；该芽伸长培养基中的激素配比，可以使丛生芽的伸长率和遗传转化效率大幅度提高，特别是，发明人发现芽伸长培养基(SEM)中的赤霉素的含量在1mg/L、生长素的含量在0.1mg/L的时候，可以使芽明显促进伸长，从而极大的提高丛生芽的伸长率。
作为一种优选方案，本发明所述的芽伸长培养基的配比为：MS大量50ml/L、MS微量5ml/L、Fe盐5ml/L、B5有机10ml/L、蔗糖30g/L、2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物0.58g/L、凝胶3.5g/L、赤霉素1mg/L、生长素0.1mg/L、玉米素1mg/L、L-天冬酰胺酶50mg/L、L-焦谷氨酰胺100mg/L、头孢霉素75mg/L、羧苄青霉素500mg/L、筛选剂3mg/L。本发明还提供所述芽伸长培养基的配制方法：MS大量50ml/L、MS微量5ml/L、Fe盐5ml/L、B5有机10ml/L、蔗糖30g/L、2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物0.58g/L，将溶液pH调到5.6后加入凝胶3.5g/L，高温灭菌后添加赤霉素1mg/L、生长素0.1mg/L、玉米素1mg/L、L-天冬酰胺酶50mg/L、L-焦谷氨酰胺100mg/L、头孢霉素75mg/L、羧苄青霉素500mg/L、筛选剂3mg/L。其中：MS大量的配比为：KNO3 38g/L，MgSO4·7H2O 7.4g/L，NH4NO3 33g/L，KH2PO4 3.4g/L，CaCl2·2H2O 8.8g/L；MS微量的配比为：H3BO3 1.24g/L，MnSO4·H2O 3.38g/L，ZnSO4·7H2O 1.72g/L，Na2MoO4·2H2O 0.05g/L，CuSO4·5H2O 0.05g/L，CoCl2·6H2O 0.05g/L，KI 0.0166g/L；Fe盐的配比为：FeSO4·7H2O5.56g/L，Na2EDTA·2H2O 7.46g/L；B5有机的配比为：烟酸0.1g/L，肌醇10g/L，维生素B1 1g/L，维生素B6 0.1g/L。
本发明的目的之二是提供一种提高大豆组培丛生芽伸长率和遗传转化效率的方法，包括如下步骤：
1)丛生芽诱导：将农杆菌侵染的外植体用洗涤液清洗，可以避免农杆菌在培养基中进一步生长，保证外植体顺利诱导出丛生芽并保证后期的生长；而后将外植体近轴面朝上，下胚轴倾斜45度插入芽诱导培养基(SIM)中进行芽诱导培养，发明人发现这种外植体的插入方式，可以既实现与芽诱导培养基(SIM)的充分接触，又能保证较好的光照效果，利于丛生芽的诱导；14d后换至新的芽诱导培养基(SIM)中继续培养；
2)芽伸长：将步骤1)产生丛生芽的外植体切掉大芽和下胚轴底部的老化组织，移至芽伸长培养基(SEM)中培养2-10周，每两周更换一次芽伸长培养基，每次更换时都在外植体的基部切出一个新的伤口，可以促进外植体对培养基营养的吸收，从而利于芽伸长；所述芽伸长培养基(SEM)中包含：0.9-1.1mg/L的赤霉素和0.08-0.12mg/L的生长素；
3)幼苗生根：步骤2)中的丛生芽长至3cm以上时，将伸长的丛生芽从基部切下接到生根培养基(RM)中诱导生根；发明人发现当丛生芽长度大于等于3cm时进行生根，可以提高幼苗后期在炼苗室的存活率，有效避免幼苗生根但不存活的问题；
4)幼苗的移栽与驯化：步骤3)中诱导产生3-4条根后，将根部粘连的培养基清洗干净，防止根部坏死，移栽到装有灭菌的蛭石的容器中，浇足水，用设有透气孔的透明罩罩住幼苗并置于光照培养箱中培养7d，待再生植株初步适应环境后，揭开透明罩，将幼苗转至装有灭菌土壤的花盆中并转入炼苗室中培养，每3-5d浇一次水，每两周浇一次营养液。发明人发现产生3-4条根时移栽，相对时间周期短，且存活率高；用透明罩罩住可以保持湿度，给幼苗一定的适应时间，避免幼苗从湿度较大的培养基直接转移到培养箱中因失水而造成死亡；透明罩上设有透气孔，可在增加湿度的同时方便空气交换，进一步提高成活率。
本发明目的之三是提供上述提高大豆组培丛生芽伸长率和遗传转化效率的方法在大豆遗传转化中的应用。
本发明还提供所述大豆遗传转化的一种优选方案：包括如下步骤：
1)大豆种子的消毒：挑选粒大、饱满、无斑、种皮完好的成熟大豆种子，75％酒精擦拭种子表面后放入真空灭菌器里，进行氯气灭菌6h；
2)大豆种子的吸胀：步骤1)中灭菌后的种子用无菌水黑暗中浸泡16–18h，浸泡温度为22-24℃；
3)农杆菌的收集及重悬：培养至对数生长期的农杆菌离心收集后用液体CCM重新悬浮，重悬后农杆菌菌液OD650值保持在0.68-0.72，菌液用于侵染之前在70rpm,22℃摇床中培养0.5h；发明人发现，通过控制菌液OD650值在0.68-0.72，可以明显提高外植体的侵染率，且通过侵染之前的摇床培养，可以让农杆菌提前适应悬浮液环境，适应后有助于农杆菌进行侵染，从而进一步提高侵染率；
4)外植体的制备与农杆菌侵染：沿着子叶节下胚轴的方向平行切开，去掉种皮，保留子叶及下方0.28-0.32cm下胚轴，这种方式制备的优势是保留的下胚轴会继续生长，方便以后组织培养时切出新的伤口；将切好的外植体放入步骤3)的菌液中，使菌液没过外植体，浸泡30min，期间不时轻摇菌液，使菌液与外植体充分接触；
5)共培养：在共培养培养基(CCM)上放一张无菌滤纸，将步骤4)中侵染后的外植体上多余的菌液吸干，置于无菌滤纸上，外植体近轴面朝上，封口；在组培室中培养5d，使农杆菌和外植体的生长点的侵染更充分；
6)丛生芽诱导：将农杆菌侵染的外植体用洗涤液清洗后，吸去多余水分，将外植体近轴面朝上，下胚轴倾斜45度插入芽诱导培养基(SIM)中进行芽诱导培养，14d后换至新的芽诱导培养基(SIM)中继续培养；
7)芽伸长：将步骤6)产生丛生芽的外植体切掉大芽和下胚轴底部的老化组织，移至芽伸长培养基(SEM)中培养2-10周，每两周更换一次芽伸长培养基(SEM)，每次更换时都在外植体的基部切出一个新的伤口；所述芽伸长培养基(SEM)中包含：0.9-1.1mg/L的赤霉素和0.08-0.12mg/L的生长素；
8)幼苗生根：步骤7)中的丛生芽长至3cm以上时，将伸长的丛生芽从基部切下接到生根培养基(RM)中诱导生根；
9)幼苗的移栽与驯化：步骤8)中诱导产生3-4条根后，将根部粘连的培养基清洗干净，移栽到装有灭菌的蛭石的容器中，浇足水，用设有透气孔的透明罩罩住幼苗并置于光照培养箱中培养7d，待再生植株初步适应环境后，揭开透明罩，将幼苗转至装有灭菌土壤的花盆中并转入炼苗室中培养，每3-5d浇一次水，每两周浇一次营养液。
优选的，本发明氯气灭菌所用氯气为100ml NaClO和10ml HCl。
优选的，本发明大豆种子浸泡温度优选为23℃。
本发明培养至对数生长期的农杆菌的培养方法可以为现有技术中常用的任何方法，作为一种优选，本发明选用的方法为：-80℃保存的转化菌液在冰上融化后混匀，用无菌接种环蘸取菌液在加入抗生素的YEB固体培养基上划线，封口后在28℃摇床上培养两天；第一次活化是挑取单克隆接种到装有YEB液体培养基的小管中，250rpm,28℃摇床上培养过夜直至菌液生长至饱和；第二次活化是取饱和菌液加入装有YEB液体培养基的锥形瓶中，250rpm,28℃培养至对数生长期。
优选的，所述YEB固体培养基的配比为：氯化钠5g/L、胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、卡那霉素(Kana)50mg/L、氯霉素(Chl)25mg/L、壮观霉素(Spec)100mg/L、链霉素(Str)50mg/L、琼脂粉(Agar powder)12.5g/L。
优选的，所述YEB液体培养基的配比为：氯化钠5g/L、胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、卡那霉素(Kana)50mg/L、氯霉素(Chl)25mg/L、壮观霉素(Spec)100mg/L、链霉素(Str)50mg/L。
优选的，本发明培养至对数生长期的农杆菌离心收集所用条件：室温下5000rpm离心10min。
优选的，本发明所述的液体CCM的配比为：B5大量5mg/L、B5微量0.5mg/L、Fe盐0.5mg/L、B5有机1mg/L、蔗糖30g/L、MES 3.9g/L、细胞分裂素(6-BA)1.67mg/L、赤霉素(GA3)0.25mg/L、乙酰丁香酮(AS)40mg/L、二硫苏糖醇(DTT)154.2mg/L；本发明还提供所述液体CCM的配制方法：B5大量5mg/L、B5微量0.5mg/L、Fe盐0.5mg/L、B5有机1mg/L、蔗糖30g/L、MES3.9g/L、将溶液pH调到5.4，高温灭菌后添加细胞分裂素(6-BA)1.67mg/L、赤霉素(GA3)0.25mg/L、乙酰丁香酮(AS)40mg/L、二硫苏糖醇(DTT)154.2mg/L；其中：B5大量的配比为：KNO3 50g/L，MgSO4·7H2O 5g/L，NaH2PO4·2H2O 3g/L，(NH4)2SO4 2.68g/L，CaCl2·2H2O 3g/L；B5微量的配比为：H3BO3 0.6g/L，MnSO4·H2O 2g/L，ZnSO4·7H2O 0.4g/L，Na2MoO4·2H2O0.05g/L，CuSO4·5H2O 0.05g/L，CoCl2·6H2O 0.05g/L，KI 0.15g/L；Fe盐的配比为：FeSO4·7H2O 5.56g/L，Na2EDTA·2H2O 7.46g/L；B5有机的配比为：烟酸0.1g/L，肌醇10g/L，维生素B1 1g/L，维生素B6 0.1g/L。
优选的，本发明共培养步骤中组培室的光照和温度条件为：16h光/8h暗，24℃白天/22℃夜间。
优选的，本发明共培养步骤中共培养培养基(CCM)的配比为：B5大量5mg/L、B5微量0.5mg/L、Fe盐0.5mg/L、B5有机1mg/L、蔗糖30g/L、MES 3.9g/L、琼脂糖5g/L、细胞分裂素(6-BA)1.67mg/L、赤霉素(GA3)0.25mg/L、乙酰丁香酮(AS)40mg/L、二硫苏糖醇(DTT)154.2mg/L、半胱氨酸(L-cys)400mg/L、硫代硫酸钠(NaThio)158mg/L；本发明还提供所述共培养培养基(CCM)的配制方法：B5大量5mg/L、B5微量0.5mg/L、Fe盐0.5mg/L、B5有机1mg/L、蔗糖30g/L、MES 3.9g/L、将溶液pH调到5.4后加入琼脂糖5g/L，高温灭菌后添加细胞分裂素(6-BA)1.67mg/L、赤霉素(GA3)0.25mg/L、乙酰丁香酮(AS)40mg/L、二硫苏糖醇(DTT)154.2mg/L、半胱氨酸(L-cys)400mg/L、硫代硫酸钠(NaThio)158mg/L。其中：B5大量的配比为：KNO3 50g/L，MgSO4·7H2O 5g/L，NaH2PO4·2H2O 3g/L，(NH4)2SO4 2.68g/L，CaCl2·2H2O 3g/L；B5微量的配比为：H3BO3 0.6g/L，MnSO4·H2O 2g/L，ZnSO4·7H2O 0.4g/L，Na2MoO4·2H2O 0.05g/L，CuSO4·5H2O 0.05g/L，CoCl2·6H2O 0.05g/L，KI 0.15g/L；Fe盐的配比为：FeSO4·7H2O5.56g/L，Na2EDTA·2H2O 7.46g/L；B5有机的配比为：烟酸0.1g/L，肌醇10g/L，维生素B1 1g/L，维生素B6 0.1g/L。
优选的，本发明丛生芽诱导步骤中洗涤液的配比为：B5大量50ml/L、B5微量5ml/L、Fe盐5ml/L、B5有机10ml/L、蔗糖30g/L、2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物(MES)0.58g/L、细胞分裂素(6-BA)1.67mg/L、赤霉素(GA3)0.25mg/L、头孢霉素(Cef)50mg/L、羧苄青霉素(Carb)500mg/L。本发明还提供所述洗涤液的配制方法：B5大量50ml/L、B5微量5ml/L、Fe盐5ml/L、B5有机10ml/L、蔗糖30g/L、2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物(MES)0.58g/L，将溶液pH调到5.6，高温灭菌后添加细胞分裂素(6-BA)1.67mg/L、赤霉素(GA3)0.25mg/L、头孢霉素(Cef)50mg/L、羧苄青霉素(Carb)500mg/L；其中：B5大量的配比为：KNO3 50g/L，MgSO4·7H2O 5g/L，NaH2PO4·2H2O 3g/L，(NH4)2SO4 2.68g/L，CaCl2·2H2O 3g/L；B5微量的配比为：H3BO3 0.6g/L，MnSO4·H2O 2g/L，ZnSO4·7H2O 0.4g/L，Na2MoO4·2H2O 0.05g/L，CuSO4·5H2O 0.05g/L，CoCl2·6H2O 0.05g/L，KI 0.15g/L；Fe盐的配比为：FeSO4·7H2O 5.56g/L，Na2EDTA·2H2O7.46g/L；B5有机的配比为：烟酸0.1g/L，肌醇10g/L，维生素B1 1g/L，维生素B6 0.1g/L。
优选的，本发明丛生芽诱导步骤中洗涤液清洗的方法为：清洗3次，清洗时间依次分别是5min、30min和5min。
优选的，本发明丛生芽诱导步骤中芽诱导培养基SIM的配比为：B5大量50ml/L、B5微量5ml/L、Fe盐5ml/L、B5有机10ml/L、蔗糖30g/L、MES 0.58g/L、凝胶3.5g/L、细胞分裂素(6-BA)1.67mg/L、头孢霉素(Cef)50mg/L、羧苄青霉素(Carb)500mg/L、筛选剂5mg/L；本发明还提供所述芽诱导培养基的配制方法：B5大量50ml/L、B5微量5ml/L、Fe盐5ml/L、B5有机10ml/L、蔗糖30g/L、MES 0.58g/L、将溶液pH调到5.6后加入凝胶3.5g/L，高温灭菌后添加细胞分裂素(6-BA)1.67mg/L、头孢霉素(Cef)50mg/L、羧苄青霉素(Carb)500mg/L、筛选剂5mg/L；其中：B5大量的配比为：KNO3 50g/L，MgSO4·7H2O 5g/L，NaH2PO4·2H2O 3g/L，(NH4)2SO42.68g/L，CaCl2·2H2O 3g/L；B5微量的配比为：H3BO3 0.6g/L，MnSO4·H2O 2g/L，ZnSO4·7H2O0.4g/L，Na2MoO4·2H2O 0.05g/L，CuSO4·5H2O 0.05g/L，CoCl2·6H2O 0.05g/L，KI 0.15g/L；Fe盐的配比为：FeSO4·7H2O 5.56g/L，Na2EDTA·2H2O 7.46g/L；B5有机的配比为：烟酸0.1g/L，肌醇10g/L，维生素B1 1g/L，维生素B6 0.1g/L。
本发明芽伸长步骤中芽伸长培养基(SEM)如上所述。
本发明中培养基所用筛选剂是根据转入基因载体的选择而选择相应的筛选剂，如草丁膦(Glu)作为筛选剂。
优选的，本发明幼苗生根步骤中生根培养基(RM)的配比为：B5大量25ml/L、B5微量2.5ml/L、Fe盐2.5ml/L、B5有机2.5ml/L、蔗糖15g/L、MES 0.59g/L、琼脂粉8g/L、生长素类似物(IBA)1mg/L。本发明还提供所述生根培养基(RM)的配制方法：B5大量25ml/L、B5微量2.5ml/L、Fe盐2.5ml/L、B5有机2.5ml/L、蔗糖15g/L、MES 0.59g/L、将溶液pH调到5.7后加入琼脂粉8g/L，高温灭菌后添加生长素类似物(IBA)1mg/L；其中：B5大量的配比为：KNO3 50g/L，MgSO4·7H2O 5g/L，NaH2PO4·2H2O 3g/L，(NH4)2SO4 2.68g/L，CaCl2·2H2O 3g/L；B5微量的配比为：H3BO3 0.6g/L，MnSO4·H2O 2g/L，ZnSO4·7H2O 0.4g/L，Na2MoO4·2H2O 0.05g/L，CuSO4·5H2O 0.05g/L，CoCl2·6H2O 0.05g/L，KI 0.15g/L；Fe盐的配比为：FeSO4·7H2O5.56g/L，Na2EDTA·2H2O 7.46g/L；B5有机的配比为：烟酸0.1g/L，肌醇10g/L，维生素B1 1g/L，维生素B6 0.1g/L。
优选的，本发明幼苗的移栽与驯化步骤中光照培养箱和炼苗室中的培养条件均为：14h光/10h暗，28℃白天/24℃夜间，相对湿度70％。
优选的，本发明幼苗的移栽与驯化步骤中的灭菌土壤优选配比为：营养土：蛭石质量比为1:1。
本发明幼苗的移栽与驯化步骤中所用的营养液可以为遗传转化过程中常用的营养液，作为本发明优选的一种具体选择，其配比为：大量10ml/L(大量的配比：硝酸钾50.6g/L、七水硫酸镁49.3g/L、四水硝酸钙94.5g/L、磷酸二氢钾13.6g/L、硝酸铵8g/L)，微量5ml/L(微量的配比：硼酸1.24g/L、一水硫酸锰3.38g/L、七水硫酸锌1.72g/L、二水钼酸钠0.05g/L、五水硫酸铜0.05g/L、六水氯化钴0.05g/L、碘化钾0.0166g/L)，Fe盐5ml/L(Fe盐的配比：七水硫酸亚铁5.56g/L、Na2EDTA·2H2O 7.46g/L)。
本发明所用的大豆种子可以为任何大豆品种，为了更好的实施本发明，优选大豆品种为Jack Purple和天隆1号。
本发明通过对不同大豆品种、最适农杆菌侵染浓度、重悬液成分、共培养时间和外植体的获取方式等方面进行优化过后，农杆菌侵染效率可达到96％；通过调整芽伸长培养基SEM芽伸长培养基的激素配比，以及优化具体方法等措施，可以实现幼苗生根率达100％，并且大幅度提高了丛生芽的伸长率和遗传转化效率，可以显著提高大豆组培丛生芽的伸长率和大豆遗传转化效率，为今后大豆基因功能的研究和大豆分子育种提供技术支撑，通过转基因技术验证可以提高大豆产量、抗性(病虫害、逆境、除草剂等)或改良品质等关键基因的功能，挖掘基因资源，获得自主知识产权，培育性状改良的大豆新品种，提高我国大豆的分子育种能力和国际竞争力。
附图说明
图1为大豆品种Jack Purple的伸长效果对比图；
图2为两种大豆品种的芽伸长率和转化效率的对比统计图；
图3为遗传转化各阶段的实验效果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，下面实施例未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段。
实施例1
一种芽伸长培养基，所述培养基包含：1mg/L的赤霉素和0.1mg/L的生长素，优选的一种具体配比方案为：MS大量50ml/L、MS微量5ml/L、Fe盐5ml/L、B5有机10ml/L、蔗糖30g/L、MES 0.58g/L、将溶液pH调到5.6后加入凝胶3.5g/L，高温灭菌后添加赤霉素(GA3)1mg/L、生长素(IAA)0.1mg/L、玉米素(ZR)1mg/L、L-天冬酰胺酶(Asp)50mg/L、L-焦谷氨酰胺(L-pyro)100mg/L、头孢霉素(Cef)75mg/L、羧苄青霉素(Carb)500mg/L、筛选剂3mg/L；其中基础培养基的配方如表1所示，用时稀释：
表1基础培养基的配方
对比实验1
大豆品种选择Jack Purple和天隆1号进行试验，实验设计：大豆品种选择JackPurple和天隆1号进行试验，实验设计：GA3浓度为0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L，IAA浓度为0.1mg/L、0.2mg/L，3×2一共6组处理，每个组合取80个农杆菌侵染的外植体进行处理，芽诱导培养基(SIM)和芽伸长培养基(SEM)中筛选剂草丁膦(Glu)的浓度分别为5mg/L和3mg/L，2次重复。
SEM5结束后统计芽伸长率和转化效率。其中芽伸长率和转化效率计算方法如下：
芽伸长率(％)＝(伸长的芽数(长度≥3cm)/侵染的外植体数)×100％
转化效率(％)＝(阳性转基因苗数/侵染外植体数)×100％
结果如表2所示，同一列标记相同的小写字母表示它们在最短显著极差法(shortest significant ranges,SSR)测验中5％水平上不存在显著性差异，标有不同的字母表示它们在5％水平上存在显著性差异。
表2不同组的芽伸长率和转化效率
通过表2实验数据可以看出，在GA3浓度为1.0mg/L和IAA浓度为0.1mg/L这个组合中，无论是芽伸长率还是转化效率，相对于其他对照组都有显著的提高。
对比实验2
大豆品种选择Jack Purple和天隆1号，实验设计：对比组A组的芽伸长培养基中GA3为0.5mg/L，IAA为0.1mg/L，实验组B组的芽伸长培养基中GA3为1mg/L，IAA为0.1mg/L，芽诱导培养基(SIM)和芽伸长培养基(SEM)中筛选剂草丁膦(Glu)的浓度分别为5mg/L和3mg/L。
实验结果如图1和图2所示，其中图1为大豆品种Jack Purple的伸长效果对比图，其中A为对比组A组的大豆品种Jack Purple的伸长效果，B为实验组B组的大豆品种JackPurple的伸长效果；图2为两种大豆品种的芽伸长率和转化效率的对比统计图。通过图1和图2的实验结果可以看出：将该发明应用到两个大豆品种Jack Purple和天隆1号中，使用实施例所述的GA3为1mg/L，IAA为0.1mg/L的培养基配方，大豆组培丛生芽伸长效率分别由16.11％和14.75％提高到了33.54％和26.08％，伸长效率提高了近两倍，大豆遗传转化效率从5.00％和4.28％提高到了7.32％和10.01％，效果明显。
由此可见，本技术在原有背景技术的基础上，改善了大豆遗传转化所用培养基中激素浓度的配比，大幅度提高了大豆组培丛生芽伸长效率和大豆遗传转化效率。
实施例2大豆遗传转化方法
本实施例提供一种大豆遗传转化方法，具体包括如下步骤：
1)大豆种子的消毒：挑选粒大、饱满、无斑、种皮完好的成熟大豆种子，75％酒精擦拭种子表面后放入真空灭菌器里，进行氯气灭菌6h；
2)大豆种子的吸胀：步骤1)中灭菌后的种子用无菌水黑暗中浸泡16–18h，浸泡温度为23℃；
3)农杆菌的收集及重悬：-80℃保存的转化菌液在冰上融化后混匀，用无菌接种环蘸取菌液在加入抗生素的YEB固体培养基上划线，封口后在28℃摇床上培养两天；第一次活化是挑取单克隆接种到装有YEB液体培养基的小管中，250rpm,28℃摇床上培养过夜直至菌液生长至饱和；第二次活化是取饱和菌液加入装有YEB液体培养基的锥形瓶中，250rpm,28℃培养至对数生长期；培养至对数生长期的农杆菌室温下5000rpm离心10min收集后用液体CCM重新悬浮，重悬后农杆菌菌液OD650值保持在0.68-0.72，菌液用于侵染之前在70rpm,22℃摇床中培养0.5h；
4)外植体的制备与农杆菌侵染：沿着子叶节下胚轴的方向平行切开，去掉种皮，保留子叶及下方0.28-0.32cm下胚轴，这种方式制备的优势是保留的下胚轴会继续生长，方便以后组织培养时切出新的伤口；将切好的外植体放入步骤3)的菌液中，使菌液没过外植体，浸泡30min，期间不时轻摇菌液，使菌液与外植体充分接触；
5)共培养：在共培养培养基(CCM)上放一张无菌滤纸，将步骤4)中侵染后的外植体上多余的菌液吸干，置于无菌滤纸上，外植体近轴面朝上，封口；在组培室(16h光/8h暗，24℃白天/22℃夜间)中培养5d，使农杆菌和外植体的生长点的侵染更充分；侵染效率达到96％；
6)丛生芽诱导：将农杆菌侵染的外植体用洗涤液清洗3次，清洗时间依次分别是5min、30min和5min，吸去多余水分，将外植体近轴面朝上，下胚轴倾斜45度插入芽诱导培养基(SIM)中进行芽诱导培养，14d后换至新的芽诱导培养基(SIM)中继续培养；
7)芽伸长：将步骤6)产生丛生芽的外植体切掉大芽和下胚轴底部的老化组织，移至芽伸长培养基(SEM)中培养2-10周，每两周更换一次芽伸长培养基(SEM)，每次更换时都在外植体的基部切出一个新的伤口；
8)幼苗生根：步骤7)中的丛生芽长至3cm以上时，将伸长的丛生芽从基部切下接到生根培养基(RM)中诱导生根；幼苗生根率达100％；
9)幼苗的移栽与驯化：步骤8)中诱导产生3-4条根后，将根部粘连的培养基清洗干净，移栽到装有灭菌的蛭石的容器中，浇足水，用设有透气孔的透明罩罩住幼苗并置于光照培养箱(14h光/10h暗，28℃白天/24℃夜间，相对湿度70％)中培养7d，待再生植株初步适应环境后，揭开透明罩，将幼苗转至装有灭菌土壤(营养土：蛭石质量比为1:1)的花盆中并转入炼苗室(14h光/10h暗，28℃白天/24℃夜间，相对湿度70％)中培养，每3-5d浇一次水，每两周浇一次营养液。
其中所涉及的培养基的配比如下：
YEB固体培养基的配比为：氯化钠5g/L、胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、卡那霉素(Kana)50mg/L、氯霉素(Chl)25mg/L、壮观霉素(Spec)100mg/L、链霉素(Str)50mg/L、琼脂粉(Agar powder)12.5g/L。
YEB液体培养基的配比为：氯化钠5g/L、胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、卡那霉素(Kana)50mg/L、氯霉素(Chl)25mg/L、壮观霉素(Spec)100mg/L、链霉素(Str)50mg/L。
液体CCM的配制方法：B5大量5mg/L、B5微量0.5mg/L、Fe盐0.5mg/L、B5有机1mg/L、蔗糖30g/L、MES 3.9g/L、将溶液pH调到5.4后加入凝胶3.5g/L，高温灭菌后添加细胞分裂素(6-BA)1.67mg/L、赤霉素(GA3)0.25mg/L、乙酰丁香酮(AS)40mg/L、二硫苏糖醇(DTT)154.2mg/L；其中：B5大量的配比为：KNO3 50g/L，MgSO4·7H2O 5g/L，NaH2PO4·2H2O 3g/L，(NH4)2SO4 2.68g/L，CaCl2·2H2O 3g/L；B5微量的配比为：H3BO3 0.6g/L，MnSO4·H2O 2g/L，ZnSO4·7H2O 0.4g/L，Na2MoO4·2H2O 0.05g/L，CuSO4·5H2O 0.05g/L，CoCl2·6H2O 0.05g/L，KI 0.15g/L；Fe盐的配比为：FeSO4·7H2O 5.56g/L，Na2EDTA·2H2O 7.46g/L；B5有机的配比为：烟酸0.1g/L，肌醇10g/L，维生素B1 1g/L，维生素B6 0.1g/L。
共培养培养基(CCM)的配制方法：B5大量5mg/L、B5微量0.5mg/L、Fe盐0.5mg/L、B5有机1mg/L、蔗糖30g/L、MES 3.9g/L、将溶液pH调到5.4后加入琼脂糖5g/L，高温灭菌后添加细胞分裂素(6-BA)1.67mg/L、赤霉素(GA3)0.25mg/L、乙酰丁香酮(AS)40mg/L、二硫苏糖醇(DTT)154.2mg/L、半胱氨酸(L-cys)400mg/L、硫代硫酸钠(NaThio)158mg/L。其中：B5大量的配比为：KNO3 50g/L，MgSO4·7H2O 5g/L，NaH2PO4·2H2O 3g/L，(NH4)2SO4 2.68g/L，CaCl2·2H2O 3g/L；B5微量的配比为：H3BO3 0.6g/L，MnSO4·H2O 2g/L，ZnSO4·7H2O 0.4g/L，Na2MoO4·2H2O 0.05g/L，CuSO4·5H2O 0.05g/L，CoCl2·6H2O 0.05g/L，KI 0.15g/L；Fe盐的配比为：FeSO4·7H2O 5.56g/L，Na2EDTA·2H2O 7.46g/L；B5有机的配比为：烟酸0.1g/L，肌醇10g/L，维生素B1 1g/L，维生素B6 0.1g/L。
丛生芽诱导步骤中洗涤液的配制方法：B5大量50ml/L、B5微量5ml/L、Fe盐5ml/L、B5有机10ml/L、蔗糖30g/L、2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物(MES)0.58g/L、将溶液pH调到5.6，高温灭菌后添加细胞分裂素(6-BA)1.67mg/L、赤霉素(GA3)0.25mg/L、头孢霉素(Cef)50mg/L、羧苄青霉素(Carb)500mg/L；其中：B5大量的配比为：KNO3 50g/L，MgSO4·7H2O 5g/L，NaH2PO4·2H2O 3g/L，(NH4)2SO4 2.68g/L，CaCl2·2H2O 3g/L；B5微量的配比为：H3BO3 0.6g/L，MnSO4·H2O 2g/L，ZnSO4·7H2O 0.4g/L，Na2MoO4·2H2O 0.05g/L，CuSO4·5H2O 0.05g/L，CoCl2·6H2O 0.05g/L，KI 0.15g/L；Fe盐的配比为：FeSO4·7H2O 5.56g/L，Na2EDTA·2H2O7.46g/L；B5有机的配比为：烟酸0.1g/L，肌醇10g/L，维生素B1 1g/L，维生素B6 0.1g/L。
芽诱导培养基(SIM)的配制方法：B5大量50ml/L、B5微量5ml/L、Fe盐5ml/L、B5有机10ml/L、蔗糖30g/L、MES 0.58g/L、将溶液pH调到5.6后加入凝胶3.5g/L，高温灭菌后添加细胞分裂素(6-BA)1.67mg/L、头孢霉素(Cef)50mg/L、羧苄青霉素(Carb)500mg/L、筛选剂5mg/L；其中：B5大量的配比为：KNO3 50g/L，MgSO4·7H2O 5g/L，NaH2PO4·2H2O 3g/L，(NH4)2SO42.68g/L，CaCl2·2H2O 3g/L；B5微量的配比为：H3BO3 0.6g/L，MnSO4·H2O 2g/L，ZnSO4·7H2O0.4g/L，Na2MoO4·2H2O 0.05g/L，CuSO4·5H2O 0.05g/L，CoCl2·6H2O 0.05g/L，KI 0.15g/L；Fe盐的配比为：FeSO4·7H2O 5.56g/L，Na2EDTA·2H2O 7.46g/L；B5有机的配比为：烟酸0.1g/L，肌醇10g/L，维生素B1 1g/L，维生素B6 0.1g/L。
芽伸长培养基(SEM)的配制方法：MS大量50ml/L、MS微量5ml/L、Fe盐5ml/L、B5有机10ml/L、蔗糖30g/L、2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物(MES)0.58g/L、将溶液pH调到5.6后加入凝胶3.5g/L，高温灭菌后添加1mg/L的赤霉素(GA3)、0.1mg/L的生长素、玉米素(ZR)1mg/L、L-天冬酰胺酶(Asp)50mg/L、L-焦谷氨酰胺(L-pyro)100mg/L、头孢霉素(Cef)75mg/L、羧苄青霉素(Carb)500mg/L、筛选剂3mg/L；其中：MS大量的配比为：KNO3 38g/L，MgSO4·7H2O 7.4g/L，NH4NO3 33g/L，KH2PO4 3.4g/L，CaCl2·2H2O 8.8g/L；MS微量的配比为：H3BO3 1.24g/L，MnSO4·H2O 3.38g/L，ZnSO4·7H2O 1.72g/L，Na2MoO4·2H2O 0.05g/L，CuSO4·5H2O 0.05g/L，CoCl2·6H2O 0.05g/L，KI0.0166g/L；Fe盐的配比为：FeSO4·7H2O 5.56g/L，Na2EDTA·2H2O 7.46g/L；B5有机的配比为：烟酸0.1g/L，肌醇10g/L，维生素B1 1g/L，维生素B6 0.1g/L。
生根培养基(RM)的配制方法：B5大量25ml/L、B5微量2.5ml/L、Fe盐2.5ml/L、B5有机2.5ml/L、蔗糖15g/L、MES 0.59g/L、将溶液pH调到5.7后加入琼脂粉8g/L，高温灭菌后添加生长素类似物(IBA)1mg/L；其中：B5大量的配比为：KNO3 50g/L，MgSO4·7H2O 5g/L，NaH2PO4·2H2O 3g/L，(NH4)2SO4 2.68g/L，CaCl2·2H2O 3g/L；B5微量的配比为：H3BO3 0.6g/L，MnSO4·H2O 2g/L，ZnSO4·7H2O 0.4g/L，Na2MoO4·2H2O 0.05g/L，CuSO4·5H2O 0.05g/L，CoCl2·6H2O 0.05g/L，KI 0.15g/L；Fe盐的配比为：FeSO4·7H2O 5.56g/L，Na2EDTA·2H2O7.46g/L；B5有机的配比为：烟酸0.1g/L，肌醇10g/L，维生素B1 1g/L，维生素B6 0.1g/L。
实验结果：
本实施例所述方法每一步的实验效果如图3所示，其中个字母代表的阶段如下：A.大豆种子真空氯气灭菌，B.种子浸泡，C.农杆菌菌液收集，D.侵染30min，E.共培养培养，F、G.芽诱导培养，H.芽伸长培养，I.生根培养基，J、K.炼苗及驯化。

Claims (10)

1.一种提高大豆组培丛生芽伸长率和遗传转化效率的方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)丛生芽诱导：将农杆菌侵染的外植体用洗涤液清洗后，将外植体近轴面朝上，下胚轴倾斜45度插入芽诱导培养基中进行芽诱导培养，14d后换至新的芽诱导培养基中继续培养；
2)芽伸长：将步骤1)产生丛生芽的外植体切掉大芽和下胚轴底部的老化组织，移至芽伸长培养基中培养2-10周，每两周更换一次芽伸长培养基，每次更换时都在外植体的基部切出一个新的伤口；所述芽伸长培养基中包含：0.9-1.1mg/L的赤霉素和0.08-0.12mg/L的生长素；
3)幼苗生根：步骤2)中的丛生芽长至3cm以上时，将伸长的丛生芽从基部切下接到生根培养基中诱导生根；
4)幼苗的移栽与驯化：步骤3)中诱导产生3-4条根后，将根部粘连的培养基清洗干净，移栽到装有灭菌的蛭石的容器中，浇足水，用设有透气孔的透明罩罩住幼苗并置于光照培养箱中培养7d，待再生植株初步适应环境后，揭开透明罩，将幼苗转至装有灭菌土壤的花盆中并转入炼苗室中培养，每3-5d浇一次水，每两周浇一次营养液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2)中芽伸长培养基的配比为：MS大量50ml/L、MS微量5ml/L、Fe盐5ml/L、B5有机10ml/L、蔗糖30g/L、2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物0.58g/L、凝胶3.5g/L、赤霉素1mg/L、生长素0.1mg/L、玉米素1mg/L、L-天冬酰胺酶50mg/L、L-焦谷氨酰胺100mg/L、头孢霉素75mg/L、羧苄青霉素500mg/L、筛选剂3mg/L；其中：MS大量的配比为：KNO3 38g/L，MgSO4·7H2O 7.4g/L，NH4NO3 33g/L，KH2PO4 3.4g/L，CaCl2·2H2O8.8g/L；MS微量的配比为：H3BO3 1.24g/L，MnSO4·H2O 3.38g/L，ZnSO4·7H2O 1.72g/L，Na2MoO4·2H2O 0.05g/L，CuSO4·5H2O 0.05g/L，CoCl2·6H2O 0.05g/L，KI 0.0166g/L；Fe盐的配比为：FeSO4·7H2O 5.56g/L，Na2EDTA·2H2O 7.46g/L；B5有机的配比为：烟酸0.1g/L，肌醇10g/L，维生素B1 1g/L，维生素B6 0.1g/L。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)中所述洗涤液的配比为：B5大量50ml/L、B5微量5ml/L、Fe盐5ml/L、B5有机10ml/L、蔗糖30g/L、2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物0.58g/L、细胞分裂素1.67mg/L、赤霉素0.25mg/L、头孢霉素50mg/L、羧苄青霉素500mg/L；其中：B5大量的配比为：KNO3 50g/L，MgSO4·7H2O 5g/L，NaH2PO4·2H2O 3g/L，(NH4)2SO42.68g/L，CaCl2·2H2O 3g/L；B5微量的配比为：H3BO3 0.6g/L，MnSO4·H2O 2g/L，ZnSO4·7H2O0.4g/L，Na2MoO4·2H2O 0.05g/L，CuSO4·5H2O 0.05g/L，CoCl2·6H2O 0.05g/L，KI 0.15g/L；Fe盐的配比为：FeSO4·7H2O 5.56g/L，Na2EDTA·2H2O 7.46g/L；B5有机的配比为：烟酸0.1g/L，肌醇10g/L，维生素B1 1g/L，维生素B6 0.1g/L；步骤1)中洗涤液清洗的方法优选为：清洗3次，清洗时间依次分别是5min、30min和5min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)中芽诱导培养基的配比为：B5大量50ml/L、B5微量5ml/L、Fe盐5ml/L、B5有机10ml/L、蔗糖30g/L、2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物0.58g/L、凝胶3.5g/L、细胞分裂素1.67mg/L、头孢霉素50mg/L、羧苄青霉素500mg/L、筛选剂5mg/L；步骤3)中生根培养基的配比为：B5大量25ml/L、B5微量2.5ml/L、Fe盐2.5ml/L、B5有机2.5ml/L、蔗糖15g/L、2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物0.59g/L、琼脂粉8g/L、生长素类似物1mg/L；其中：B5大量的配比为：KNO3 50g/L，MgSO4·7H2O 5g/L，NaH2PO4·2H2O 3g/L，(NH4)2SO4 2.68g/L，CaCl2·2H2O 3g/L；B5微量的配比为：H3BO3 0.6g/L，MnSO4·H2O 2g/L，ZnSO4·7H2O 0.4g/L，Na2MoO4·2H2O 0.05g/L，CuSO4·5H2O 0.05g/L，CoCl2·6H2O 0.05g/L，KI 0.15g/L；Fe盐的配比为：FeSO4·7H2O 5.56g/L，Na2EDTA·2H2O 7.46g/L；B5有机的配比为：烟酸0.1g/L，肌醇10g/L，维生素B1 1g/L，维生素B6 0.1g/L。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤4)中光照培养箱和炼苗室中的培养条件均为：14h光/10h暗，28℃白天/24℃夜间，相对湿度70％。
6.权利要求1-5任一项所述方法在大豆遗传转化中的应用，其特征在于，包括如下步骤：
1)大豆种子的消毒：挑选粒大、饱满、无斑、种皮完好的成熟大豆种子，75％酒精擦拭种子表面后放入真空灭菌器里，进行氯气灭菌6h；
2)大豆种子的吸胀：步骤1)中灭菌后的种子用无菌水黑暗中浸泡16–18h，浸泡温度为22-24℃；
3)农杆菌的收集及重悬：培养至对数生长期的农杆菌离心收集后用液体CCM重新悬浮，重悬后农杆菌菌液OD650值保持在0.68-0.72，菌液用于侵染之前在70rpm,22℃摇床中培养0.5h；
4)外植体的制备与农杆菌侵染：沿着子叶节下胚轴的方向平行切开，去掉种皮，保留子叶及下方0.28-0.32cm的下胚轴；将切好的外植体放入步骤3)的菌液中，使菌液没过外植体，浸泡30min，期间不时轻摇菌液，使菌液与外植体充分接触；
5)共培养：在共培养培养基上放一张无菌滤纸，将步骤4)中侵染后的外植体上多余的菌液吸干，置于无菌滤纸上，外植体近轴面朝上，封口；在组培室中培养5d；
6)丛生芽诱导：将农杆菌侵染的外植体用洗涤液清洗后，吸去多余水分，将外植体近轴面朝上，下胚轴倾斜45度插入芽诱导培养基中进行芽诱导培养，14d后换至新的芽诱导培养基中继续培养；
7)芽伸长：将步骤6)产生丛生芽的外植体切掉大芽和下胚轴底部的老化组织，移至芽伸长培养基中培养2-10周，每两周更换一次芽伸长培养基，每次更换时都在外植体的基部切出一个新的伤口；所述芽伸长培养基中包含：0.9-1.1mg/L的赤霉素和0.08-0.12mg/L的生长素；
8)幼苗生根：步骤7)中的丛生芽长至3cm以上时，将伸长的丛生芽从基部切下接到生根培养基中诱导生根；
9)幼苗的移栽与驯化：步骤8)中诱导产生3-4条根后，将根部粘连的培养基清洗干净，移栽到装有灭菌的蛭石的容器中，浇足水，用设有透气孔的透明罩罩住幼苗并置于光照培养箱中培养7d，待再生植株初步适应环境后，揭开透明罩，将幼苗转至装有灭菌土壤的花盆中并转入炼苗室中培养，每3-5d浇一次水，每两周浇一次营养液。
7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，选自以下培养基：
1)所述液体CCM的配比为：B5大量5mg/L、B5微量0.5mg/L、Fe盐0.5mg/L、B5有机1mg/L、蔗糖30g/L、2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物3.9g/L、细胞分裂素1.67mg/L、赤霉素0.25mg/L、乙酰丁香酮40mg/L、二硫苏糖醇154.2mg/L；其中：B5大量的配比为：KNO3 50g/L，MgSO4·7H2O5g/L，NaH2PO4·2H2O 3g/L，(NH4)2SO4 2.68g/L，CaCl2·2H2O 3g/L；B5微量的配比为：H3BO30.6g/L，MnSO4·H2O 2g/L，ZnSO4·7H2O 0.4g/L，Na2MoO4·2H2O 0.05g/L，CuSO4·5H2O0.05g/L，CoCl2·6H2O 0.05g/L，KI 0.15g/L；Fe盐的配比为：FeSO4·7H2O 5.56g/L，Na2EDTA·2H2O 7.46g/L；B5有机的配比为：烟酸0.1g/L，肌醇10g/L，维生素B1 1g/L，维生素B6 0.1g/L；
2)所述共培养培养基的配比为：B5大量5mg/L、B5微量0.5mg/L、Fe盐0.5mg/L、B5有机1mg/L、蔗糖30g/L、2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物3.9g/L、琼脂糖5g/L、细胞分裂素1.67mg/L、赤霉素0.25mg/L、乙酰丁香酮40mg/L、二硫苏糖醇154.2mg/L、半胱氨酸400mg/L、硫代硫酸钠158mg/L；其中：B5大量的配比为：KNO3 50g/L，MgSO4·7H2O 5g/L，NaH2PO4·2H2O 3g/L，(NH4)2SO4 2.68g/L，CaCl2·2H2O 3g/L；B5微量的配比为：H3BO3 0.6g/L，MnSO4·H2O 2g/L，ZnSO4·7H2O 0.4g/L，Na2MoO4·2H2O 0.05g/L，CuSO4·5H2O 0.05g/L，CoCl2·6H2O 0.05g/L，KI 0.15g/L；Fe盐的配比为：FeSO4·7H2O 5.56g/L，Na2EDTA·2H2O 7.46g/L；B5有机的配比为：烟酸0.1g/L，肌醇10g/L，维生素B1 1g/L，维生素B6 0.1g/L。
8.一种芽伸长培养基，其特征在于，所述培养基包含：0.9-1.1mg/L的赤霉素和0.08-0.12mg/L的生长素。
9.根据权利要求8所述的培养基，其特征在于，所述芽伸长培养基的配比为：MS大量50ml/L、MS微量5ml/L、Fe盐5ml/L、B5有机10ml/L、蔗糖30g/L、2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物0.58g/L、凝胶3.5g/L、赤霉素1mg/L、生长素0.1mg/L、玉米素1mg/L、L-天冬酰胺酶50mg/L、L-焦谷氨酰胺100mg/L、头孢霉素75mg/L、羧苄青霉素500mg/L、筛选剂3mg/L；其中：MS大量的配比为：KNO3 38g/L，MgSO4·7H2O 7.4g/L，NH4NO3 33g/L，KH2PO4 3.4g/L，CaCl2·2H2O8.8g/L；MS微量的配比为：H3BO3 1.24g/L，MnSO4·H2O 3.38g/L，ZnSO4·7H2O 1.72g/L，Na2MoO4·2H2O 0.05g/L，CuSO4·5H2O 0.05g/L，CoCl2·6H2O 0.05g/L，KI 0.0166g/L；Fe盐的配比为：FeSO4·7H2O 5.56g/L，Na2EDTA·2H2O 7.46g/L；B5有机的配比为：烟酸0.1g/L，肌醇10g/L，维生素B1 1g/L，维生素B6 0.1g/L。
10.权利要求8或9任一项所述培养基在大豆遗传转化中的应用。
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