CN105039238A - 一种大豆遗传转化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种大豆遗传转化方法。本发明提供了一种制备大豆外植体的方法，包括如下步骤：取发芽1d的大豆种子，制备大豆外植体。本发明还保护一种大豆遗传转化方法，包括如下步骤：对以上任一所述方法制备得到的大豆外植体进行遗传转化。本发明通过选取不同时期的大豆子叶为外植体，缩短了转化周期，并且提高了大豆转化效率。本发明对于大豆的遗传转化具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种大豆遗传转化方法。
背景技术
大豆(GlycinemaxL.Merr.)是重要的粮油兼用作物，也是目前转基因品种种植面积最大的作物。由于传统育种方法存在的局限性，使得转基因技术成为大豆新品种培育的重要手段。
大豆目前使用较为广泛的大豆转化体系，以根癌农杆菌介导的子叶节转化体系和基因枪介导的幼胚转化体系为主。由于基因枪介导的幼胚转化受外植体取材的限制，实际应用中主要还是采用根癌农杆菌介导的子叶节转化方法。根癌农杆菌转化体系周期长(通常是用发芽5天的种子制备外植体)、转化效率低，制约着大豆分子育种的发展。
发明内容
本发明的目的是提供一种大豆遗传转化方法。
本发明提供了一种制备大豆外植体的方法，包括如下步骤：取发芽1d的大豆种子，制备大豆外植体。
所述制备大豆外植体的方法可为：取种子，剥去种皮，从胚轴处将子叶从中间一分为二，在子叶和胚轴连接的部位平行划伤5-7次(具体可为6次)。
所述发芽1d的大豆种子的制备方法可为：将灭菌后的大豆种子接种于发芽培养基上，培养1天。所述培养的条件可为：温度为24℃；每天光照16小时，黑暗8小时。所述灭菌具体可为氯气灭菌。所述氯气灭菌的方法具体可为：将大豆种子平铺在培养皿中，然后将培养皿放入干燥器中，在干燥器中放入一个100ml容量的烧杯(向烧杯中先倒入80ml浓度为12M的次氯酸钠水溶液，再缓慢加入4ml浓盐酸)，然后迅速盖上干燥器，用凡士林密封，放置12-16小时(具体可为14小时)。所述发芽培养基的制备方法可为：将3.1gB5盐、30g蔗糖、1mlB5有机和7.5g琼脂溶于1L水。
所述大豆具体可为大豆品种Jack。
本发明还保护以上任一所述方法制备得到的大豆外植体。
本发明还保护以上任一所述方法制备得到的大豆外植体在大豆遗传转化中的应用。
本发明还保护一种大豆遗传转化方法，包括如下步骤：对以上任一所述方法制备得到的大豆外植体进行遗传转化。
所述“对以上任一所述方法制备得到的大豆外植体进行遗传转化”的方法如下：
(1)将“对以上任一所述方法制备得到的大豆外植体进行遗传转化”置于侵染菌液中，室温浸泡2小时；所述侵染菌液为重组农杆菌菌悬液；所述重组农杆菌通过将含有目的基因的重组表达载体导入出发农杆菌得到；
(2)完成步骤(1)后，取外植体，采用子叶内面向上的方式在共培养培养基上培养5天；
(3)完成步骤(2)后，取外植体，在恢复培养基上培养7天；
(4)完成步骤(3)后，取外植体在筛选培养基上培养21天；
(5)完成步骤(4)后，取外植体，切除子叶部分，将丛生芽转接到伸长培养基上，培养至丛生芽伸长3-4cm；
(6)完成步骤(5)后，取植株，剪取茎基部以上部分，先用1mg/ml吲哚丁酸水溶液浸泡茎基部，然后在生根培养基上培养至生根。
所述步骤(2)具体为：完成步骤(1)后，取外植体，将子叶内面(平滑面)向上，平铺于已铺有无菌滤纸的共培养培养基上，培养5天。
所述步骤(6)具体为：完成步骤(5)后，取植株，剪取茎基部以上部分，先用1mg/ml吲哚丁酸水溶液浸泡茎基部1min，然后在生根培养基上培养至生根。
所述步骤(2)中，所述培养的条件可为：温度22℃；每天光照16小时，黑暗8小时。所述步骤(3)中，所述培养的条件可为：温度25℃；每天光照16小时，黑暗8小时。所述步骤(4)中，所述培养的条件可为：温度25℃；每天光照16小时，黑暗8小时。所述步骤(5)中，所述培养的条件可为：温度25℃；每天光照16小时，黑暗8小时。所述步骤(6)中，所述培养的条件可为：温度25℃；每天光照16小时，黑暗8小时。
所述液体培养基的制备方法可为：将0.43gMS盐、40mg乙酰丁香酮、150mg二硫苏糖醇、100mgL-半胱氨酸、30g蔗糖、1mlB5有机和3.9g2-吗啉乙磺酸溶于1L水；pH5.4。所述共培养培养基的制备方法可为：将0.43gMS盐、40mg乙酰丁香酮、150mg二硫苏糖醇、100mgL-半胱氨酸、30g蔗糖、7.5g琼脂、1mlB5有机和3.9g2-吗啉乙磺酸溶于1L水；pH5.4。所述恢复培养基的制备方法可为：将3.1gB5盐、0.98g2-吗啉乙磺酸、30g蔗糖、7.5g琼脂、1mlB5有机、150mg头孢霉素、150mg特美汀和1mg6-BA溶于1L水；pH5.4。所述筛选培养基的制备方法可为：将3.1gB5盐、0.98g2-吗啉乙磺酸、30g蔗糖、7.5g琼脂、1mlB5有机、150mg头孢霉素、150mg特美汀、1mg6-BA和8mg草丁膦溶于1L水；pH5.4。所述伸长培养基的制备方法可为：将4.0gMS盐、0.6g2-吗啉乙磺酸、30g蔗糖、7.5g琼脂、1mlB5有机、150mg头孢霉素、150mg特美汀、0.1mgIAA、0.5mgGA、1mg6-BA和8mg草丁膦溶于1L水；pH5.6。所述生根培养基的制备方法可为：将2.165gMS盐、0.6g2-吗啉乙磺酸、20g蔗糖、7.5g琼脂和1mlB5有机溶于1L水；pH5.7。
所述重组表达载体具体可为pTF101.1载体。所述出发农杆菌具体可为根癌农杆菌EHA101。
所述侵染菌液的制备方法具体为：将所述重组表达载体导入根癌农杆菌EHA101，得到重组农杆菌；用液体培养基重悬所述重组农杆菌，得到OD600nm＝0.6的浸染菌液。液体培养基的制备方法具体可为：将0.43gMS盐、40mg乙酰丁香酮、150mg二硫苏糖醇、100mgL-半胱氨酸、30g蔗糖、1mlB5有机和3.9g2-吗啉乙磺酸溶于1L水；pH5.4。
所述大豆具体可为大豆品种Jack。
因此，本发明通过选取不同时期的大豆子叶为外植体，缩短了转化周期，并且提高了大豆转化效率。本发明对于大豆的遗传转化具有重要的应用价值。
附图说明
图1为实施例1的步骤一的2中培养5天的种子。
图2为实施例1的步骤一的3中子叶一分为二后的照片。
图3为实施例1的步骤三中培养5天的外植体。
图4为实施例1的步骤四中的照片。
图5为实施例1的步骤五中的照片。
图6为实施例1的步骤六中培养15天的照片。
图7为实施例1的步骤八中的照片。
图8为实施例2的步骤一的2中培养1天的种子。
图9为实施例2的步骤一的3中子叶一分为二后的照片。
图10为实施例2的步骤三中培养5天的外植体。
图11为实施例2的步骤四中的照片。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。B5盐(GAMBORGBASALSALTMIXTURE)：购自Phytotech公司，货号G768。MS盐(MURASHIGE&SKOOGBASALSALTMIXTURE)：购自Phytotech公司，货号M524。B5有机(GAMBORGVITAMINSOLUTION，1000x)：购自Phytotech公司，货号G219。
发芽培养基的制备方法：将3.1gB5盐、30g蔗糖、1mlB5有机和7.5g琼脂溶于1L水。
液体培养基的制备方法：将0.43gMS盐、40mg乙酰丁香酮、150mg二硫苏糖醇、100mgL-半胱氨酸、30g蔗糖、1mlB5有机和3.9g2-吗啉乙磺酸溶于1L水；pH5.4。
共培养培养基的制备方法：将0.43gMS盐、40mg乙酰丁香酮、150mg二硫苏糖醇、100mgL-半胱氨酸、30g蔗糖、7.5g琼脂、1mlB5有机和3.9g2-吗啉乙磺酸溶于1L水；pH5.4。
恢复培养基的制备方法：将3.1gB5盐、0.98g2-吗啉乙磺酸、30g蔗糖、7.5g琼脂、1mlB5有机、150mg头孢霉素、150mg特美汀和1mg6-BA溶于1L水；pH5.4。
筛选培养基的制备方法：将3.1gB5盐、0.98g2-吗啉乙磺酸、30g蔗糖、7.5g琼脂、1mlB5有机、150mg头孢霉素、150mg特美汀、1mg6-BA和8mg草丁膦溶于1L水；pH5.4。
伸长培养基的制备方法：将4.0gMS盐、0.6g2-吗啉乙磺酸、30g蔗糖、7.5g琼脂、1mlB5有机、150mg头孢霉素、150mg特美汀、0.1mgIAA、0.5mgGA、1mg6-BA和8mg草丁膦溶于1L水；pH5.6。
生根培养基的制备方法：将2.165gMS盐、0.6g2-吗啉乙磺酸、20g蔗糖、7.5g琼脂和1mlB5有机溶于1L水；pH5.7。
大豆品种Jack：在国家农作物种质保存中心(依托单位为中国农业科学院作物科学研究所)长期保存，可免费提供给国内从事大豆科研工作的研究人员使用。
pTF101.1载体(vectorpTF101.1)：公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得；记载过该材料的非专利文献：PazM,ShouH,GuoZ,ZhangZ,BanerjeeA,etal.AssessmentofconditionsaffectingAgrobacterium-mediatedsoybeantransformationusingthecotyledonarynodeexplant.Euphytica.2004,136:167–179。
根癌农杆菌EHA101：公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得；记载过该材料的非专利文献：Hood.EE,Helmer.GL,Fraley.RT,Chilton.MD.ThehypervirulenceofAgrobacteriumtumefaciensA281isencodedinaregionofpTiBo542outsideofT-DNA.J.Bacteriol.,1986,168(3):1291-1301.FrameBR,ShouH,ChikwambaRK,etal.Agrobacteriumtumefaciens-MediatedTransformationofMaizeEmbryosUsingaStandardBinaryVectorSystem.PlantPhysiol.2002,129(1):13–22.。
氯气灭菌的方法：将种子完全平铺在培养皿中，然后将培养皿放入干燥器中，在干燥器中放入一个100ml容量的烧杯(向烧杯中先倒入80ml浓度为12M的次氯酸钠水溶液，再缓慢加入4ml浓盐酸)，然后迅速盖上干燥器，用凡士林密封，放置14小时(实际应用中，12-16小时均可)。
实施例1、发芽5d的大豆种子的子叶作为外植体进行遗传转化
一、制备外植体
1、取饱满、均一、干燥、无病虫害和斑点的大豆品种Jack的种子，氯气灭菌。
2、将灭菌后的种子接种于发芽培养基上，培养5天，照片见图1。
培养条件：温度为24℃；每天光照16小时，黑暗8小时。
3、制备外植体
完成步骤2后，取种子，用镊子剥去种皮，切除部分下胚轴(保留3-5mm的下胚轴)，然后将子叶从中间一分为二(照片见图2)，在子叶和胚轴连接的部位平行划伤6次(实际应用中，5-7次均可)。
二、制备浸染菌液
1、将pTF101.1载体导入根癌农杆菌EHA101，得到重组农杆菌。
2、用液体培养基重悬步骤1得到的重组农杆菌，得到OD600nm＝0.6的浸染菌液。
三、侵染及共培养
1、将步骤一得到的外植体置于步骤二制备的侵染菌液中，室温浸泡30分钟。
2、完成步骤1后，取外植体，将子叶内面(平滑面)向下，平铺于已铺有无菌滤纸的共培养培养基上，培养5天，照片见图3。
培养条件：温度22℃；每天光照16小时，黑暗8小时。
四、恢复培养
完成步骤三后，取外植体，置于恢复培养基上(每个培养皿放7个外植体)，培养7天。培养前的照片见图4A，培养后的照片见图4B。
培养条件：温度25℃；每天光照16小时，黑暗8小时。
五、筛选培养
完成步骤四后，取外植体，置于筛选培养基上(每个培养皿放5个外植体)，培养21天，外植体上长出丛生芽。培养前的照片见图5A，培养后的照片见图5B。
培养条件：温度25℃；每天光照16小时，黑暗8小时。
六、伸长培养
完成步骤五后，取外植体，切除子叶部分，将丛生芽转接到伸长培养基上(每个三角瓶放3簇丛生芽)，培养至丛生芽伸长3-4cm(通常为培养15至20天)。培养前的照片见图6A，培养15天后的照片见图6B。
培养条件：温度25℃；每天光照16小时，黑暗8小时。
七、生根培养
完成步骤六后，取植株，剪取幼茎基部以上部分，先用1mg/ml吲哚丁酸水溶液浸泡幼茎基部1min，然后置于生根培养基上，培养至生根。
培养条件：温度25℃；每天光照16小时，黑暗8小时。
八、移栽及涂抹检测
完成步骤七后，将植株移栽入装有培养基质的塑料盆中(培养基质是将7体积份草炭土和3体积份蛭石混合得到的)，浇透水后用透明塑料袋遮盖保湿，一周后去掉塑料袋，正常管理。培养条件：温度28℃；每天光照16小时，黑暗8小时。
对移栽后的植株进行草丁膦抗性检测(当植株第二片三出复叶展开时，用160mg/L草丁膦水溶液对该三出复叶的一片叶子进行涂抹，即第一次涂抹；当植株第三片三出复叶展开时，用160mg/L草丁膦水溶液对该三出复叶的一片叶子进行涂抹，即第二次涂抹；当植株第四片三出复叶展开时，用160mg/L草丁膦水溶液对该三出复叶的一片叶子进行涂抹，即第三次涂抹)，三次涂抹均显示为阳性(即被涂抹的叶片没有发生叶片变黄的表征)的植株记为完成遗传转化的阳性植株。草丁膦抗性检测的结果照片见图7，阴性植株的结果照片见图7A，阳性植株的结果照片见图7B。
进行三个批次的试验，统计每批次的发芽种子数、种子污染数、外植体数、生根苗数以及阳性植株数，计算污染率(污染率＝种子污染数/发芽种子数×100％)和转化效率(转化效率＝阳性植株数/外植体数×100％。)。结果见表1。
表1采用发芽5d的种子做外植体的转化率
由表1可以看出，采用发芽5d的种子做外植体进行的3次重复转化试验，种子污染率在5-9％，转化效率大约在1-3％。
实施例2、发芽1d的大豆种子的子叶作为外植体进行遗传转化
一、制备外植体
1、同实施例1的步骤一的1。
2、将灭菌后的种子接种于发芽培养基上，培养1天，照片见图8。
培养条件：温度为24℃；每天光照16小时，黑暗8小时。
3、制备外植体
完成步骤2后，取种子，用镊子剥去种皮，然后从胚轴处将子叶从中间一分为二(照片见图9)，在子叶和胚轴连接的部位平行划伤6次(实际应用中，5-7次均可)。
二、制备浸染菌液
同实施例1的步骤二。
三、侵染及共培养
1、将步骤一得到的外植体置于步骤二制备的侵染菌液中，室温浸泡2小时。
2、完成步骤1后，取外植体，将子叶内面(平滑面)向上，平铺于已铺有无菌滤纸的共培养培养基上，培养5天，照片见图10。
培养条件：温度22℃；每天光照16小时，黑暗8小时。
四、恢复培养
同实施例1的步骤四。
培养前的照片见图11A，培养后的照片见图11B。
五、筛选培养
同实施例1的步骤五。
六、伸长培养
同实施例1的步骤六。
七、生根培养
同实施例1的步骤七。
八、移栽及涂抹检测
同实施例1的步骤八。
结果见表2。
表2采用发芽1d的种子做外植体的转化率
由表2可以看出，采用发芽1d的种子做外植体进行的3次重复转化试验，转化率大约在4-8％，并且种子污染数在3次重复试验中有2次是零污染，有1次的污染率为0.67％。
对实施例1和实施例2得到的转化数据进行分析，结果见表3和表4。
由表3可以看出，在3次重复转化试验中，采用发芽5d的种子做外植体的污染率平均值为7.29％，而采用发芽1d的种子做外植体的污染率平均值仅为0.22％，发芽时间的缩短显著降低了污染率。这是由于随着种子发芽时间的增长，种子中的内生菌会表现出来，进而增加了种子污染率。
由表4可以看出，采用发芽5d的种子做外植体的转化率平均值为2.47％，而采用发芽1d的种子做外植体的转化率平均值为5.95％，转化效率提高了1倍，显著提高了转化效率。
表3不同发芽时间的种子作为外植体的污染率比较
表4不同发芽时间的种子作为外植体的转化率比较
Claims (10)
1.一种制备大豆外植体的方法，包括如下步骤：取发芽1d的大豆种子，制备大豆外植体。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述制备大豆外植体的方法为：取种子，剥去种皮，从胚轴处将子叶从中间一分为二，在子叶和胚轴连接的部位平行划伤5-7次。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述发芽1d的大豆种子的制备方法为：将灭菌后的大豆种子接种于发芽培养基上，培养1天。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述培养的条件为：温度为24℃；每天光照16小时，黑暗8小时。
5.权利要求1至4中任一所述方法制备得到的大豆外植体。
6.权利要求5所述大豆外植体在大豆遗传转化中的应用。
7.一种大豆遗传转化方法，包括如下步骤：对权利要求5所述大豆外植体进行遗传转化。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述“对权利要求5所述大豆外植体进行遗传转化”的方法如下：
(1)将“权利要求5所述大豆外植体”置于侵染菌液中，室温浸泡2小时；所述侵染菌液为重组农杆菌菌悬液；所述重组农杆菌通过将含有目的基因的重组表达载体导入出发农杆菌得到；
(2)完成步骤(1)后，取外植体，采用子叶内面向上的方式在共培养培养基上培养5天；
(3)完成步骤(2)后，取外植体，在恢复培养基上培养7天；
(4)完成步骤(3)后，取外植体在筛选培养基上培养21天；
(5)完成步骤(4)后，取外植体，切除子叶部分，将丛生芽转接到伸长培养基上，培养至丛生芽伸长3-4cm；
(6)完成步骤(5)后，取植株，剪取茎基部以上部分，先用1mg/ml吲哚丁酸水溶液浸泡茎基部，然后在生根培养基上培养至生根。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：
所述步骤(2)中，所述培养的条件为：温度22℃；每天光照16小时，黑暗8小时；
所述步骤(3)中，所述培养的条件为：温度25℃；每天光照16小时，黑暗8小时；
所述步骤(4)中，所述培养的条件为：温度25℃；每天光照16小时，黑暗8小时；
所述步骤(5)中，所述培养的条件为：温度25℃；每天光照16小时，黑暗8小时；
所述步骤(6)中，所述培养的条件为：温度25℃；每天光照16小时，黑暗8小时。
10.如权利要求1至4中任一所述的方法，或，如权利要求6所述的应用，或，如权利要求7至9中任一所述的方法，其特征在于：所述大豆为大豆品种Jack。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20151111 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |