CN103205455B - 利用幼穗拯救获得转基因小麦的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用幼穗拯救获得转基因小麦的方法。该方法通过农杆菌介导将目的DNA转入小麦细胞，包括如下步骤：1)将含有目的DNA表达载体的重组农杆菌接种于胚芽鞘长为1.0mm-1.2mm的露白小麦种子的茎尖分生组织中，培养所述露白小麦种子获得处于雌雄蕊分化期的幼穗；2)取步骤1)得到的处于雌雄蕊分化期的幼穗进行离体脱分化得到愈伤组织，保留含有所述目的DNA的愈伤组织，得到所述转基因小麦。本发明将幼穗拯救法与萌发种子转化法相结合获得转基因小麦，转化效率可达12％。本发明的方法既克服了一般茎尖转化法形成嵌合体的问题，又解决了农杆菌直接侵染小麦幼胚、幼穗、成熟胚等所造成的组织褐化死亡问题，对小麦品种的遗传改良和种质创新具有十分重要的意义。

Description

利用幼穗拯救获得转基因小麦的方法

技术领域

本发明涉及一种利用幼穗拯救获得转基因小麦的方法。

背景技术

转基因技术是利用异源基因进行种质资源创新的良好途径，但转化效率低下是限制转基因技术在小麦上应用的世界性难题。迄今为止，已报道的小麦转基因方法主要有花粉管法、基因枪法和农杆菌介导法。其中，花粉管法是利用小麦花粉萌发形成的花粉管通道，将外源基因导入受体。该项技术不需要愈伤组织的培养过程，相比于基因枪法既简单又经济，但因其重复性差，很难获得分子证据，在小麦上的应用越来越少。基因枪法是以金粉或钨粉作为载体，通过高压轰击受体组织将外源基因导入到受体细胞中，并实现基因整合。但基因枪法除了需要消耗昂贵的大载体、可裂膜、阻挡网等一次性耗材外，插入到受体细胞中的基因往往是随机整合，并且是多拷贝插入。因为小麦是异源六倍体，基因组非常庞大，多拷贝插入除了影响基因的表达效率外，转基因后代纯合较慢，难以迅速获得纯合株系。另外，筛选标记难以去除也是限制基因枪转化小麦的主要因素之一。农杆菌法则克服了上述两种方法的缺点，其原理是先用目标基因替换根癌农杆菌上的致癌基因，在农杆菌侵染受体材料时，目标基因被释放整合进入受体细胞，这种插入往往以单拷贝或低拷贝的形式发生，而且作为质粒复制所需要的筛选标记被留在受体细胞外，提高了转基因的安全性。

农杆菌介导法的上述优点，赋予它具有极大的应用潜力。但是农杆菌的天然寄主是双子叶植物，对许多单子叶植物侵染困难。近年来，通过科学家的不断努力，水稻、玉米、小麦等重要的单子叶植物的转化相继成功。就水稻而言，以明恢63成熟胚愈伤组织为受体的农杆菌转化，其效率已经达到90％。而农杆菌转化小麦效率低下仍然是一世界性难题。目前，通过农杆菌介导进行转化的方法主要有两种：一是农杆菌侵染幼胚、成熟胚及其诱导形成的愈伤组织，通过后续的愈伤诱导、筛选和再生获得转基因小麦，但农杆菌侵染后的愈伤组织，往往因为农杆菌的毒性而褐变，无法继续生长，造成转化效率低下。二是茎尖分生组织侵染法，即利用农杆菌侵染创伤的茎尖分生组织，不经过愈伤组织的筛选过程，直接收获种子，然后对获得的后代进行筛选和鉴定。在这个转化过程中，因为茎尖是一个高度分化的器官，其中只有部分细胞被转化，因此，转化体为转化细胞与非转化细胞共存的嵌合体，而且转化细胞最终发育成为可遗传器官的几率微乎其微。因此，单纯的茎尖转化法在转化当代(T₀代)检测的阳性比率高达75％，但是在T₁代中的比率极少。

发明内容

本发明的目的是提供一种培育转基因小麦的方法，包括通过农杆菌介导将目的DNA转入小麦细胞的步骤，所述方法包括如下步骤：

1)将含有目的DNA表达载体的重组农杆菌接种于胚芽鞘长为1.0mm-1.2mm的露白小麦种子的茎尖分生组织中，培养所述露白小麦种子获得处于雌雄蕊分化期的幼穗；

2)取步骤1)得到的处于雌雄蕊分化期的幼穗进行离体脱分化得到愈伤组织，保留含有所述目的DNA的愈伤组织，得到所述转基因小麦。

在上述方法中，步骤1)中所述接种是在所述胚芽鞘长为1.0mm-1.2mm的露白小麦种子的茎尖分生组织中注入1μL所述含有目的DNA表达载体的重组农杆菌菌液。

在上述方法中，所述重组农杆菌菌液的OD₆₀₀为0.6。

在上述方法中，所述重组农杆菌菌液中含有乙酰丁香酮0.4mmol/L。

在上述方法中，所述农杆菌可为根癌农杆菌，具体可为根癌农杆菌EHA105。

在上述方法中，步骤2)中所述离体脱分化按照包括如下步骤的方法进行：将所述处于雌雄蕊分化期的幼穗接种于脱分化培养基中培养，获得愈伤组织。

在上述方法中，步骤2)中所述离体脱分化得到愈伤组织，保留含有所述目的DNA的愈伤组织后，还包括将所述含有所述目的DNA的愈伤组织接种于分化培养基中培养，获得具有根茎叶的小麦植株的步骤。

在上述方法中，所述脱分化培养基和所述分化培养基的基础培养基为MS培养基。

在上述方法中，所述脱分化培养基中含2.5mg/L 2，4-D和/或150mg/L特美汀和/或筛选转化体的抗生素，pH值为5.8；所述分化培养基中含2mg/L KT和/或筛选转化体的抗生素，pH值为5.8。

在上述方法中，所述分化培养基中培养的光照条件为：连续光照，所述连续光照的光照强度为1500LUX。

本发明将幼穗拯救法与萌发种子转化法相结合获得转基因小麦，转化效率达到12％。本发明的方法既克服了一般茎尖转化法形成嵌合体的问题，又解决了农杆菌直接侵染小麦幼胚、幼穗、成熟胚等所造成的组织褐化死亡问题，对小麦品种的遗传改良和种质创新具有十分重要的意义。

附图说明

图1为农杆菌侵染所用的小麦露白种子。

图2为共培养三天后种子的萌发生长情况。

图3为转化后Gus基因在T₀代转化植株中的嵌合表达。

图4为转化后Gus基因在T₀代转化植株根部的表达。

图5为幼穗拯救适宜的小麦幼穗大小。

图6为幼穗拯救过程中愈伤组织的切块培养。

图7为用于分化再生的胚性愈伤组织。

图8为T₀代转基因植株的PCR检测。其中，1为分子量标准DL2000，从上到下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；2-16为部分T₀代转基因植株；17为质粒pCAMBIA2301(阳性对照)；18为非转基因植株(阴性对照)。

图9为T₀代转基因植株中Gus基因在根部的表达情况。其中，左侧的2个为非转基因阴性对照，右侧的2个为T₀代转基因阳性植株。

图10为T₀代转基因植株中Gus基因在叶子中的表达情况。左侧的2个为T₀代转基因阳性植株，右侧的2个为非转基因阴性对照。

图11为T₀代转基因植株中Gus基因在籽粒中的表达情况。左侧的2个为T₀代转基因阳性植株，右侧的1个为非转基因阴性对照。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实验所用的质粒pCAMBIA2301(GenBank AF234316，其部分序列见序列表序列3)和根癌农杆菌EHA105(Agrobacterium tumefaciens)均购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心。质粒DNA和转基因小麦基因组DNA的提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，培养基配制所需的无机盐购自国药集团，维生素、抗生素、激素以及Gus染色所需的药品均购自Sigma-Aldrich中国公司。

用于进行基因转化的小麦品系为K35(隋新霞，黄承彦，楚秀生，李根英，樊庆琦.易花药培养的早熟小麦新种质K35.山东农业科学，2007年第一期，116-117页)，公众可从山东省农业科学院作物研究所和中国农业科学院作物科学研究所获得。

YEP液体培养基：胰化蛋白胨10g/L，酵母提取物10g/L，NaCl 5g/L，用水定容，pH值为7.0。

YEP固体培养基：在上述YEP液体培养基中添加琼脂7g/L。

MS培养基的溶质见表1，溶剂为超纯水，调节pH值为5.8，再按7％的质量百分比添加琼脂后制成固体培养基。

表1.MS培养基的溶质及其浓度

大量元素	培养基中浓度(g·L-1)
		NH4NO3	1.65
KNO3	1.9
		KH2PO4	0.17

MgSO4·7H2O	0.37
		CaCl2	0.44
微量元素	培养基中浓度(mg·L-1)
		FeSO4·7H2O	27.8
Na2EDTA	37.3
		MnSO4·4H2O	22.3
ZnSO4·4H2O	8.6
		H3BO3	6.2
KI	0.83
		Na2MoO4·2H2O	0.25
CuSO4·5H2O	0.025
		CoCl2·6H2O	0.025
有机成分	培养基中浓度(mg·L-1)
		甘氨酸	2.0
盐酸硫胺素	0.4
		盐酸吡哆素	0.5
烟酸	0.5
		肌醇	100
碳源	培养基中浓度(g·L-1)
		蔗糖	20

实施例1、农杆菌转化露白小麦种子的可行性验证

为了验证农杆菌是否能够通过侵染露白小麦种子，将外源基因导入到受体小麦品种中，首先对转化后的植株进行Gus基因表达分析，验证该侵染方法的可行性。

一、农杆菌菌液的制备

1、农杆菌感受态细胞的制备

挑取根癌农杆菌EHA105的单菌落于3mlYEP液体培养基(含利福平100mg/L)中，28℃振荡培养过夜。取过夜培养菌液500μl接种于50ml YEP液体培养基(含利福平100mg/L)中，28℃振荡培养至OD₆₀₀为0.6。5,000rpm，离心5min，弃上清后，加10ml0.15mmol/L NaCl悬浮农杆菌细胞。5,000rpm，离心5min，弃上清后，加1ml预冷的20mmol/L CaCl₂悬浮细胞，分装，获得农杆菌感受态细胞，于液氮中速冻，-70℃保存。

2、农杆菌转化及阳性克隆鉴定

取100μl步骤1的农杆菌感受态细胞，冰上缓慢融化。加入1μg质粒pCAMBIA2301(GenBank AF234316，其GUS基因序列见序列表序列3)混匀，冰浴30分钟；液氮中速冻1分钟，37℃水浴5分钟，28℃水浴2分钟。加入1ml YEP液体培养基，28℃慢速振荡培养3-4小时。4,000rpm离心5min，弃上清900μl；用剩余液体重悬菌体涂布于含有50μg/ml卡那霉素的YEP固体培养基上，28℃培养2-3天，挑取的抗性单菌落，接种于YEP液体培养基(含卡那霉素50mg/L和利福平100mg/L)中，28℃振荡培养过夜，收集菌体，从菌体中小量提取质粒DNA，以质粒DNA为模板，利用GUS基因的特异性引物对进行PCR扩增，上游引物序列为5’-GGTCACTCATTACGGCAAAGT-3’(序列表中的序列1，对应序列表中序列3的第279位至299位)；下游引物序列为5’-GACGACCAAAGCCAGTAAAGT-3’(序列表中的序列2，对应序列表中序列3的第895位至875位)，扩增产物长度为617bp，将扩增结果为阳性的重组农杆菌命名为EHA105/pCAMBIA2301。

3、重组农杆菌储备液的制备

取步骤2中PCR鉴定为阳性的重组农杆菌(命名为EHA105/pCAMBIA2301)的菌液在YEP固体培养基(含卡那霉素50mg/L和利福平100mg/L)上划线，28℃培养2天。挑取单克隆接种于装有20ml YEP液体培养基(含卡那霉素50mg/L和利福平100mg/L)的50ml离心管中28℃、230转/分钟、振荡培养2天。3000rpm离心10min，弃上清收菌。在离心管中加入2ml甘油浓度为30％的YEP液体培养液，轻轻吹打均匀。分装，50μl/管，-20℃保存备用。

4、侵染用重组农杆菌菌液的制备

取步骤3获得的重组农杆菌EHA105/pCAMBIA2301的储备液30μl于含50mg/L卡那霉素的YEP固体培养基上，用接种环均匀的划开涂匀，28℃培养1天；用平匙将YEP固体培养基上长出的菌体轻轻刮起，用乙酰丁香酮水溶液(取3ml灭菌水，加入0.1M的12μl乙酰丁香酮，混匀得到的水溶液)悬浮并调节菌液的OD₆₀₀至0.6，作为侵染用的重组农杆菌EHA105/pCAMBIA2301菌液。

二、种子的萌发与侵染

取小麦品系K35的成熟种子，先用清水冲洗种子两遍，再用70％的酒精冲洗1分钟，用1％的次氯酸钠灭菌15分钟后，用无菌水冲洗干净并在25℃浸泡4小时，然后将处理完的种子于25℃过夜萌发，选择胚芽鞘长1.0mm-1.2mm的露白种子(见图1)，在每个种子的胚芽鞘基部用微量注射器向茎尖分生组织中注入1μl按照步骤一中4的方法制备OD₆₀₀为0.6的重组农杆菌EHA105/pCAMBIA2301菌液，然后置于湿润的蛭石上，28℃光照周期16小时/8小时昼夜交替，培养3天。不经过抗生素冲洗，直接将经侵染的种子转入育苗草炭(KLASMAN)中，白天20℃(光照强度30000LUX)、夜晚16℃、光周期16小时/8小时的人工气候室中生长，获得T₀代转化植株。

处理结果表明，300粒种子，过夜萌发露白的为264粒，种子发芽率为88％，经过农杆菌侵染处理后三天(此时的幼苗见图2)，部分幼苗出现扭曲生长，其中小部分幼苗形成空心苗，无法正常抽穗。经侵染的264粒露白种子移栽后只有167株可以正常生长，正常生长苗数占处理种子数的63.3％，说明注射侵染对茎尖分生组织造成了较大的破坏。

三、Gus基因在转化植株中的表达检测

当步骤二得到的T₀代转化植株的花药发育至单核靠边期，随机取60株进行Gus基因表达分析，方法如下：

1)Gus组织染色液母液的配制：0.2M磷酸钠缓冲液；200mg X-gluc溶于400ul的DMSO中；0.1M的亚铁氰化钾；0.1M的铁氰化钾；0.5M的Na₂-EDTA；

2)Gus组织染色液使用液的配制：0.2M磷酸钠缓冲液100ml；0.1M的亚铁氰化钾和0.1M的铁氰化钾各1ml；0.5M的Na₂-EDTA 8ml；已溶于DMSO中的200mg X-gluc；水90ml，定容至200ml。

3)Gus组织染色：取各植株的幼根、茎、叶以及处于小孢子发育至单核靠边期的幼嫩穗部，将每株的茎、叶和穗混放到一个5ml的离心管中，每株幼根分别放到不同的1.5ml离心管中，用Gus组织染色液使用液完全浸没，37℃震荡过夜，再用70％的乙醇冲洗3次，观察Gus基因表达强度。

结果：在上述60个T₀代转化单株中，穗部或叶片具有Gus基因表达蓝色信号(见图3)的单株为49个，占参试单株的81.70％，其中穗部具有Gus基因表达蓝色信号的单株为29，占参试单株的48.3％，而根部具有Gus基因表达蓝色信号的单株为0(见图4)。结果表明，通过对露白种子进行微量农杆菌注射，可以将农杆菌中携带的目的基因整合到受体的基因组中并获得表达。但是，从图3可以看出，Gus基因无论是在穗部还是在叶片中的表达都不是连续的，转化后的单株为嵌合体。为了获得更纯合的转基因小麦，需要通过对T₀代小麦转化植株上的幼穗进行拯救，把转化细胞筛选出来，把非转化细胞去除，再通过植物细胞再生植株的方法获得转化细胞发育来的小麦植株。

实施例2、幼穗拯救与转基因小麦的获得

一、幼穗拯救与培养

按照实施例1中的方法获得T₀代转化植株，其中，用OD₆₀₀为0.6的侵染用重组农杆菌EHA105/pCAMBIA2301菌液侵染胚芽鞘长1.0mm-1.2mm的小麦品系K35露白种子，不含pCAMBIA2301的农杆菌EHA105菌液侵染小麦品系K35的露白种子为对照(CK)。实验设3次重复，记录对照及各重复侵染的种子数，记为A。

当T₀代转化植株的主茎幼穗发育至5-8mm时(见图5)(利用显微观察方法，确定主茎幼穗发育至5-8mm时，该主茎幼穗正处于雌雄蕊分化期)，用剪刀从植株基部将主茎剪下，按照如下方法培养获得由转化细胞发育来的再生T₀代转化植株：

1.幼穗分离与脱分化培养：切取主茎，去掉叶片和外层叶鞘，用70％的酒精冲洗1分钟，再用1％的次氯酸钠灭菌15分钟，在无菌条件下，将幼穗取出并用15号解剖刀将其切成1.5mm-2mm的小块(见图6)，放置于脱分化培养基上，切自同一幼穗的小块排在一起，计为一组(记录对照及各重复进行脱分化的幼穗数，记为B)，26℃暗培养10天。观察发现，切割后的幼穗小块，在放置到脱分化培养基上一周左右，即可形成肉眼可见的愈伤组织；

上述脱分化培养基为含2.5mg/L 2，4-D和150mg/L特美汀(抑制农杆菌生长用的抗生素)的MS培养基，pH值为5.8。

2.诱导筛选培养：将经步骤1的脱分化培养得到的愈伤组织转移到诱导筛选培养基上，26℃暗培养30天，期间每10天更换一次新鲜的培养基。方法如下：在诱导筛选培养基上26℃暗培养10天后，愈伤组织部分细胞变白死亡，而部分细胞仍然呈米黄色；将米黄色的愈伤组织在显微镜下分离出来，转移到新的诱导筛选培养基上，继续26℃暗培养10天，愈伤组织基本保持米黄色，仅有小部分细胞发白死亡；在显微镜下，再将死亡的细胞从愈伤组织上剥去，并将米黄色的愈伤组织转移到新的诱导筛选培养基上，26℃暗培养10天；

上述诱导筛选培养基为含2.5mg/L 2，4-D和30mg/L G418的MS培养基，pH值为5.8。

3.抗性愈伤组织的分化：将经过步骤2培养得到的胚性愈伤组织(见图7)转移到分化培养基上，24℃-25℃连续光照培养15天，光照强度1500LUX，获得具有根茎叶的再生T₀代转化植株；

上述分化培养基为含2mg/L KT和30mg/L G418的MS培养基，pH值为5.8。

4.壮苗培养与移栽：将步骤3得到的再生T₀代转化植株在壮苗培养基上进行26℃连续光照培养15天的壮苗培养，光照强度1500LUX，然后移栽至温室中生长(记录对照及各重复中获得再生植株的组数，记为C)，白天20℃、夜晚16℃、光周期16小时/8小时，直至成熟收获。壮苗培养基为MS培养基。所用的栽培基质为KLASMAN草炭，肥料为美国奥绿标准1号。

二、再生T₀代转化植株的PCR检测和Gus基因表达验证

1、PCR检测

分别剪取所有经过壮苗培养的再生T₀代转化植株和非转基因的小麦品系K35植株(阴性对照)的约3cm长的叶尖，提取基因组DNA。

利用GUS基因的特异性引物对进行PCR扩增，上游引物序列为5’-GGTCACTCATTACGGCAAAGT-3’(序列表中的序列1，对应序列表中序列3的第279位至299位)；下游引物序列为5’-GACGACCAAAGCCAGTAAAGT-3’(序列表中的序列2，对应序列表中序列3的第895位至875位)，扩增产物长度为617bp。

反应体系为20μl∶50ng基因组DNA，上下游引物各10pmol，dNTPs各250μM，10×buffer 2μl(50mM KCl，10mM Tris-HCl，1.5mM MgCl₂，pH 8.3)和2.0单位的rTaq(TaKaRa)，PCR扩增程序为94℃ 3分钟，94℃ 45秒，60℃ 45秒，72℃ 1分钟，36个循环，72℃ 10分钟。PCR产物在1.2％的琼脂糖胶中电泳分离，EB染色后进行紫外观察照相，结果见图8，记录对照及各重复中获得PCR阳性植株的组数，记为D。计算对照及各重复转化效率，记为E，转化效率E＝(获得PCR阳性植株的组数D/脱分化的幼穗数B)×100％。对照及各重复中的A、B、C、D、E的统计结果见表2。

表2.小麦幼穗拯救法统计结果

图8和表2的结果表明，经PCR检测，使用本发明的幼穗拯救法获得小麦转基因植株的转化效率达到12％，利用GUS染色观察Gus基因在PCR检测为阳性的植株中的表达情况，进一步确认该转化体系的可靠性。

2、Gus染色检测

从各重复中共随机取18株经PCR鉴定为阳性的再生T₀代转化植株，以非转基因的小麦品系K35植株为阴性对照，进行如下的Gus染色：取其籽粒、幼叶和幼根分别按照实施例1方法进行Gus染色检测。

结果：Gus基因在PCR鉴定为阳性的再生T₀代转化植株的籽粒、叶片和根部中均呈连续表达，而且其中生长旺盛的根尖等部位表达活性较强，对照均无蓝色的染色结果(图9-11)。

Claims (9)

1.培育转基因小麦的方法，包括通过农杆菌介导将目的DNA转入小麦细胞的步骤，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

1)将含有目的DNA表达载体的重组农杆菌接种于胚芽鞘长为1.0mm-1.2mm的露白小麦种子的茎尖分生组织中，培养所述露白小麦种子获得处于雌雄蕊分化期的幼穗；

2)取步骤1)得到的处于雌雄蕊分化期的幼穗进行离体脱分化培养得到愈伤组织，保留含有所述目的DNA的愈伤组织，得到所述转基因小麦。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)中所述接种是在所述胚芽鞘长为1.0mm-1.2mm的露白小麦种子的茎尖分生组织中注入1μL所述含有目的DNA表达载体的重组农杆菌菌液。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述重组农杆菌菌液的OD₆₀₀为0.6。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述重组农杆菌菌液中含有乙酰丁香酮0.4mmol/L。

5.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述农杆菌为根癌农杆菌。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2)中所述离体脱分化培养按照包括如下步骤的方法进行：将所述处于雌雄蕊分化期的幼穗接种于脱分化培养基中培养，获得愈伤组织。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2)中所述离体脱分化培养得到愈伤组织，保留含有所述目的DNA的愈伤组织后，还包括将所述含有所述目的DNA的愈伤组织接种于分化培养基中培养，获得具有根茎叶的小麦植株的步骤。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述脱分化培养基和所述分化培养基的基础培养基为MS培养基。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述分化培养基中培养的光照条件为：连续光照，所述连续光照的光照强度为1500LUX。