CN105647964A - 一种由系列培养基组成的试剂盒及其在大豆遗传转化中的应用 - Google Patents

一种由系列培养基组成的试剂盒及其在大豆遗传转化中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种由系列培养基组成的试剂盒及其在大豆遗传转化中的应用。本发明提供的试剂盒，包括恢复培养基、筛选培养基、伸长培养基和生根培养基；恢复培养基中含有45-55mg/LL-天冬酰胺、45-55mg/LL-谷氨酰胺、28-32mg/LEDTA盐和11-13mg/LFeSO4；筛选培养基中含有45-55mg/LL-天冬酰胺、45-55mg/LL-谷氨酰胺、28-32mg/LEDTA盐和11-13mg/LFeSO4；伸长培养基中含有45-55mg/LL-天冬酰胺、45-55mg/LL-谷氨酰胺、28-32mg/LEDTA盐和11-13mg/LFeSO4；生根培养基中含有45-55mg/LL-天冬酰胺和45-55mg/LL-谷氨酰胺。所述试剂盒在大豆遗传转化中的应用也属于本发明的保护范围。本发明提高了大豆遗传转化效率，具有重大的应用价值。

Description

一种由系列培养基组成的试剂盒及其在大豆遗传转化中的应用
技术领域
本发明涉及一种由系列培养基组成的试剂盒及其在大豆遗传转化中的应用。
背景技术
大豆(GlycinemaxL.Merr.)是重要的粮油兼用作物，也是目前转基因品种种植面积最大的作物。由于传统育种方法存在的局限性，使得转基因技术成为大豆新品种培育的重要手段。
目前使用较为广泛的大豆转化体系，以根癌农杆菌介导的子叶节转化体系和基因枪介导的幼胚转化体系为主。由于基因枪介导的幼胚转化受外植体取材的限制，实际应用中主要还是采用根癌农杆菌介导的子叶节转化方法。现有的根癌农杆菌转化体系存在转化效率低的问题，制约着大豆分子育种的发展。
发明内容
本发明的目的是提供一种由系列培养基组成的试剂盒及其在大豆遗传转化中的应用。
本发明提供了一种用于大豆遗传转化的试剂盒，包括恢复培养基、筛选培养基、伸长培养基和生根培养基；
所述恢复培养基中含有45-55mg/LL-天冬酰胺、45-55mg/LL-谷氨酰胺、28-32mg/LEDTA盐和11-13mg/LFeSO4；
所述筛选培养基中含有45-55mg/LL-天冬酰胺、45-55mg/LL-谷氨酰胺、28-32mg/LEDTA盐和11-13mg/LFeSO4；
所述伸长培养基中含有45-55mg/LL-天冬酰胺、45-55mg/LL-谷氨酰胺、28-32mg/LEDTA盐和11-13mg/LFeSO4；
所述生根培养基中含有45-55mg/LL-天冬酰胺和45-55mg/LL-谷氨酰胺。
所述恢复培养基中具体含有50mg/LL-天冬酰胺、50mg/LL-谷氨酰胺、29.84mg/LEDTA盐和12.16mg/LFeSO4。所述恢复培养基的组成可如下：2.5-3.5g/LB5盐、0.5-1.5ml/LB5有机、25-35g/L蔗糖、130-170mg/L头孢霉素、130-170mg/L特美汀、0.8-1.2mg/L6-BA、0.8-1.2g/L2-吗啉乙磺酸、5-10g/L琼脂、28-32mgmg/LEDTA盐、11-13mg/LFeSO4、45-55mg/LL-天冬酰胺、45-55mg/LL-谷氨酰胺，余量为水。所述恢复培养基的组成具体如下：3.1g/LB5盐、1ml/LB5有机、30g/L蔗糖、150mg/L头孢霉素、150mg/L特美汀、1mg/L6-BA、0.98g/L2-吗啉乙磺酸、7.5g/L琼脂、29.84mg/LEDTA盐、12.16mg/LFeSO4、50mg/LL-天冬酰胺、50mg/LL-谷氨酰胺，余量为水。所述EDTA盐具体可为Na2-EDTA。所述恢复培养基的组成具体如下：3.1g/LB5盐、1ml/LB5有机、30g/L蔗糖、150mg/L头孢霉素、150mg/L特美汀、1mg/L6-BA、0.98g/L2-吗啉乙磺酸、7.5g/L琼脂、4ml/LFe盐(200×)、50mg/LL-天冬酰胺、50mg/LL-谷氨酰胺，余量为水。所述恢复培养基的pH可为5-6，具体可为5.4。
所述筛选培养基中具体含有50mg/LL-天冬酰胺、50mg/LL-谷氨酰胺、29.84mg/LEDTA盐和12.16mg/LFeSO4。所述筛选培养基的组成可如下：2.5-3.5g/LB5盐、0.5-1.5ml/LB5有机、0.8-1.2g/L2-吗啉乙磺酸、25-35g/L蔗糖、130-170mg/L头孢霉素、130-170mg/L特美汀、0.8-1.2mg/L6-BA、6-10mg/L草丁膦、5-10g/L琼脂、28-32mg/LEDTA盐、11-13mg/LFeSO4、45-55mg/LL-天冬酰胺、45-55mg/LL-谷氨酰胺，余量为水。所述筛选培养基的组成具体如下：3.1g/LB5盐、1ml/LB5有机、0.98g/L2-吗啉乙磺酸、30g/L蔗糖、150mg/L头孢霉素、150mg/L特美汀、1mg/L6-BA、8mg/L草丁膦、7.5g/L琼脂、29.84mg/LEDTA盐、12.16mg/LFeSO4、50mg/LL-天冬酰胺、50mg/LL-谷氨酰胺，余量为水。所述EDTA盐具体可为Na2-EDTA。所述筛选培养基的组成具体如下：3.1g/LB5盐、1ml/LB5有机、0.98g/L2-吗啉乙磺酸、30g/L蔗糖、150mg/L头孢霉素、150mg/L特美汀、1mg/L6-BA、8mg/L草丁膦、7.5g/L琼脂、4ml/LFe盐(200×)、50mg/LL-天冬酰胺、50mg/LL-谷氨酰胺，余量为水。所述筛选培养基的pH可为5-6，具体可为5.4。
所述伸长培养基中具体含有50mg/LL-天冬酰胺、50mg/LL-谷氨酰胺、29.84mg/LEDTA盐和12.16mg/LFeSO4。所述伸长培养基的组成可如下：3-5g/LMS盐、0.8-1.2ml/LB5有机、0.5-0.7g/L2-吗啉乙磺酸、25-35g/L蔗糖、130-170mg/L头孢霉素、130-170mg/L特美汀、0.08-0.12mg/LIAA、0.4-0.6mg/LGA、0.8-1.2mg/L6-BA、7-9mg/L草丁膦、5-10g/L琼脂、28-32mg/LEDTA盐、11-13mg/LFeSO4、45-55mg/LL-天冬酰胺、45-55mg/LL-谷氨酰胺，余量为水。所述伸长培养基的组成具体如下：4.0g/LMS盐、1ml/LB5有机、0.6g/L2-吗啉乙磺酸、30g/L蔗糖、150mg/L头孢霉素、150mg/L特美汀、0.1mg/LIAA、0.5mg/LGA、1mg/L6-BA、8mg/L草丁膦、7.5g/L琼脂、29.84mg/LEDTA盐、12.16mg/LFeSO4、50mg/LL-天冬酰胺、50mg/LL-谷氨酰胺，余量为水。所述EDTA盐具体可为Na2-EDTA。所述伸长培养基的组成具体如下：4.0g/LMS盐、1ml/LB5有机、0.6g/L2-吗啉乙磺酸、30g/L蔗糖、150mg/L头孢霉素、150mg/L特美汀、0.1mg/LIAA、0.5mg/LGA、1mg/L6-BA、8mg/L草丁膦、7.5g/L琼脂、4ml/LFe盐(200×)、50mg/LL-天冬酰胺、50mg/LL-谷氨酰胺，余量为水。所述伸长培养基的pH可为5-6，具体可为5.6。
所述生根培养基中具体含有50mg/LL-天冬酰胺、50mg/LL-谷氨酰胺、29.84mg/LEDTA盐和12.16mg/LFeSO4。所述生根培养基的组成可如下：2.5-3.5g/LMS盐、0.8-1.2ml/LB5有机、0.5-0.7g/L2-吗啉乙磺酸、15-25g/L蔗糖、5-10g/L琼脂、45-55mg/LL-天冬酰胺、45-55mg/LL-谷氨酰胺，余量为水。所述生根培养基的组成具体如下：2.165g/LMS盐、1ml/LB5有机、0.6g/L2-吗啉乙磺酸、20g/L蔗糖、7.5g/L琼脂、50mg/LL-天冬酰胺、50mg/LL-谷氨酰胺，余量为水。所述生根培养基的pH可为5-6，具体可为pH5.7。
以上任一所述Fe盐(200×)的制备方法具体如下：将7.46gNa2-EDTA和5.56gFeSO4·7H2O溶于水并用水定容到1000ml。
所述试剂盒还包括发芽培养基和/或液体培养基和/或共培养培养基。所述液体培养基为用于重悬农杆菌以制备侵染菌液的培养基
所述发芽培养基的组成可如下：2.5-3.5g/LB5盐、0.8-1.2ml/LB5有机、15-25g/L蔗糖、5-10g/L琼脂，余量为水。所述发芽培养基的组成具体如下：3.12g/LB5盐、1ml/LB5有机、20g/L蔗糖、7.5g/L琼脂，余量为水。所述发芽培养基的pH可为5-6，具体可为5.8。
所述液体培养基的组成可如下：0.3-0.6g/LMS盐、0.8-1.2ml/LB5有机、30-50mg/L乙酰丁香酮、130-170mg/L二硫苏糖醇、80-120mg/LL-半胱氨酸、25-35g/L蔗糖、3-5mg/L2-吗啉乙磺酸，余量为水。所述液体培养基的组成具体如下：0.43g/LMS盐、1ml/LB5有机、40mg/L乙酰丁香酮、150mg/L二硫苏糖醇、100mg/LL-半胱氨酸、30g/L蔗糖、3.9mg/L2-吗啉乙磺酸，余量为水。所述液体培养基的pH可为5-6，具体可为5.4。
所述共培养培养基的组成可如下：0.3-0.6g/LMS盐、0.8-1.2ml/LB5有机、30-50mg/L乙酰丁香酮、130-170mg/L二硫苏糖醇、80-120mg/LL-半胱氨酸、25-35g/L蔗糖、5-10g/L琼脂、3-5mg/L2-吗啉乙磺酸，余量为水。所述共培养培养基的组成具体如下：0.43g/LMS盐、1ml/LB5有机、40mg/L乙酰丁香酮、150mg/L二硫苏糖醇、100mg/LL-半胱氨酸、30g/L蔗糖、7.5g/L琼脂、3.9mg/L2-吗啉乙磺酸，余量为水。所述共培养培养基的pH可为5-6，具体可为5.4。
所述试剂盒在大豆遗传转化中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明还保护一种大豆遗传转化的方法，包括如下步骤：
(1)将大豆外植体置于侵染菌液中室温浸泡；所述侵染菌液为重组农杆菌菌悬液；所述重组农杆菌通过将含有目的基因的重组表达载体导入出发农杆菌得到；
(2)完成步骤(1)后，取外植体，在所述共培养培养基上进行培养；
(3)完成步骤(2)后，取外植体，在所述恢复培养基上进行培养；
(4)完成步骤(3)后，取外植体，在所述筛选培养基上进行培养；
(5)完成步骤(4)后，取外植体，切除子叶部分，将丛生芽转接到所述伸长培养基上，培养至丛生芽伸长3-4cm；
(6)完成步骤(5)后，取植株，剪取茎基部以上部分，先用吲哚丁酸溶液浸泡茎基部，然后在所述生根培养基上培养至生根。
所述大豆外植体具体可为大豆子叶节外植体。所述大豆外植体的制备方法具体如下：取灭菌后的种子，在所述发芽培养基上培养24-28小时，然后取萌发的种子，剥去种皮，从胚轴处将两片子叶分开，在子叶和胚轴连接部位平行划伤5-7次。所述培养的温度可为25℃。
所述步骤(1)中，所述出发农杆菌为根癌农杆菌EHA101。所述步骤(1)中，所述重组表达载体是将目的基因插入植物表达载体得到的。所述植物表达载体具体可为pTF101.1载体。所述步骤(1)中，所述室温浸泡的时间为1-3小时，具体可为2小时。所述步骤(1)中所述侵染菌液OD600nm＝0.5-0.7。所述步骤(1)中所述侵染菌液OD600nm＝0.6。所述侵染菌液具体是用所述液体培养基重悬所述重组杆菌得到的。
所述步骤(2)中，所述培养的条件为：温度为20-25℃，时间为4-6天。所述步骤(2)中，所述培养的条件为：温度为22℃，时间为5天。所述步骤(2)中，所述外植体采用子叶内面向上的方式在共培养培养基上进行培养。
所述步骤(3)中，所述培养的条件为：温度为23-27℃，时间为6-8天。所述步骤(3)中，所述培养的条件为：温度为25℃，时间为7天。
所述步骤(4)中，所述培养的条件为：温度为23-27℃，时间为18-25天。所述步骤(4)中，所述培养的条件为：温度为25℃，时间为21天。
所述步骤(5)中，所述培养的条件为：温度为23-27℃。所述步骤(5)中，所述培养的条件为：温度为25℃。
所述步骤(6)中，所述培养的条件为：温度为23-27℃。所述步骤(6)中，所述培养的条件为：温度为25℃。所述步骤(6)中，所述吲哚丁酸溶液可为0.8-1.2mg/ml吲哚丁酸溶液。所述步骤(6)中，所述吲哚丁酸溶液具体可为1mg/ml吲哚丁酸水溶液。
以上任一所述培养均可为光暗交替培养。所述光暗交替培养具体可为：光照16小时/黑暗8小时。
以上任一所述试剂盒或以上任一所述的方法在大豆育种中的应用也属于本发明的保护范围。
所述大豆具体可为大豆品种Jack。
以上任一所述B5盐可为GAMBORGBASALSALTMIXTURE，具体可为Phytotech公司货号G768的产品。以上任一所述B5盐具体可由如下质量配比的各个组分组成：硫酸铵134：硼酸3：氯化钙113.24：CoCl2·6H2O0.025：CuSO4·5H2O0.025：Na2-EDTA·2H2O37.26：FeSO4·7H2O27.8：硫酸镁122.09：MnSO4·H2O10：Na2MoO4·2H2O0.25：KI0.75：KNO32500：磷酸二氢钠150：ZnSO4·7H2O2。
以上任一所述B5有机可为GAMBORGVITAMINSOLUTION(1000x)，具体可为Phytotech公司货号G219的产品。以上任一所述B5有机的组成具体如下：肌醇100000mg/L、烟酸1000mg/L、盐酸吡哆醇1000mg/L、盐酸硫胺10000mg/L，余量为水。
以上任一所述MS盐可为MURASHIGE&SKOOGBASALSALTMIXTURE，具体可为Phytotech公司，货号M524的产品。以上任一所述MS盐具体可由如下质量配比的各个组分组成：NH4NO31650：H3BO36.2：CaCl2332.2：CoCl2·6H2O0.025：CuSO4·5H2O0.025：Na2-EDTA·2H2O37.26：FeSO4·7H2O27.8：MgSO4180.7：MnSO4·H2O16.9：Na2MoO4·2H2O0.25：KI0.83：KNO31900：KH2PO4170：ZnSO4·7H2O8.6。
本发明通过改良培养基，提高了大豆遗传转化效率，具有重大的应用价值。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。6-BA即6-苄氨基腺嘌呤。IAA即吲哚-3-乙酸。IBA即3-吲哚丁酸。
B5盐(GAMBORGBASALSALTMIXTURE)：Phytotech公司，货号G768。B5盐由如下质量配比的各个组分组成：硫酸铵134：硼酸3：氯化钙113.24：CoCl2·6H2O0.025：CuSO4·5H2O0.025：Na2-EDTA·2H2O37.26：FeSO4·7H2O27.8：硫酸镁122.09：MnSO4·H2O10：Na2MoO4·2H2O0.25：KI0.75：KNO32500：磷酸二氢钠150：ZnSO4·7H2O2。
B5有机GAMBORGVITAMINSOLUTION(1000x)：Phytotech公司，货号G219。B5有机的组成如下：肌醇100000mg/L、烟酸1000mg/L、盐酸吡哆醇1000mg/L、盐酸硫胺10000mg/L，余量为水。
MS盐(MURASHIGE&SKOOGBASALSALTMIXTURE)：Phytotech公司，货号M524。MS盐由如下质量配比的各个组分组成：NH4NO31650：H3BO36.2：CaCl2332.2：CoCl2·6H2O0.025：CuSO4·5H2O0.025：Na2-EDTA·2H2O37.26：FeSO4·7H2O27.8：MgSO4180.7：MnSO4·H2O16.9：Na2MoO4·2H2O0.25：KI0.83：KNO31900：KH2PO4170：ZnSO4·7H2O8.6。
头孢霉素：生产商BioDee，货号DE0022。特美汀：生产商CAISSON,货号T034。草丁膦：生产商Sigma，货号45520。GA(即赤霉素)：生产商Sigma，货号G7645。
Fe盐(200×)：将7.46gNa2-EDTA和5.56gFeSO4·7H2O溶于水并用水定容到1000ml。
大豆品种Jack：国家农作物种质保存中心(依托单位为中国农业科学院作物科学研究所)。
pTF101.1载体：公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，记载过该材料的非专利文献是：PazM,ShouH,GuoZ,ZhangZ,BanerjeeA,etal.AssessmentofconditionsaffectingAgrobacterium-mediatedsoybeantransformationusingthecotyledonarynodeexplant.Euphytica.2004,136:167–179。
根癌农杆菌EHA101：公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，记载过该材料的非专利文献是：Hood,E.E.,Helmer,G.L.,Fraley,R.T.,Chilton,M.D.ThehypervirulenceofAgrobacteriumtumefaciensA281isencodedinaregionofpTiBo542outsideofT-DNA.J.Bacteriol.,1986,168(3):1291-1301.FrameBR,ShouH,ChikwambaRK,etal.Agrobacteriumtumefaciens-MediatedTransformationofMaizeEmbryosUsingaStandardBinaryVectorSystem.PlantPhysiol.2002,129(1):13–22.。
实施例1、试剂盒的制备
一、本发明提供的试剂盒的制备
本发明提供的试剂盒由如下培养基组成(每种培养基独立包装)：
发芽培养基(pH5.8)：3.12g/LB5盐、1ml/LB5有机、20g/L蔗糖、7.5g/L琼脂，余量为水。
液体培养基(pH5.4)：0.43g/LMS盐、1ml/LB5有机、40mg/L乙酰丁香酮、150mg/L二硫苏糖醇、100mg/LL-半胱氨酸、30g/L蔗糖、3.9mg/L2-吗啉乙磺酸，余量为水。
共培养培养基(pH5.4)：0.43g/LMS盐、1ml/LB5有机、40mg/L乙酰丁香酮、150mg/L二硫苏糖醇、100mg/LL-半胱氨酸、30g/L蔗糖、7.5g/L琼脂、3.9mg/L2-吗啉乙磺酸，余量为水。
恢复培养基Ⅰ(pH5.4)：3.1g/LB5盐、1ml/LB5有机、30g/L蔗糖、150mg/L头孢霉素、150mg/L特美汀、1mg/L6-BA、0.98g/L2-吗啉乙磺酸、7.5g/L琼脂、4ml/LFe盐(200×)、50mg/LL-天冬酰胺、50mg/LL-谷氨酰胺，余量为水。
筛选培养基Ⅰ(pH5.4)：3.1g/LB5盐、1ml/LB5有机、0.98g/L2-吗啉乙磺酸、30g/L蔗糖、150mg/L头孢霉素、150mg/L特美汀、1mg/L6-BA、8mg/L草丁膦、7.5g/L琼脂、4ml/LFe盐(200×)、50mg/LL-天冬酰胺、50mg/LL-谷氨酰胺，余量为水。
伸长培养基Ⅰ(pH5.6)：4.0g/LMS盐、1ml/LB5有机、0.6g/L2-吗啉乙磺酸、30g/L蔗糖、150mg/L头孢霉素、150mg/L特美汀、0.1mg/LIAA、0.5mg/LGA、1mg/L6-BA、8mg/L草丁膦、7.5g/L琼脂、4ml/LFe盐(200×)、50mg/LL-天冬酰胺、50mg/LL-谷氨酰胺，余量为水。
生根培养基Ⅰ(pH5.7)：2.165g/LMS盐、1ml/LB5有机、0.6g/L2-吗啉乙磺酸、20g/L蔗糖、7.5g/L琼脂、50mg/LL-天冬酰胺、50mg/LL-谷氨酰胺，余量为水。
二、对照试剂盒的制备
对照试剂盒由一系列现有培养基组成(每种培养基独立包装)，具体如下：
发芽培养基：同步骤一中的发芽培养基。
液体培养基：同步骤一中的液体培养基。
共培养培养基：同步骤一中的共培养培养基。
恢复培养基Ⅱ(pH5.4)：3.1g/LB5盐、1ml/LB5有机、30g/L蔗糖、150mg/L头孢霉素、150mg/L特美汀、1mg/L6-BA、0.98g/L2-吗啉乙磺酸、7.5g/L琼脂，余量为水。
筛选培养基Ⅱ(pH5.4)：3.1g/LB5盐、1ml/LB5有机、0.98g/L2-吗啉乙磺酸、30g/L蔗糖、150mg/L头孢霉素、150mg/L特美汀、1mg/L6-BA、、8mg/L草丁膦、7.5g/L琼脂，余量为水。
伸长培养基Ⅱ(pH5.6)：4.0g/LMS盐、1ml/LB5有机、0.6g/L2-吗啉乙磺酸、30g/L蔗糖、150mg/L头孢霉素、150mg/L特美汀、0.1mg/LIAA、0.5mg/LGA、1mg/L6-BA、8mg/L草丁膦、7.5g/L琼脂，余量为水。
生根培养基Ⅱ(pH5.7)：2.165g/LMS盐、1ml/LB5有机、0.6g/L2-吗啉乙磺酸、20g/L蔗糖、7.5g/L琼脂，余量为水。
实施例2、大豆遗传转化
一、种子灭菌
1、取无病虫害和斑点、饱满、均一、干燥的大豆品种Jack种子，完全平铺在培养皿中，然后将培养皿放入干燥器中。
2、完成步骤1后，在所述干燥器中放入100ml容量的烧杯，在烧杯中倒入80ml12M次氯酸钠水溶液，再慢慢加入4ml浓盐酸，然后迅速盖上干燥器，用凡士林密封，放置12-16h，进行氯气灭菌。
二、制备侵染菌液
1、用pTF101.1载体转化根癌农杆菌EHA101，得到重组农杆菌。
2、取步骤1得到的重组农杆菌，用实施例1制备的液体培养基重悬，得到OD600nm＝0.6的侵染菌液。
三、采用实施例1的步骤一制备的试剂盒进行大豆遗传转化
1、完成步骤一后，取种子，置于实施例1制备的发芽培养基上进行培养。
培养条件：温度为25℃，光暗交替(光照16小时/黑暗8小时)，时间为1天。
2、完成步骤1后，取萌发的种子，进行如下操作，得到外植体：用镊子剥去种皮，用刀片从胚轴处将两片子叶分开，在子叶和胚轴连接部位平行划伤5-7次。
3、取步骤2得到的外植体，在步骤二得到的侵染菌液中室温浸泡2小时，然后子叶内面(平滑面)向上平铺于已铺有无菌滤纸的实施例1制备的共培养培养基上进行培养。
培养条件：温度为22℃，光暗交替(光照16小时/黑暗8小时)，时间为5天。
4、完成步骤3后，将外植体转移到恢复培养基Ⅰ上进行培养(每个培养皿中放置7个外植体)。
培养条件：温度为25℃，光暗交替(光照16小时/黑暗8小时)，时间为7天。
5、完成步骤4后，将外植体转移到筛选培养基Ⅰ上进行培养(每个培养皿中放置5个外植体)。
培养条件：温度为25℃，光暗交替(光照16小时/黑暗8小时)，时间为21天。
6、完成步骤5后，取外植体，切除子叶部分，将丛生芽转移到伸长培养基Ⅰ中进行培养(每个三角瓶中放置3个丛生芽)直至丛生芽伸长3-4cm(通常为培养15至20天)。
培养条件：温度为25℃，光暗交替(光照16小时/黑暗8小时)。
7、完成步骤6后，取植株，剪取幼茎基部以上部分，先用1mg/mlIBA水溶液浸泡幼茎基部1min，然后转移到生根培养基Ⅰ上培养至生根。
培养条件：温度为25℃，光暗交替(光照16小时/黑暗8小时)。
8、完成步骤7后，将植株移栽入装有培养基质的塑料盆中(培养基质是将7体积份草炭土和3体积份蛭石混合得到的)，浇透水后用透明塑料袋遮盖保湿，一周后去掉塑料袋，正常管理。培养条件：温度28℃，光暗交替(光照16小时/黑暗8小时)。
对移栽后的植株进行草丁膦抗性检测(当植株第一片三出复叶展开时，用160mg/L草丁膦水溶液对该三出复叶的一片叶子进行涂抹，即第一次涂抹；当植株第二片三出复叶展开时，用160mg/L草丁膦水溶液对该三出复叶的一片叶子进行涂抹，即第二次涂抹；当植株第三片三出复叶展开时，用160mg/L草丁膦水溶液对该三出复叶的一片叶子进行涂抹，即第三次涂抹)，三次涂抹均显示为阳性(即被涂抹的叶片没有发生叶片变黄的表征)的植株记为完成遗传转化的阳性植株。
进行三个批次的试验，统计每批次的发芽种子数、种子污染数、外植体数、生根苗数以及阳性植株数，计算生根率(生根率＝生根苗数/外植体数×100％)和转化效率(转化效率＝阳性植株数/外植体数×100％)。结果见表1。
表1
四、采用实施例1的步骤二制备的试剂盒进行大豆遗传转化
用恢复培养基Ⅱ代替恢复培养基Ⅰ，用筛选培养基Ⅱ代替筛选培养基Ⅰ，用伸长培养基Ⅱ代替伸长培养基Ⅰ，用生根培养基Ⅱ代替生根培养基Ⅰ，其它同步骤三。
结果见表2。
表2
五、步骤三和步骤四的结果数据比较
对步骤三和步骤四的结果数据进行比较，生根率比较见表3，转化效率比较见表4。由表3可以看出，在3次重复转化试验中，采用对照试剂盒的生根率为25.86％，采用本发明提供的试剂盒的生根率为36.42％。由表4可以看出，采用对照试剂盒的转化效率平均值为6.94％，而采用本发明提供的试剂盒的的转化效率平均值为11.3％，差异性显著。结果表明，与现有技术相比，采用本发明提供的试剂盒可以显著提高根癌农杆菌介导的大豆遗传转化效率。
表3
表4

Claims (10)

1.一种用于大豆遗传转化的试剂盒，包括恢复培养基、筛选培养基、伸长培养基和生根培养基；
所述恢复培养基中含有45-55mg/LL-天冬酰胺、45-55mg/LL-谷氨酰胺、28-32mg/LEDTA盐和11-13mg/LFeSO4；
所述筛选培养基中含有45-55mg/LL-天冬酰胺、45-55mg/LL-谷氨酰胺、28-32mg/LEDTA盐和11-13mg/LFeSO4；
所述伸长培养基中含有45-55mg/LL-天冬酰胺、45-55mg/LL-谷氨酰胺、28-32mg/LEDTA盐和11-13mg/LFeSO4；
所述生根培养基中含有45-55mg/LL-天冬酰胺和45-55mg/LL-谷氨酰胺。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括发芽培养基和/或液体培养基和/或共培养培养基；所述液体培养基为用于重悬农杆菌以制备侵染菌液的培养基。
3.权利要求1或2所述试剂盒在大豆遗传转化中的应用。
4.一种大豆遗传转化的方法，包括如下步骤：
(1)将大豆外植体置于侵染菌液中室温浸泡；所述侵染菌液为重组农杆菌菌悬液；所述重组农杆菌通过将含有目的基因的重组表达载体导入出发农杆菌得到；
(2)完成步骤(1)后，取外植体，在共培养培养基上进行培养；
(3)完成步骤(2)后，取外植体，在权利要求1中所述的恢复培养基上进行培养；
(4)完成步骤(3)后，取外植体，在权利要求1中所述的筛选培养基上进行培养；
(5)完成步骤(4)后，取外植体，切除子叶部分，将丛生芽转接到权利要求1中所述的伸长培养基上，培养至丛生芽伸长3-4cm；
(6)完成步骤(5)后，取植株，剪取茎基部以上部分，先用吲哚丁酸溶液浸泡茎基部，然后在权利要求1中所述的生根培养基上培养至生根。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述大豆外植体为大豆子叶节外植体。
6.如权利要求4或5所述的方法，其特征在于：
所述步骤(1)中，所述出发农杆菌为根癌农杆菌EHA101。
7.如权利要求4至6中任一所述的方法，其特征在于：
所述步骤(1)中，所述重组表达载体是将目的基因插入植物表达载体得到的。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：
所述植物表达载体为pTF101.1载体。
9.如权利要求4至8中任一所述的方法，其特征在于：
所述步骤(2)中，所述培养的条件为：温度为22℃，时间为5天；
所述步骤(3)中，所述培养的条件为：温度为25℃，时间为7天；
所述步骤(4)中，所述培养的条件为：温度为25℃，时间为21天；
所述步骤(5)中，所述培养的条件为：温度为25℃；
所述步骤(6)中，所述培养的条件为：温度为25℃。
10.权利要求1或2所述试剂盒，或，权利要求4至9中任一所述的方法，在大豆育种中的应用。
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