CN103031269B - 获得大豆转基因愈伤组织的方法及其培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了获得大豆转基因愈伤组织的方法及其培养基。本发明所提供的获得大豆转基因愈伤组织的方法，包括以下步骤：以大豆转基因发状根为外植体I，用诱导大豆愈伤组织的培养基诱导培养所述外植体I，即得到大豆转基因愈伤组织。利用本发明所提供的获得大豆转基因愈伤组织的方法，能快速、简单、高效的获得大豆转基因愈伤组织。在大豆生物技术相关领域尤其在根系相关基因和耐逆基因的功能验证中具有广泛的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及获得大豆转基因愈伤组织的方法及其培养基。
背景技术
大豆遗传转化方法有许多，其中以根癌农杆菌介导法和基因枪介导法为主。但是，不管是根癌农杆菌介导法还是基因枪介导法，其遗传转化效率依旧低下，且转化周期长。另一方面，随着大豆EST序列等相关数据的不断丰富以及基因组测序的完成，从大豆中克隆基因会变得更加容易，而对于基因功能验证的需求会更加迫切。低效、费时的大豆遗传转化技术难以满足大豆基因功能验证日益增长的需要。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种获得大豆转基因愈伤组织的方法。
本发明所提供的获得大豆转基因愈伤组织的方法，包括以下步骤：
以大豆转基因发状根为外植体I，用下述诱导大豆愈伤组织的培养基诱导培养所述外植体I，即得到大豆转基因愈伤组织。
所述方法还包括用下述成套培养基中的继代培养基培养大豆转基因愈伤组织的步骤。
所述大豆转基因发状根是通过包括如下步骤的方法制备得到：
(1)以大豆子叶节为外植体II，用含有外源目的DNA的发根农杆菌浸染所述外植体II，得到经过所述发根农杆菌浸染后的外植体II；
(2)将上述步骤(1)得到的经过所述发根农杆菌浸染后的外植体II用共培养基进行共培养，得到共培养后的外植体II；
(3)将上述步骤(2)得到的所述共培养后的外植体II用根诱导培养基进行培养，即得到大豆转基因发状根。
所述步骤(2)中所述共培养基由以下成分组成：
NH4NO3、KNO3、KH2PO4、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、KI、Na2MoO4·2H2O、H3BO3、CuSO4·5H2O、MnSO4·H2O、CoCl2·6H2O、ZnSO4·7H2O、Na2EDTA·2H2O、FeSO4·7H2O、烟酸、肌醇、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、甘氨酸、乙酰丁香酮、赤霉素、L-半胱氨酸、二硫苏糖醇、蔗糖、琼脂和水；
以上成分在所述共培养基中浓度分别为：
NH4NO30.825g/L、KNO30.95g/L、KH2PO40.085g/L、CaCl2·2H2O 0.22g/L、MgSO4·7H2O 0.185g/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、H3BO36.2mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、MnSO4·H2O 16.9mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、Na2EDTA·2H2O 27.8mg/L、FeSO4·7H2O 37.3mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇100mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、乙酰丁香酮40mg/L、赤霉素0.25mg/L、L-半胱氨酸400mg/L、二硫苏糖醇154mg/L、蔗糖30mg/L和琼脂7g/L；
所述共培养基的pH值为5.4；
所述步骤(3)中所述根诱导培养基由包括以下成分的物质组成：
NH4NO3、KNO3、KH2PO4、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、KI、Na2MoO4·2H2O、H3BO3、CuSO4·5H2O、MnSO4·H2O、CoCl2·6H2O、ZnSO4·7H2O、Na2EDTA·2H2O、FeSO4·7H2O、烟酸、肌醇、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、甘氨酸、特美汀、头孢噻肟、羧苄青霉素、蔗糖和水；
以上成分在所述根诱导培养基中浓度分别为：
NH4NO30.825g/L、KNO30.95g/L、KH2PO40.085g/L、CaCl2·2H2O 0.22g/L、MgSO4·7H2O 0.185g/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、H3BO36.2mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、MnSO4·H2O 16.9mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、Na2EDTA·2H2O 27.8mg/L、FeSO4·7H2O 37.3mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇100mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、特美汀50mg/L、头孢噻肟100mg/L、羧苄青霉素100mg/L和蔗糖30mg/L；
所述根诱导液体培养基的pH值为5.7。
本发明的另一个目的是提供诱导大豆愈伤组织的培养基。
本发明所提供的诱导大豆愈伤组织的培养基，由下述质量份的营养成分组成：
大量元素以NH4NO3计825份、微量元素以KI计0.83份、铁盐以FeSO4·7H2O计37.3份、有机成分以烟酸计0.5份、生长素、6-苄氨基嘌呤0.5份-1.0份和蔗糖30份；所述生长素为2，4-二氯苯氧乙酸1.0份-3.0份或萘乙酸1.0-3.0份；
所述大量元素由下述质量份的物质组成：
NH4NO3825份、KNO3950份、KH2PO485份、CaCl2·2H2O 220份和MgSO4·7H2O 185份；
所述微量元素由下述质量份的物质组成：
KI 0.83份、Na2MoO4·2H2O 0.25份、H3BO36.2份、CuSO4·5H2O 0.025份、MnSO4·H2O 16.9份、CoCl2·6H2O 0.025份和ZnSO4·7H2O 8.6份；
所述铁盐由下述质量份的物质组成：
Na2EDTA·2H2O 27.8份和FeSO4·7H2O 37.3份；
所述有机成分由下述质量份的物质组成：
烟酸0.5份、肌醇100份、盐酸硫胺素0.1份、盐酸吡哆醇0.5份和甘氨酸2.0份。
所述培养基由以下成分组成：
NH4NO3、KNO3、KH2PO4、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、KI、Na2MoO4·2H2O、H3BO3、CuSO4·5H2O、MnSO4·H2O、CoCl2·6H2O、ZnSO4·7H2O、Na2EDTA·2H2O、FeSO4·7H2O、烟酸、肌醇、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、甘氨酸、生长素、6-苄氨基嘌呤、蔗糖和水；所述生长素为2，4-二氯苯氧乙酸或萘乙酸；
以上成分在所述培养基中浓度分别为：
NH4NO30.825g/L、KNO30.95g/L、KH2PO40.085g/L、CaCl2·2H2O 0.22g/L、MgSO4·7H2O 0.185g/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、H3BO36.2mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、MnSO4·H2O 16.9mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、Na2EDTA·2H2O 27.8mg/L、FeSO4·7H2O 37.3mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇100mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、生长素、6-苄氨基嘌呤0.5mg/L-1.0mg/L和蔗糖30mg/L；所述生长素为2，4-二氯苯氧乙酸1.0mg/L-3.0mg/L或萘乙酸1.0mg/L-3.0mg/L。
本发明的又一个目的是提供诱导大豆愈伤组织的固体培养基。
本发明所提供的诱导大豆愈伤组织的固体培养基，是由凝固剂和上述诱导大豆愈伤组织的培养基配成的固体培养基。
所述凝固剂在所述固体培养基中的浓度为7g/L；
所述凝固剂为琼脂。
本发明的又一个目的是提供用于获得大豆愈伤组织的成套培养基。
本发明所提供的用于获得大豆愈伤组织的成套培养基，由诱导大豆愈伤组织的培养基和继代培养基独立包装组成；所述诱导大豆愈伤组织的培养基和所述继代培养基均独立包装；
所述继代培养基由以下成分组成：
NH4NO3、KNO3、KH2PO4、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、KI、Na2MoO4·2H2O、H3BO3、CuSO4·5H2O、MnSO4·H2O、CoCl2·6H2O、ZnSO4·7H2O、Na2EDTA·2H2O、FeSO4·7H2O、烟酸、肌醇、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、甘氨酸、2，4-二氯苯氧乙酸、6-苄氨基嘌呤、N-苯基-N′-1，2，3-噻二唑-5-脲、二硫苏糖醇、蔗糖和水；
以上成分在所述继代培养基中浓度分别为：
NH4NO30.825g/L、KNO30.95g/L、KH2PO40.085g/L、CaCl2·2H2O 0.22g/L、MgSO4·7H2O 0.185g/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、H3BO36.2mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、MnSO4·H2O16.9mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、Na2EDTA·2H2O 27.8mg/L、FeSO4·7H2O 37.3mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇100mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、2，4-二氯苯氧乙酸0.05mg/L、6-苄氨基嘌呤0.9mg/L、N-苯基-N′-1，2，3-噻二唑-5-脲0.2mg/L、二硫苏糖醇150mg/L和蔗糖30mg/L；
所述继代培养基的pH值为5.8。
利用本发明所提供的获得大豆转基因愈伤组织的方法，能快速、简单、高效的获得大豆转基因愈伤组织。在大豆生物技术相关领域尤其在根系生长发育相关基因、抗根部病害基因和耐逆基因的功能验证中具有广泛的应用价值。
附图说明
图1为将大豆种子用氯气熏蒸消毒。
图2为大豆种子在发芽培养基上的发芽情况。
图3为大豆子叶节外植体与发根农杆菌在共培养基上共培养。
图4为共培养后的外植体在根诱导培养基上诱导得到的大豆转基因发状根。
图5为转基因发状根的GUS检测结果，左侧为阴性对照；右侧为GUS阳性转基因发状根。
图6为将转基因发状根在诱导培养基上培养得到的转基因愈伤组织。
图7为转基因愈伤组织在继代培养基上的生长情况。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、获得大豆转基因愈伤组织
方法I
一、获得大豆转基因发状根
1、制备大豆子叶节外植体
将成熟的大豆种子用氯气熏蒸消毒16小时(图1)，然后将消毒后的种子接种于发芽培养基(B5培养基)上，置于24℃光照培养箱(16小时光照/8小时黑暗)中培养5天(图2)。将大豆幼苗从培养基中剪下，去除种皮，保留3-5mm的下胚轴，沿下胚轴竖直切开两片子叶，剥离胚芽，沿子叶处划伤8-10次，作为待转化的大豆子叶节外植体。
2、农杆菌工程菌液的制备及浸染
将含有GUS基因的质粒pGFPGUSPlus(公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，记载过该材料的非专利文献是：Claudia E.Vickers，Peer M.Schenk，Dongxue Li，et al.pGFPGUSPlus，a new binary vector for gene expression studies and optimisingtransformation systems in plants.Biotechnol Lett，2007，29：1793-1796)通过电转化法转入农杆菌K599(公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，记载过该材料的非专利文献是：Claudia E.Vickers，Peer M.S chenk，Dongxue Li，et al.pGFPGUSPlus，a newbinary vector for gene expression studies and optimising transformation systems in plants.Biotechnol Lett，2007，29：1793-1796)，得到含有GUS基因的农杆菌K599；将含有GUS基因的农杆菌K599单菌落接种于5ml含卡那霉素(100mg/L)的YEP液体培养基中，28℃、200rpm振荡过夜培养；取1ml菌液加入50ml含卡那霉素(100mg/l)的YEP液体培养基中；28℃、200rpm振荡培养，待菌液的浓度达到OD600＝0.5后，4℃、3500rpm离心10分钟收集菌体，并将菌体重悬于液体共培养基中至OD600＝0.3，将上步制备好的大豆子叶节外植体浸泡于菌液中浸染30分钟。
所述液体共培养基由以下成分组成：
NH4NO3、KNO3、KH2PO4、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、KI、Na2MoO4·2H2O、H3BO3、CuSO4·5H2O、MnSO4·H2O、CoCl2·6H2O、ZnSO4·7H2O、Na2EDTA·2H2O、FeSO4·7H2O、烟酸、肌醇、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、甘氨酸、乙酰丁香酮(AS)、赤霉素(GA3)、L-半胱氨酸(L-cysteine)、二硫苏糖醇(DTT)、蔗糖和水；
以上成分在所述液体共培养基中浓度分别为：
NH4NO30.825g/L、KNO30.95g/L、KH2PO40.085g/L、CaCl2·2H2O 0.22g/L、MgSO4·7H2O 0.185g/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、H3BO36.2mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、MnSO4·H2O 16.9mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、Na2EDTA·2H2O 27.8mg/L、FeSO4·7H2O 37.3mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇100mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、乙酰丁香酮(AS)40mg/L、赤霉素(GA3)0.25mg/L、L-半胱氨酸(L-cysteine)400mg/L、二硫苏糖醇(DTT)154mg/L和蔗糖30mg/L；
所述液体共培养基的pH值为5.4。
3、大豆子叶节外植体与农杆菌共培养
将上述步骤2经过农杆菌浸染后的大豆子叶节外植体用无菌滤纸吸干表面多余的菌液，然后切口向下平铺于表面盖有无菌滤纸的固体共培养基上，置于24℃光照培养箱(16小时光照/8小时黑暗)中培养5天(图3)，得到共培养后的大豆子叶节外植体。
所述固体共培养基由以下成分组成：
NH4NO3、KNO3、KH2PO4、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、KI、Na2MoO4·2H2O、H3BO3、CuSO4·5H2O、MnSO4·H2O、CoCl2·6H2O、ZnSO4·7H2O、Na2EDTA·2H2O、FeSO4·7H2O、烟酸、肌醇、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、甘氨酸、乙酰丁香酮(AS)、赤霉素(GA3)、L-半胱氨酸(L-cysteine)、二硫苏糖醇(DTT)、蔗糖、琼脂和水；
以上成分在所述共培养基中浓度分别为：
NH4NO30.825g/L、KNO30.95g/L、KH2PO40.085g/L、CaCl2·2H2O 0.22g/L、MgSO4·7H2O 0.185g/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、H3BO36.2mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、MnSO4·H2O 16.9mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、Na2EDTA·2H2O 27.8mg/L、FeSO4·7H2O 37.3mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇100mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、乙酰丁香酮(AS)40mg/L、赤霉素(GA3)0.25mg/L、L-半胱氨酸(L-cysteine)400mg/L、二硫苏糖醇(DTT)154mg/L、蔗糖30mg/L和琼脂7g/L；
所述共培养基的pH值为5.4。
4、转基因发状根的诱导
用根诱导液体培养基清洗上述步骤3得到的共培养后的大豆子叶节外植体3次，用无菌滤纸除去表面菌液，将子叶朝下插入根诱导固体培养基(含14mg/L潮霉素作为筛选剂)中，置于24℃光照培养箱(16小时光照/8小时黑暗)中培养2-3周，诱导产生发状根(图4)。
根诱导液体培养基由以下成分组成：
NH4NO3、KNO3、KH2PO4、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、KI、Na2MoO4·2H2O、H3BO3、CuSO4·5H2O、MnSO4·H2O、CoCl2·6H2O、ZnSO4·7H2O、Na2EDTA·2H2O、FeSO4·7H2O、烟酸、肌醇、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、甘氨酸、特美汀(Timentin)、头孢噻肟(Cefotaxime)、羧苄青霉素(Carbenicillin)、蔗糖和水；
以上成分在所述根诱导液体培养基中浓度分别为：
NH4NO30.825g/L、KNO30.95g/L、KH2PO40.085g/L、CaCl2·2H2O 0.22g/L、MgSO4·7H2O 0.185g/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、H3BO36.2mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、MnSO4·H2O 16.9mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、Na2EDTA·2H2O 27.8mg/L、FeSO4·7H2O 37.3mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇100mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、特美汀(Timentin)50mg/L、头孢噻肟(Cefotaxime)100mg/L、羧苄青霉素(Carbenicillin)100mg/L和蔗糖30mg/L；
所述根诱导液体培养基的pH值为5.7。
所述根诱导固体培养基是由所述根诱导液体培养基、琼脂和相应筛选剂配成的固体培养基；其中琼脂在根诱导固体培养基中的浓度为7g/L；相应的筛选剂为潮霉素，潮霉素在根诱导固体培养基中的浓度为14mg/L。
二、大豆转基因愈伤组织的诱导和继代培养
1、诱导大豆转基因愈伤组织
将经GUS组织化学染色检测验证证实的转基因发状根(图5)的根尖段作为外植体，放入愈伤组织诱导培养基中，置于24℃黑暗条件下培养3周(图6)，得到大豆转基因愈伤组织。
实验设3次重复，结果取平均值，每个重复设30个外植体。
愈伤组织诱导率＝(诱导的根数/产生愈伤组织的根数×100％)。
结果为愈伤组织诱导率为100％。
所述愈伤组织诱导培养基由以下成分组成：
NH4NO3、KNO3、KH2PO4、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、KI、Na2MoO4·2H2O、H3BO3、CuSO4·5H2O、MnSO4·H2O、CoCl2·6H2O、ZnSO4·7H2O、Na2EDTA·2H2O、FeSO4·7H2O、烟酸、肌醇、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、甘氨酸、2，4-二氯苯氧乙酸、6-苄氨基嘌呤、蔗糖和水；
以上成分在所述培养基中浓度分别为：
NH4NO30.825g/L、KNO30.95g/L、KH2PO40.085g/L、CaCl2·2H2O 0.22g/L、MgSO4·7H2O 0.185g/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、H3BO36.2mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、MnSO4·H2O 16.9mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、Na2EDTA·2H2O 27.8mg/L、FeSO4·7H2O 37.3mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇100mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、2，4-二氯苯氧乙酸1.0mg/L、6-苄氨基嘌呤0.5mg/L和蔗糖30mg/L；
所述愈伤组织诱导培养基的pH值为5.8。
二、继代培养大豆转基因愈伤组织
将得到的大豆转基因愈伤组织转入继代培养基中，置于24℃光照培养箱(16小时光照/8小时黑暗)中培养(图7)，每两周继代一次。
所述继代培养基由以下成分组成：
NH4NO3、KNO3、KH2PO4、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、KI、Na2MoO4·2H2O、H3BO3、CuSO4·5H2O、MnSO4·H2O、CoCl2·6H2O、ZnSO4·7H2O、Na2EDTA·2H2O、FeSO4·7H2O、烟酸、肌醇、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、甘氨酸、2，4-二氯苯氧乙酸、6-苄氨基嘌呤、N-苯基-N′-1，2，3-噻二唑-5-脲(TDZ)、二硫苏糖醇(DTT)、蔗糖和水；
以上成分在所述继代培养基中浓度分别为：
NH4NO30.825g/L、KNO30.95g/L、KH2PO40.085g/L、CaCl2·2H2O 0.22g/L、MgSO4·7H2O 0.185g/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、H3BO36.2mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、MnSO4·H2O 16.9mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、Na2EDTA·2H2O 27.8mg/L、FeSO4·7H2O 37.3mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇100mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、2，4-二氯苯氧乙酸0.05mg/L、6-苄氨基嘌呤0.9mg/L、N-苯基-N′-1，2，3-噻二唑-5-脲0.2mg/L、二硫苏糖醇150mg/L和蔗糖30mg/L；
所述继代培养基的pH值为5.8。
方法II
一、获得大豆转基因发状根
1、制备大豆子叶节外植体
制备大豆子叶节外植体的与方法I相同。
结果与方法I无显著差异。
2、农杆菌工程菌液的制备及浸染
农杆菌工程菌液的制备及浸染方法与方法I相同。
结果与方法I无显著差异。
3、大豆子叶节外植体与农杆菌共培养
共培养方法与方法I相同。
结果与方法I无显著差异。
4、转基因发状根的诱导
转基因发状根的诱导方法与方法I相同。
结果与方法I无显著差异。
二、大豆转基因愈伤组织的诱导和继代培养
1、诱导大豆转基因愈伤组织
将经GUS检测验证证实的转基因发状根的根尖段作为外植体，放入愈伤组织诱导培养基中，置于24℃黑暗条件下培养4周，得到大豆转基因愈伤组织。
实验设三次重复，结果取平均值，每个重复设30个外植体。
愈伤组织诱导率＝(诱导的根数/产生愈伤组织的根数×100％)。
结果为愈伤组织诱导率为100％。
所述愈伤组织诱导培养基由以下成分组成：
NH4NO3、KNO3、KH2PO4、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、KI、Na2MoO4·2H2O、H3BO3、CuSO4·5H2O、MnSO4·H2O、CoCl2·6H2O、ZnSO4·7H2O、Na2EDTA·2H2O、FeSO4·7H2O、烟酸、肌醇、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、甘氨酸、2，4-二氯苯氧乙酸、6-苄氨基嘌呤、蔗糖、琼脂和水；
以上成分在所述培养基中浓度分别为：
NH4NO30.825g/L、KNO30.95g/L、KH2PO40.085g/L、CaCl2·2H2O 0.22g/L、MgSO4·7H2O 0.185g/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、H3BO36.2mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、MnSO4·H2O 16.9mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、Na2EDTA·2H2O 27.8mg/L、FeSO4·7H2O 37.3mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇100mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、2，4-二氯苯氧乙酸3.0mg/L、6-苄氨基嘌呤0.5mg/L、蔗糖30mg/L和琼脂7g/L；
所述愈伤组织诱导培养基的pH值为6.5。
二、继代培养大豆转基因愈伤组织
继代培养的方法与方法I相同。
结果与方法I无显著差异。
方法III
一、获得大豆转基因发状根
1、制备大豆子叶节外植体
制备大豆子叶节外植体的与方法I相同。
结果与方法I无显著差异。
2、农杆菌工程菌液的制备及浸染
农杆菌工程菌液的制备及浸染方法与方法I相同。
结果与方法I无显著差异。
3、大豆子叶节外植体与农杆菌共培养
共培养方法与方法I相同。
结果与方法I无显著差异。
4、转基因发状根的诱导
转基因发状根的诱导方法与方法I相同。
结果与方法I无显著差异。
二、大豆转基因愈伤组织的诱导和继代
1、诱导大豆转基因愈伤组织
将经GUS检测验证证实的转基因发状根的根尖段作为外植体，放入愈伤组织诱导培养基中，置于24℃黑暗条件下培养3周，得到大豆转基因愈伤组织。
实验设3次重复，结果取平均值，每个重复设30个外植体。
愈伤组织诱导率＝(诱导的根数/产生愈伤组织的根数×100％)。
结果为愈伤组织诱导率为100％。
所述愈伤组织诱导培养基由以下成分组成：
NH4NO3、KNO3、KH2PO4、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、KI、Na2MoO4·2H2O、H3BO3、CuSO4·5H2O、MnSO4·H2O、CoCl2·6H2O、ZnSO4·7H2O、Na2EDTA·2H2O、FeSO4·7H2O、烟酸、肌醇、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、甘氨酸、萘乙酸、6-苄氨基嘌呤、蔗糖和水；
以上成分在所述培养基中浓度分别为：
NH4NO30.825g/L、KNO30.95g/L、KH2PO40.085g/L、CaCl2·2H2O 0.22g/L、MgSO4·7H2O 0.185g/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、H3BO36.2mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、MnSO4·H2O 16.9mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、Na2EDTA·2H2O 27.8mg/L、FeSO4·7H2O 37.3mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇100mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、萘乙酸1.0mg/L、6-苄氨基嘌呤1.0mg/L和蔗糖30mg/L。
所述愈伤组织诱导培养基的pH值为7.3。
二、继代培养大豆转基因愈伤组织
继代培养的方法与方法I相同。
结果与方法I无显著差异。
方法IV
一、获得大豆转基因发状根
1、制备大豆子叶节外植体
制备大豆子叶节外植体的与方法I相同。
结果与方法I无显著差异。
2、农杆菌工程菌液的制备及浸染
农杆菌工程菌液的制备及浸染方法与方法I相同。
结果与方法I无显著差异。
3、大豆子叶节外植体与农杆菌共培养
共培养方法与方法I相同。
结果与方法I无显著差异。
4、转基因发状根的诱导
转基因发状根的诱导方法与方法I相同。
结果与方法I无显著差异。
二、大豆转基因愈伤组织的诱导和继代
1、诱导大豆转基因愈伤组织
将经GUS检测验证证实的转基因发状根的根尖段作为外植体，放入愈伤组织诱导培养基中，置于24℃黑暗条件下培养4周，得到大豆转基因愈伤组织。
实验设三次重复，结果取平均值，每个重复设30个外植体。
愈伤组织诱导率＝(诱导的根数/产生愈伤组织的根数×100％)。
结果为愈伤组织诱导率为100％。
所述愈伤组织诱导培养基由以下成分组成：
NH4NO3、KNO3、KH2PO4、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、KI、Na2MoO4·2H2O、H3BO3、CuSO4·5H2O、MnSO4·H2O、CoCl2·6H2O、ZnSO4·7H2O、Na2EDTA·2H2O、FeSO4·7H2O、烟酸、肌醇、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、甘氨酸、萘乙酸、6-苄氨基嘌呤、蔗糖和水；
以上成分在所述培养基中浓度分别为：
NH4NO30.825g/L、KNO30.95g/L、KH2PO40.085g/L、CaCl2·2H2O 0.22g/L、MgSO4·7H2O 0.185g/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、H3BO36.2mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、MnSO4·H2O 16.9mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、Na2EDTA·2H2O 27.8mg/L、FeSO4·7H2O 37.3mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇100mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、萘乙酸3.0mg/L、6-苄氨基嘌呤1.0mg/L和蔗糖30mg/L。
所述愈伤组织诱导培养基的pH值为7.3。
Claims (6)
1.一种获得大豆转基因愈伤组织的方法，包括以下步骤：
以大豆转基因发状根为外植体Ⅰ，用诱导大豆愈伤组织的培养基诱导培养所述外植体Ⅰ，即得到大豆转基因愈伤组织；
所述大豆转基因发状根是通过包括如下步骤的方法制备得到：
（1）以大豆子叶节为外植体Ⅱ，用含有外源目的DNA的发根农杆菌浸染所述外植体Ⅱ，得到经过发根农杆菌浸染后的外植体Ⅱ；
（2）将上述步骤（1）得到的经过发根农杆菌浸染后的外植体Ⅱ用共培养基进行共培养，得到共培养后的外植体Ⅱ；
（3）将上述步骤（2）得到的所述共培养后的外植体Ⅱ用根诱导培养基进行培养，即得到大豆转基因发状根；
所述诱导大豆愈伤组织的培养基由以下成分组成：
NH4NO30.825g/L、KNO30.95g/L、KH2PO40.085g/L、CaCl2·2H2O0.22g/L、MgSO4·7H2O0.185g/L、KI0.83mg/L、Na2MoO4·2H2O0.25mg/L、H3BO36.2mg/L、CuSO4·5H2O0.025mg/L、MnSO4·H2O16.9mg/L、CoCl2·6H2O0.025mg/L、ZnSO4·7H2O8.6mg/L、Na2EDTA·2H2O27.8mg/L、FeSO4·7H2O37.3mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇100mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、生长素、6-苄氨基嘌呤和蔗糖30mg/L；其中当6-苄氨基嘌呤为0.5mg/L时，生长素为2，4-二氯苯氧乙酸1.0mg/L；或其中当6-苄氨基嘌呤为0.5mg/L时，生长素为2，4-二氯苯氧乙酸3.0mg/L；或其中当6-苄氨基嘌呤为1.0mg/L时，生长素为萘乙酸1.0mg/L；或其中当6-苄氨基嘌呤为1.0mg/L时，生长素为萘乙酸3.0mg/L。
2.一种获得大豆转基因愈伤组织的方法，包括以下步骤：
以大豆转基因发状根为外植体Ⅰ，用诱导大豆愈伤组织的培养基诱导培养所述外植体Ⅰ，即得到大豆转基因愈伤组织；
所述大豆转基因发状根是通过包括如下步骤的方法制备得到：
（1）以大豆子叶节为外植体Ⅱ，用含有外源目的DNA的发根农杆菌浸染所述外植体Ⅱ，得到经过发根农杆菌浸染后的外植体Ⅱ；
（2）将上述步骤（1）得到的经过发根农杆菌浸染后的外植体Ⅱ用共培养基进行共培养，得到共培养后的外植体Ⅱ；
（3）将上述步骤（2）得到的所述共培养后的外植体Ⅱ用根诱导培养基进行培养，即得到大豆转基因发状根；
所述诱导大豆愈伤组织的培养基由以下成分组成：
NH4NO30.825g/L、KNO30.95g/L、KH2PO40.085g/L、CaCl2·2H2O0.22g/L、MgSO4·7H2O0.185g/L、KI0.83mg/L、Na2MoO4·2H2O0.25mg/L、H3BO36.2mg/L、CuSO4·5H2O0.025mg/L、MnSO4·H2O16.9mg/L、CoCl2·6H2O0.025mg/L、ZnSO4·7H2O8.6mg/L、Na2EDTA·2H2O27.8mg/L、FeSO4·7H2O37.3mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇100mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、生长素、6-苄氨基嘌呤、蔗糖30mg/L和琼脂7g/L；其中当6-苄氨基嘌呤为0.5mg/L时，生长素为2，4-二氯苯氧乙酸1.0mg/L；或其中当6-苄氨基嘌呤为0.5mg/L时，生长素为2，4-二氯苯氧乙酸3.0mg/L；或其中当6-苄氨基嘌呤为1.0mg/L时，生长素为萘乙酸1.0mg/L；或其中当6-苄氨基嘌呤为1.0mg/L时，生长素为萘乙酸3.0mg/L。
3.根据权利要求1所述的获得大豆转基因愈伤组织的方法，其特征在于：所述诱导大豆愈伤组织的培养基的pH值为5.8-7.3。
4.根据权利要求2所述的获得大豆转基因愈伤组织的方法，其特征在于：所述诱导大豆愈伤组织的培养基的pH值为6.5。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
所述方法还包括用继代培养基培养大豆转基因愈伤组织的步骤；
所述继代培养基由以下成分组成：
NH4NO30.825g/L、KNO30.95g/L、KH2PO40.085g/L、CaCl2·2H2O0.22g/L、MgSO4·7H2O0.185g/L、KI0.83mg/L、Na2MoO4·2H2O0.25mg/L、H3BO36.2mg/L、CuSO4·5H2O0.025mg/L、MnSO4·H2O16.9mg/L、CoCl2·6H2O0.025mg/L、ZnSO4·7H2O8.6mg/L、Na2EDTA·2H2O27.8mg/L、FeSO4·7H2O37.3mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇100mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、2，4-二氯苯氧乙酸0.05mg/L、6-苄氨基嘌呤0.9mg/L、N-苯基-N′-1,2,3-噻二唑-5-脲0.2mg/L、二硫苏糖醇150mg/L和蔗糖30mg/L；
所述继代培养基的pH值为5.8。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
所述步骤（2）中所述共培养基由以下成分组成：
NH4NO30.825g/L、KNO30.95g/L、KH2PO40.085g/L、CaCl2·2H2O0.22g/L、MgSO4·7H2O0.185g/L、KI0.83mg/L、Na2MoO4·2H2O0.25mg/L、H3BO36.2mg/L、CuSO4·5H2O0.025mg/L、MnSO4·H2O16.9mg/L、CoCl2·6H2O0.025mg/L、ZnSO4·7H2O8.6mg/L、Na2EDTA·2H2O27.8mg/L、FeSO4·7H2O37.3mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇100mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、乙酰丁香酮40mg/L、赤霉素0.25mg/L、L-半胱氨酸400mg/L、二硫苏糖醇154mg/L、蔗糖30mg/L和琼脂7g/L；
所述共培养基的pH值为5.4；
所述步骤（3）中所述根诱导培养基由以下成分组成：
NH4NO30.825g/L、KNO30.95g/L、KH2PO40.085g/L、CaCl2·2H2O0.22g/L、MgSO4·7H2O0.185g/L、KI0.83mg/L、Na2MoO4·2H2O0.25mg/L、H3BO36.2mg/L、CuSO4·5H2O0.025mg/L、MnSO4·H2O16.9mg/L、CoCl2·6H2O0.025mg/L、ZnSO4·7H2O8.6mg/L、Na2EDTA·2H2O27.8mg/L、FeSO4·7H2O37.3mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇100mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、特美汀50mg/L、头孢噻肟100mg/L、羧苄青霉素100mg/L和蔗糖30mg/L；
所述根诱导培养基的pH值为5.7。
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