CN107099547A - 转gshB基因提高龙葵毛状根Cd富集的方法 - Google Patents

转gshB基因提高龙葵毛状根Cd富集的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种转gshB基因提高龙葵毛状根Cd富集的方法，通过构建植物过表达载体将gshB基因转入发根农杆菌A4获得转gshB基因侵染菌液，然后转gshB基因侵染菌液与龙葵外植体共培养，诱导出含有gshB基因的龙葵毛状根，对获得的转gshB基因龙葵毛状根扩大培养，并进行分子鉴定和荧光检测。本发明进一步对获得的转gshB基因龙葵毛状根的Cd富集含量测定表明所能富集的Cd的含量最高可达野生龙葵植株的2倍。本发明不仅可以解决龙葵植株栽培周期长、受气候及地理条件制约等问题，并且可高效大量地富集重金属Cd，为利用龙葵毛状根富集重金属Cd提供材料支撑，具有广阔的开发和应用前景。

Description

转gshB基因提高龙葵毛状根Cd富集的方法
技术领域
本发明涉及植物生物技术领域。更具体地，涉及一种转gshB基因提高龙葵毛状根镉富集的方法。
背景技术
龙葵是茄属茄科一年生草本植物，几乎全中国都有分布，广泛分布于亚、欧、美洲的温带至热带地区。目前，世界范围内已经发现的重金属超富集植物有400多种，在已发现的超富集植物中，Cd超富集植物总体上很少，目前仅报道遏蓝菜(Thlaspi arvense L)、宝山堇菜(Viola baoshanensis)、油菜(Brassicacampestris L.)、东南景天(Sedumalfredii)、龙葵(Solanum nigrum L.)、商陆(Phytolacca acinosa Roxb)、红菾菜(Betavulgarisvar.cicla)等Cd超富集植物。在这些植物中，遏蓝菜是研究最多的，但遏蓝菜对Cd的富集不具备特异性。龙葵因其分布广泛、生命力强、对Cd的富集更专一等优势得到越来越多的关注。
随着工农业的迅速发展和城市人口的剧增，环境污染问题与日剧增，环境问题越来越受到人们的重视，污染环境的修复方法也成为全球关注的热点。在各种各样的环境污染治理技术中，生物修复以其处理费用低、操作简单、处理效果好、不易造成二次污染等特点而受到越来越多的关注。生物修复至今仅有30多年的研究历史，但是20世纪80年代以后，一些生物修复技术已经开始在污染环境治理中推广应用并取得了良好的效果。转基因植物由于具有更好的耐受力和积累量，可以得到更好的土壤修复效果。近年来，利用转基因植物修复污染土壤的生物修复技术已经成为研究的热点(张玉秀,柴团耀,G.rard Burkard.植物耐重金属机理研究进展[J].植物学报,1999,41(5):453-457.)。
通过转基因技术获得Cd超富集植物龙葵毛状根株系，不仅在研究龙葵富集重金属Cd代谢途径和分子调控机制方面具有重要的理论意义，并且在将来大规模种植龙葵富集土壤中重金属Cd方面具有重要的应用前景和价值。尽管目前已有利用毛状根为材料开展对重金属富集的相关研究，但并无将gshB基因转入发根农杆菌，诱导出能超富集Cd的转gshB基因龙葵毛状根的研究。
因此，需要提供一种通过转gshB基因提高龙葵毛状根的Cd富集能力的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种通过转gshB基因实现植物龙葵的毛状根Cd超富集的方法。
为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：
本发明一种转gshB基因提高龙葵毛状根Cd富集的方法，包括以下步骤：
(1)制备龙葵外植体；
(2)制备转gshB基因侵染菌液：将gshB基因与真核表达载体PBI121-gfp连接，将连接产物用热激法转化发根农杆菌A4感受态细胞；涂平板，挑取阳性克隆，用YMA液体培养基扩增培养，得到转gshB基因侵染菌液；
(3)共培养诱导转gshB基因龙葵毛状根：将转gshB基因侵染菌液与龙葵无菌叶片进行共培养；
(4)除菌培养：将共培养后的龙葵叶片转移到已湿润的滤纸上于28℃弱散射光培养2d，随后转入含有500mg/L的头孢噻肟钠的MS培养基上进行除菌培养，一周后转到不含头孢噻肟钠的MS固体培养基上，一个月后龙葵叶片愈伤处会长出的细长毛状根；
(5)毛状根液体培养基的扩大培养：将固体培养基中的毛状根转入MS液体培养基中扩大培养；
(6)转gshB基因龙葵毛状根的检测：所述检测包括分子鉴定和荧光检测；其中，所述分子鉴定是通过提取毛状根的DNA，PCR法检测农杆菌Ri质粒中的rolB基因和PBI121-gshB-gfp融合基因，判断是否成功获得转gshB基因毛状根；所述荧光检测是通过绿色荧光蛋白检测，验证是否成功获得转gshB基因毛状根。
进一步，步骤(1)所述龙葵外植体是取龙葵种子灭菌后接种于MS固体培养基，28℃光照培养，当龙葵无菌苗长出3到4对真叶后，剪取无菌叶片作为诱导毛状根的龙葵外植体；
进一步，步骤(2)中所述扩增培养是在28℃，150-200rpm摇床中扩增至OD600＝0.6。
进一步，步骤(5)中所述扩大培养为28℃，100-110rpm摇床进行培养。
进一步，步骤(6)中所述荧光检测的荧光显微镜的参数是波长487nm、曝光时间583ms。
谷胱甘肽在缓解植物的重金属损伤中起着重要的作用，谷胱甘肽不仅是谷胱甘肽转移酶的底物，而且是脱氢抗坏血酸的还原物质，能够中和环境中的有毒物质。除此之外，谷胱甘肽是植物络合素的前体，植物络合素能够与重金属离子形成复合物并贮藏至液泡中，起到对重金属离子进行隔离的作用从而降低重金属对植物的损伤。谷胱甘肽的合成由半胱氨酸和谷氨酸经过两步酶催化反应所得，第一步是在γ-谷胱酰胺半胱氨酸合成酶(γ-ECS)的催化下生成γ-谷胱酰胺半胱氨酸。第二步是γ-谷胱酰胺半胱氨酸在谷胱甘肽合成酶的催化下与甘氨酸反应生成谷胱甘肽。在没有重金属离子的胁迫下谷胱甘肽合成的限速步骤是谷氨酸和半胱氨酸在γ-谷胱酰胺半胱氨酸合成酶的催化下合成γ-谷胱酰胺半胱氨酸，然而在重金属离子胁迫的情况下谷胱甘肽合成的限速步骤是γ-谷胱酰胺半胱氨酸和甘氨酸在谷胱甘肽合成酶的催化下生成谷胱甘肽。本发明转入的gshB基因有助于提高谷胱甘肽的含量，因此能够提高龙葵对重金属的耐受和富集能力，对由上述方法得到的毛状根毛状根富集Cd能力进行测定，表明其所能富集的Cd的含量最高可达野生龙葵植株的2倍。
本发明的有益效果如下：
(1)本发明首次将谷胱甘肽合成酶gshB基因转入载体pBI121-gfp，将该载体转入农杆菌后再转入龙葵无菌苗，诱导出超富集Cd的转gshB基因龙葵毛状根系，该根系易于繁殖、生长速度快，所能富集的Cd的含量最高可达野生龙葵毛状根的2倍。
(2)本发明不仅可以解决龙葵植株栽培周期长、受气候及地理条件制约等问题，并且可高效大量地富集重金属Cd。超富集Cd的转gshB基因龙葵毛状根将为利用龙葵毛状根富集重金属Cd提供材料支撑，具有广阔的开发和应用前景。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1示出野生型A4侵染龙葵叶片21d生根结果。
图2示出转gshB基因A4侵染龙葵叶片21d生根结果。
图3示出野生型龙葵毛状根接种21d后的状态。
图4示出转gshB基因龙葵毛状根接种21d后的状态。
图5示出转gshB基因龙葵毛状根与野生型毛状根中rolB基因的PCR电泳图；M：DL2000；1：A4的Ri质粒；2：对照；3：野生型龙葵毛状根；4：转gshB基因龙葵毛状根。
图6示出转gshB基因和野生型龙葵毛状根gshB基因的PCR扩增：：DL2000；1：Pbi121-gshB-gfp质粒；2：转gshB基因龙葵毛状根；3：野生型龙葵毛状根。
图7示出野生型龙葵毛状根的荧光检测。
图8示出转gshB基因龙葵毛状根的荧光检测。
图9示出野生型龙葵毛状根在含Cd(100μM)的MS液体培养基中20d后的状态。
图10示出转gshB基因龙葵毛状根在含Cd(100μM)的MS液体培养基中20d后的状态。
图11示出转gshB基因龙葵毛状根与野生型龙葵毛状根Cd富集能力的比较；标注的小写字母不同代表统计学上有显著差异，小写字母相同代表无显著差异(P<0.05)。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
培养基的配置
MS培养基配制：
1、100×铁盐母液：称取FeSO4·7H2O 1.39g和Na2EDTA 1.865g溶入500mL的蒸馏水。
2、有机物质母液配制：
1000×甘氨酸母液：称取甘氨酸0.2g溶入100mL的蒸馏水。
1000×烟酸母液：称取烟酸0.05g溶入100mL蒸馏水。
1000×盐酸硫胺素(维生素B1)母液：称取盐酸硫胺素0.05g溶入100mL蒸馏水中。
1000×盐酸吡哆醇(维生素B6)母液：称取盐酸吡哆醇0.01g溶入100mL蒸馏水中。
100×肌醇母液：称取肌醇10.0g溶于1000mL蒸馏水中。
3、1000×微量元素母液配制：称取H3BO3 0.62g、MnSO4·1H2O 1.69g、ZnSO4·7H2O0.86g、KI 0.083g、Na2MoO4·2H2O 0.25g、CoCl2·6H2O 0.025g、CuSO4·5H2O 0.025g溶于1000mL蒸馏水中。
4、10×大量元素母液配制：称取NH4NO3 16.5g、KNO3 19.0g、MgSO4·7H2O3.7g、KH2PO4 1.7g溶于1000mL蒸馏水中。
5、100×CaCl2母液配制：称取CaCl2·2H2O 44.0g溶于1000mL的蒸馏水中。
每升MS液体培养基加入30.0g蔗糖和所需的母液，调pH至5.8后高压灭菌，MS固体培养基，则需再加入10.0g琼脂粉。
发根农杆菌A4的YMA培养基：
配制1L YMA培养基所需物品：K2HPO4 0.25g、KH2PO4 0.25g、NaCl 0.1g MgSO4·7H2O 0.2g、甘露醇10.0g、酵母提取物0.8g(若配固体培养基需再加入琼脂粉10.0g，PH7.2)。
实施例1转gshB基因龙葵毛状根的诱导
1、龙葵无菌苗培养：选取饱满的龙葵种子，在超净工作台内，将种子放入纱布中用皮筋包扎好，放入无菌烧杯中用无菌水冲洗3～5遍；75％乙醇浸泡5min，无菌水冲洗3遍；最后浸泡在含有2％有效成分的次氯酸钠溶液5min，无菌水冲洗3遍。接种于MS固体培养基上，每皿约30粒种子，28℃光照培养3周后，当龙葵无菌苗长出3到4对真叶后，剪取无菌叶片作为诱导毛状根的外植体。
2、过表达载体的构建及转gshB基因侵染菌液的制备：通过NCBI查询gshB基因的CDS编码序列(Sequence ID:gb|CP010445.1|)，将查询获得的序列于上海生工公司优化后并合成。根据此序列设计gshB-F：5＇-GCTCTAGAATGATCAAGCTCGGCATC-3＇(如序列表SED IDNO.1所示)；gshB-R：5＇-CCCCCGGGTTCTGCTGCTGTAAACGTGC-3＇(如序列表SED IDNO.2所示)，高保真酶扩增目的片段；将获得的目的片段切胶并回收，并与pBI121-gfp真核表达载体(pBI121中插入增强型绿色荧光蛋白基因gfp序列，代替pBI121中的标记基因gus，以方便后续转gshB基因毛状根的检测验证载体连接)构建pBI121-gshB-gfp质粒；将pBI121-gshB-gfp质粒用热激法转化发根农杆菌A4感受态细胞；挑取阳性克隆，转入含有卡那抗性的YMA液体培养基中，28℃、150rpm的摇床中扩增至OD600＝0.6时，可作为转基因侵染菌液。
3、共培养法诱导转gshB基因龙葵毛状根：将菌液和龙葵叶片(0.5cm×0.5cm)放置于100ml锥形瓶中共培养20min，同时以野生A4农杆菌感染的外植体作为对照。
实施例2转gshB基因龙葵毛状根的培养
(1)毛状根的除菌培养：将共培养的龙葵叶片转移到湿润的滤纸上于28℃弱散射光培养两天后，转入含有500mg/L的头孢噻肟钠的MS培养基中进行除菌培养，一周后转接到不含头孢噻肟钠的MS固体培养基中，一个月后龙葵叶片愈伤处会长出多条橘黄色的细长毛状根，图1所示是野生型A4农杆菌侵染龙葵叶片诱导生成的野生型龙葵毛状根，图2所示的是转gshB基因A4农杆菌侵染龙葵叶片诱导生成的转gshB基因龙葵毛状根。
(2)毛状根液体培养基的扩大培养：将固体培养基中的毛状根转入MS液体培养基中，28℃、100rpm、摇床中扩大培养，图3所示是野生型龙葵毛状根接种到液体MS培养基中培养21d后的状态，图4所示是转gshB基因龙葵毛状根接种到液体MS培养基中培养21d后的状态。
实施例3转gshB基因龙葵毛状根的分子鉴定
(1)取一定数量的毛状根提取其DNA，设计检测rolB(423bp)与pBI121-gshB-gfp(963bp)融合基因的引物分别为：
rolB-F：5'-TACTGCAGCAGGCTTCATGAC-3'(如序列表SED ID NO.3所示)，
rolB-R：5'-GCTTTCCCGACCAGAGACTG-3'(如序列表SED ID NO.4所示)；
gshB-F：5'-GCTCTAGAATGATCAAGCTCGGCATC-3'(如序列表SED IDNO.1所示)，
gshB-R：5'-CCCCCGGGTTCTGCTGCTGTAAACGTGC-3'(如序列表SEDID NO.2所示)；
用PCR方法扩增，扩增产物测序比对，检测毛状根中是否存在农杆菌Ri质粒中的rolB基因。图5电泳图结果显示野生型和转gshB基因毛状根均在423bp处有条带，说明所获的两种毛状根中均有rolB基因；并且图6电泳图结果显示只有转gshB基因毛状根在963bp处有条带，表明成功获得转gshB基因毛状根。
(2)转gshB基因龙葵毛状根的荧光检测：取野生型和转gshB基因毛状根进行荧光检测，图7显示野生型毛状根在荧光显微镜下不能观察到绿色荧光，而图8显示转gshB基因毛状根出现荧光，进一步表明成功获得转基因毛状根。实施例4龙葵转基因毛状根富集Cd能力的测定
(1)将在MS液体培养基中培养15d的转基因毛状根和野生型毛状根，转到含0、25、50、75、100μM CdCl2的MS培养基中进行Cd刺激，在28℃，150rpm的摇床中培养20d后检测毛状根中的Cd含量。图9和图10分别给出了是野生型毛状根和转基因毛状根在含100μM CdCl2的MS培养基中生长20d后的状态。
(2)将毛状根烘干后研磨成粉末，称取0.1g，与2ml硝酸混合于消解罐中室温静置12h，随后置于150℃的烘箱内加热2h，冷却至室温后用超纯水定容到50ml即可进行ICP-MS检测。转gshB基因龙葵毛状根与野生型龙葵毛状根Cd富集能力的测定结果如图11所示，从图中可以看出：转gshB基因毛状根中所能富集的Cd含量最高可达野生龙葵毛状根的2倍，说明转gshB基因龙葵毛状根具有更强的Cd富集能力，转入的gshB基因提高了龙葵毛状根对Cd富集的能力，后续可以将这一转基因毛状根再生成转基因龙葵植物应用于Cd污染土壤的修复。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京交通大学
<120> 转gshB基因提高龙葵毛状根Cd富集的方法
<130> JLC17I0154E
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工合成gshB-F引物
<400> 1
gctctagaat gatcaagctc ggcatc 26
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工合成gshB-R引物
<400> 2
cccccgggtt ctgctgctgt aaacgtgc 28
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成rolB-F引物
<400> 3
tactgcagca ggcttcatga c 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成rolB-R引物
<400> 4
gctttcccga ccagagactg 20

Claims (7)

1.一种转gshB基因提高龙葵毛状根Cd富集的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备龙葵外植体；
(2)制备转gshB基因侵染菌液：将gshB基因与真核表达载体PBI121-gfp连接，将连接产物用热激法转化发根农杆菌A4感受态细胞；涂平板，挑取阳性克隆，转入含有卡那抗性的YMA液体培养基扩增培养，得到转gshB基因侵染菌液；
(3)共培养诱导转gshB基因龙葵毛状根：将转gshB基因侵染菌液与龙葵外植体进行共培养；
(4)除菌培养：将共培养后的龙葵外植体转移到已湿润的滤纸上于28℃弱散射光培养2d，随后转入含有500mg/L的头孢噻肟钠的MS培养基上进行除菌培养，一周后转到不含头孢噻肟钠的MS固体培养基上，一个月后龙葵外植体愈伤处会长出的细长毛状根；
(5)毛状根液体培养基的扩大培养：将毛状根转入MS液体培养基中，扩大培养；
(6)转gshB基因龙葵毛状根的检测。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)所述扩增培养是在28℃，150-200rpm摇床中扩增至OD600＝0.6。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(6)所述转gshB基因龙葵毛状根的检测可以采用分子鉴定和荧光检测的方法。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述分子鉴定是通过提取毛状根的DNA，PCR法检测农杆菌Ri质粒中的rolB基因和PBI121-gshB-gfp融合基因，判断是否成功获得转gshB基因毛状根；所述荧光检测是通过绿色荧光蛋白检测，验证是否成功获得转gshB基因毛状根。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述荧光检测的荧光显微镜的参数是波长487nm、曝光时间583ms。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)所述龙葵外植体是通过取龙葵种子灭菌后接种于MS固体培养基，28℃光照培养，当龙葵无菌苗长出3到4对真叶后，剪取无菌叶片获得。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(5)所述扩大培养为28℃，100-110rpm摇床进行培养。
CN201710318093.6A 2017-05-08 2017-05-08 转gshB基因提高龙葵毛状根Cd富集的方法 Pending CN107099547A (zh)

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